DE68912115T2

DE68912115T2 - Ausscheidungsverfahren für die herstellung von thromboplastinreagenzien.

Info

Publication number: DE68912115T2
Application number: DE68912115T
Authority: DE
Inventors: Pamela Hawkins; James Maynard
Original assignee: Baxter Diagnostics Inc
Current assignee: Dade Behring Inc
Priority date: 1988-11-23
Filing date: 1989-11-03
Publication date: 1994-08-11
Anticipated expiration: 2009-11-04
Also published as: DK173090D0; WO1990005740A1; NO903261L; US5426031A; NO178578C; CA2002208A1; DK173090A; EP0396733B1; JPH03503534A; NO903261D0; JP3348228B2; NO178578B; DE68912115D1; CA2002208C; EP0396733A1; ATE99697T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Extraktion und Herstellung von Thromboplastin-Reagenzien. Hintergrund der Erfindung
Thromboplastin-Reagenzien aktivieren den exogenen Gerinnungsweg und bilden die Basis für den Prothrombinzeit-Test (PT-Test). Der PT-Test wird angewandt, um Blutgerinnungsfaktordefizienzen zu untersuchen und die orale Antikoagulantientherapie (z. B. mit Coumadin) zu überwachen. Reagenzien für PT-Tests umfassen Gewebsthromboplastin, auch als Gewebsfaktor bezeichnet, und Calciumionen als aktive Bestandteile, die mit geeigneten Pufferlösungen und Stabilisatoren verdünnt sind. Thromboplastin bildet mit Gerinnungsfaktor VII einen Komplex, um seine proteolytische Aktivität erheblich zu steigern.
Thromboplastin kann aus verschiedenen Geweben von verschiedenen tierischen Quellen stammen. Jedes Gewebe hat eine charakteristische Aktivität und Empfindlichkeit gegenüber Gerinnungsenzymen (d. h. Faktoren); diese Eigenschaften werden durch andere Bestandteile des Reagens moduliert. Die Thromboplastin-Empfindlichkeit ist definiert als die Verlängerung der Gerinnungszeiten sowohl von coumadinisiertem Plasma als auch von Plasma, das eine Defizienz an Gerinnungsfaktoren II, V, VII und X aufweist. Die Empfindlichkeit gegenüber coumadinisiertem Plasma wird bestimmt durch Bestimmen des Verhältnisses einer abnormalen Plasmaprobe zu einer normalen Plasmaprobe. "Coumadin" ist ein Warenzeichen für Warfarin-Natriumsalz.
Derzeit stammen die empfindlichsten Thromboplastin-Reagenzien von Humangehirn und -placenta. Die begrenzte Verfügbarkeit dieser Substanzen, ihre Kosten und das Potential für eine HIV-Viruskontaminierung begrenzen ihre universelle Akzeptanz. Von Kaninchengehirn, der häufigsten Quelle, stammende Thromboplastine haben charakteristisch eine relativ geringe Empfindlichkeit im Vergleich mit Thromboplastinen, die aus Humangeweben stammen. Die Quelle des Thromboplastins, das Verfahren zur Extraktion des Thromboplastins und die Reagenszusammensetzung sind sämtlich wichtige Parameter bei der Bestimmung der Empfindlichkeit des Reagens. Änderungen der Zusammensetzung von PT-Reagenzien können ebenfalls genutzt werden, um die Stabilität zu verbessern und Gerinnungszeiten von Plasmaproben normaler Personen einzustellen.
Historisch wird Thromboplastin aus Geweben extrahiert durch Erwärmen des Gewebes in Wasser oder Kochsalzlösungen. Thromboplastin-Reagenzien, die von Baxter Healthcare Corporation, Dade Division, hegestellt werden, enthalten Thromboplastine, die in Salz-Tartratlösungen extrahiert sind (US-PS 3 522 148 - 25. Juli 1970). Diese Extrakte werden zentrifugiert, um große Partikel abzuscheiden. Die Thromboplastinextrakt- Überschicht enthält das aktive Thromboplastin zusammen mit dem Natriumchlorid und Natriumtartrat aus dem Extraktionsfluid. Bei Thromboplastin C wird der Thromboplastinextrakt einer Lösung zugesetzt, die Calciumlactat, Natriumchlorid, Natriumtartrat, Glycin und Carboxymethylcellulose enthält. Die Endkonzentration des Extrakts ist 25 % des rekonstituierten Endvolumens.
Bei Thromboplastin FS wird der Thromboplastinextrakt einer Lösung zugesetzt, die Imidazol, Calciumlactat, Natriumchlorid, Natriumtartrat, Glycin und Carboxymethylcellulose enthält. Da die Endkonzentration des Extrakts 50 % des rekonstituierten Endvolumens ist, hat Thromboplastin FS (TPES), hergestellt von Baxter Healthcare Corporation, Dade Division, eine relativ hohe Konzentration an Kaninchengehirnextrakt. Zwar ist es empfindlicher als andere Kaninchengehirn-Thromboplastine, aber die PT-Werte im Normalbereich sind länger als erwünscht, die Trübung ist erheblich, und die Stabilität ist nicht optimal.
Boehringer Mannheim hat ein Verfahren entwickelt, um Thromboplastin aus Kaninchengehirn empfindlicher zu machen (EP-A-0 083 773). Dabei wird pulverisiertes Kaninchengehirn mit gleichen Teilen pulverisierter Cellulose vermischt und mit Natriumacetatpuffer bei pH 6,5-8 gewaschen, um Verunreinigungen wie Hämoglobin zu entfernen. Der Gehirnrückstand wird dann mit oberflächenaktiven Mitteln wie etwa Natriumdesoxycholat in Gegenwart von Calciumionen extrahiert. Der Schlüsselbestandteil, der bei dem Verfahren von Boehringer Mannheim angegeben ist, sind Calciumionen, und erforderlichenfalls wird ein oberflächenaktives Mittel bzw. Tensid eingesetzt. Der Einsatz von Bariumsulfat wird in dem Patent von Boehringer Mannheim zwar erörtert, jedoch als ungeeignet angesehen: "Nach unseren eigenen Erfahrungen erfolgt eine weitgehende Mitfällung des Thromboplastins mit dem Bariumsulfat." Bei herkömmlichen Verfahren resultiert die relative Unempfindlichkeit von Thromboplastinen teilweise aus der Anwesenheit von Gerinnungsfaktor VII, der eng an das Thromboplastin gebunden ist. Bariumsulfat wird üblicherweise als Adsorptionsmittel eingesetzt, um von Vitamin K abhängige Gerinnungsproteine wie etwa die Faktoren II, VII, IX und X zu entfernen. Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung gibt ein Verfahren zur Extraktion von Thromboplastinen gemäß dem Patentanspruch 1 an. Die Erfindung verwendet verschiedene Kombinationen von nichtionischen Detergenzien wie etwa Triton X-l00, chaotrope Ionen wie Thiocyanat, Iodid, Guanidin und Perchlorat, und setzt Bariumsulfat ein, um Thromboplastin aus einer Gewebsquelle zu extrahieren. Nichtionische Detergenzien erhöhen den Wirkungsgrad beim Entfernen der an das Thromboplastin gebundenen Gerinnungsfaktoren ganz erheblich. Das hier beschriebene Vorgehen bietet den Vorteil einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber Faktordefizienzen und Coudamin-Therapie, während gleichzeitig ein relativ kurzer normaler PT-Bereich erhalten bleibt. Eine vom CAP Hematology Resource Committee 1978 durchgeführte Untersuchung zeigte, daß der normale PT-Bereich 9-15 s bei 96 % der teilnehmenden Labors lag (D.A. Triplett: "How the Prothrombin Time Actually is Performed" in Standardization of Coagulation Assays: An Overview, herausgeg. von D.A. Triplett, College of American pathologists, Skokie, 1982, S. 113-119). Der bevorzugte PT-Bereich für normale Spender ist 10-14 s. Reagenzien, die unter Anwendung der hier beschriebenen Methoden hergestellt sind, haben erhöhte rekonstituierte Stabilität gegenüber Thromboplastin FS, verwenden weniger Gehirnextrakt und sind optisch weniger dicht. Die Erfindung ermöglicht die Einstellung der Empfindlichkeit für eine Faktor-VII-Defizienz aufweisendes Plasma unter Einsatz von unempfindlichen Thromboplastin-Reagenzien auf jede PT-Zeit; die bevorzugte PT-Zeit für eine Faktor-VII-Defizienz aufweisendes Plasma ist größer als 60 s. Das Thromboplastin-Reagens der Erfindung hat ein Verhältnis der abnormalen Kontrolle (COL2) zu der normalen Kontrolle (COL1) von größer als 1,8, bevorzugt liegt das Verhältnis aber im Bereich von 1,8-3,0.
Alternativ wird eine starke Erhöhung der Empfindlichkeit durch chaotrope Ionen wie Thiocyanat, Guanidin oder Iodid erreicht, die alleine in dem Extraktionsfluid eingesetzt werden. Chaotrope Ionen sind Mittel, die beim Aufbrechen von Membranen und Enzymkomplexen eingesetzt werden und nichtkovalente Kräfte brechen (W. Hanstein, Destabilization of Membranes with Chaotropic Ions, Meth. Enzy. XXXI (1974)). Chaotrope Ionen haben charakteristisch eine geringe Ladungsdichte mit großem Radius. Normalerweise eingesetzte Ionen umfassen die folgenden: Tribromacetat, Trichloracetat, Guanidin, Thiocyanat, Iodid, Perchlorat, Dichloracetat, Nitrat, Bromid, Trifluoracetat und Chloracetat. Genaue Beschreibung und beste Art der Durchführung
Gewebe wie acetondehydratisiertes pulverisiertes Kaninchengehirn wird mit einer Kombination aus Bariumsulfat, nichtionischen Detergenzien und chaotropen Ionen wie Thiocyanat, Iodid, Guanidin oder Perchlorat extrahiert, um die Reagenseigenschaften zu steuern. Die Erfindung sollte für alle Thromboplastine brauchbar sein und verbessert die Empfindlichkeit bei allen Tests auf PT-Basis und dafür spezifischen Assays.
PT-Werte können bestimmt werden unter Verwendung von automatischen Gerinnungs-Analysatoren wie dem MLA Electra 800, mechanischen Instrumenten wie Fibrometern oder durch manuelle Techniken. Das abnormale Plasma für diese Untersuchungen war entweder eine abnormale Kontrolle wie Ci-Trol Level II (COL2) von Baxter Healthcare Corporation, Dade Division, oder gefriergetrocknetes coumadinisiertes Plasma (LAC) für eine Antikoagulans-Kontrolle. Ci-Trol Level I (COL1) oder ein Pool von frischem normalem Zitratplasma (FNP) wurde verwendet, um normale PT-Werte zu bestimmen. Die Empfindlichkeit für Faktordefizienz wird bestimmt durch Messen der PT-Zeit eines Plasmas mit Faktor-VII-Defizienz (CF7) Kaninchengehirn-Thromboplastine, die in den Vereinigten Staaten verfügbar sind (Dade Thromboplastin C), ergeben Verhältnisse von 1,5 für COL2/COL1 und eine PT-Zeit von 28-30 s für Plasma mit Faktor-VII-Defizienz auf dem MLA Electra 800. Beispiel I: Allgemein angewandtes Verfahren zur Herstellung von Thromboplastinen
Um das Thromboplastin-Reagens herzustellen, wird pulverisiertes Kaninchengehirn (50 mg) in einem Extraktionsfluid (1000 ml) extrahiert, das Natriumchlorid (30-180 mM), ein nichtionisches Detergens wie Triton X-100 (0,01-0,25 %) und ein chaotropes Ion wie etwa Natriumthiocyanat (5-100 mM) enthält. Alternativ kann das Extraktionsfluid nur Natriumchlorid (0-150 mM) und das chaotrope Ion (5-100 mM) enthalten. Bariumsulfatpulver wird dem Extraktionsfluid mit 0,1-1,0 g/g pulverisiertes Gehirn zugesetzt. Die Extraktion wird bei 43-47 ºC für 15 min durchgeführt; das Extraktionsgemisch wird dann für 10 min mit 2500 U/min zentrifugiert, um das Bariumsulfat und große Partikel zu entfernen. Der Extrakt wird einer Base zugesetzt, die Calciumionen (7-14 mM), Natriumchlorid (70-150 mM), Puffer und Stabilisatoren enthält. Dann wird das Produkt gefriergetrocknet. Beispiel II: Die Auswirkung von Triton X-100 und Bariumsulfat bei der Extraktion auf die Thromboplastinempfindlichkeit
Aceton-dehydratisiertes pulverisiertes Kaninchengehirn (1 g) wurde in 20 ml 0,63 % Natriumchlorid (NaCl), das 0,6 g Bariumsulfat (BaSO&sub4;) und 0-0,25 % Triton X-100 (Rohm & Haas, Philadelphia, PA) enthielt, für 15 min bei 45 ºC extrahiert; das Extraktionsgemisch wurde dann für 10 min mit 2500 U/min zentrifugiert, um das Bariumsulfat und große Partikel zu entfernen. Der Extrakt wurde einer Base mit einer Endkonzentration von 32 % in 30 mM (TAPSO) Puffer, 5 % Glycin, 0,6 % Polyethylenglykol (PEG) mit einem Molekulargewicht von 8000, 13,7 mM Calciumchlorid (CaCl&sub2;), 100 mM NaCl, pH 7,0 zugesetzt. Die Prothrombinzeiten (PT) in Sekunden wurden unter Verwendung eines MLA Electra 800 aufgezeichnet. (Medical Laboratory Automation, Pleasantville, New York).
Sowohl das Verhältnis COL2/COL1 als auch die PT-Zeit von Plasma mit Faktor-VII-Defizienz (CF7) erhöhen sich mit steigender Detergensmenge (Tabelle I). TABELLE I Auswirkung von Triton X-100 und Bariumsulfat bei der Extraktion auf die Thromboplastin-Masse (MLA-800): Mittelwert aus DoppelbestimmungBaseformulierung:
30 mM TAPSO, 5 % Glycin, 0,6 % PEG, 13,7 mM CaCl&sub2;, 100 mM NaCl, 32 % Extrakt, pH 7,0
Gehirn extrahiert in 0,63 % NaCl und Detergens mit Bariumsulfat 0,6 g/g Gehirn in 20 ml Extraktionsfluid Beispiel III: Auswirkung von Natriumthiocyanat (NaSCN) bei der Extraktion auf die Thromboplastin-Empfindlichkeit
Aceton-dehydratisiertes pulverisiertes Kaninchengehirn (1 g) wurde in 20 ml 0,63 % Natriumchlorid (NaCl), das - wenn nichts anderes angegeben ist - 0 (Kontrolle), 10, 50 und 100 mM NaSCN enthielt, für 15 min bei 45 ºC extrahiert; eine Probe, die 100 mM NaSCN ohne NaCl enthielt, wurde ebenfalls ausgewertet. Bariumsulfat wurde bei diesem Experiment nicht eingesetzt. Das Extraktionsgemisch wurde wie in Beispiel 1 beschrieben zentrifugiert. Die Prothrombinzeiten (PT-Zeiten) in Sekunden wurden unter Verwendung eines MLA Electra 800 aufgezeichnet.
Sowohl das Verhältnis COL2/COL1 als auch die PT-Zeit von Plasma mit Faktor-VII-Defizienz (CF7) erhöhen sich beträchtlich mit zunehmender Menge von NaSCN (Tabelle II). Natriumthiocyanat alleine erhöhte die Thromboplastin-Empfindlichkeit. TABELLE II Auswirkung von Natriumthiocyanat (NaSCN) bei der Extraktion auf die Thromboplastin-Masse (MLA-800)Baseformulierung:
30 mM TAPSO, 5 % Glycin, 0,6 % PEG, 13,7 mM CaCl&sub2;, 100 mM NaCl, 32 % Extrakt, pH 7,0 Beispiel IV: Vergleich verschiedener Zuammensetzungen von Extraktionsfluiden und des Extraktprozentanteils auf die Thromboplastin-Empfindlichkeit
Pulverisiertes Kaninchengehirn wurde in Extraktionsfluiden extrahiert, die zwei verschiedene Zusammensetzungen von NaCl, Triton X-100, NaSNC und Bariumsulfat enthielten. In der Tabelle III enthielt Extrakt E 130 mM NaCl, 50 mM NaSCN, 0,05 % Triton X-100 und 0,3 g Bariumsulfat/g pulverisiertes Gehirn; Extrakt N enthielt 50 mM NaCl, 10 mM NaSCN, 0,02 % Triton X-100 und 0,4 g Bariumsulfat/g pulverisiertes Gehirn. Das pulverisierte Gehirn wurde extrahiert, zentrifugiert, und die Extrakte wurden einer Base auf die Endkonzentrationen von 32 % oder 50 % wie in Beispiel I beschrieben zugefügt. Die Prothrombinzeiten (PT-Zeiten) in Sekunden wurden unter Verwendung eines MLA Electra 800 aufgezeichnet.
Die Tabelle III zeigt, daß die Bestandteile der Extraktionsfluide und die Extraktmenge stark verschieden sein können, um Thromboplastine mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber Kaninchengehirn-Thromboplastinen wie etwa Dade Thromboplastin C (Verhältnis COL2/COL1 = 1,5) zu ergeben. TABELLE III Vergleich verschiedener Zusammensetzungen von Extraktionsfluiden und des Extraktprozentanteils auf die Thromboplastin-Masse (MLA-800)Baseformulierung:
30 mM TAPSO, 5 % Glycin, 0,6 % PEG, 13,7 mM CaCl&sub2;, 100 mM NaCl, pH 7,0 Extrakt E:
Pulverisiertes Gehirn extrahiert in 130 mM NaCl, 50 mM NaSCN, 0,05 % Triton X-100, 0,3 g Bariumsulfat/g pulverisiertes Gehirn Extrakt N:
Pulverisiertes Gehirn extrahiert in 50 mM NaCl, 10 mM NaSCN, 0,02 % Triton X-100, 0,4 g Bariumsulfat/g pulverisiertes Gehirn Beispiel V: Vergleich verschiedener Formulierungen von empfindlichen Thromboplastinen
Aceton-dehydratisiertes pulverisiertes Kaninchengehirn wurde in einer Lösung extrahiert, die 50 mM NaCl, 10 mM NaSCN, 0,02 % Triton X-100 und 0,4 g Bariumsulfat/g pulverisiertes Gehirn enthielt. Die Extrakte wurden Basen für zwei verschiedene Formulierungen zugegeben: Formulierung D enthielt 35 % Extrakt in 40 mM Bicine-Puffer, 5,25 % Glycin, 0,6 % PEG, 10 mM CaCl&sub2;, 134 mM NaCl, pH 7,1; Formulierung T enthielt 36 % Extrakt in 80 mM TAPSO, 5,25 Glycin, 0,6 % PEG, 10 mM CaCl&sub2;, 118 mM NaCl, pH 7,4. Beide Formulierungen wurden gefriergetrocknet. Nach der Rekonstituierung wurde die PT-Zeit in Sekunden mit einem MLA Electra 800 aufgezeichnet.
Die Tabelle IV zeigt, daß die Zusammensetzung der Formulierung sehr verschieden sein kann, um Thromboplastine mit erhöhter Empfindlichkeit und anderen Eigenschaften zu erhalten, die Thromboplastin FS, das ein relativ empfindliches Kaninchengehirn-Thromboplastin ist, überlegen sind. TABELLE IV Vergleich verschiedener Formulierungen von empfindlicher Thromboplastin-Menge (MLA-800)Extraktgemisch:
Pulverisiertes Gehirn extrahiert in 50 mM NaCl, 10 mM NaSCN, 0,02 % Triton X-100, 0,4 g Bariumsulfat/g pulverisiertes Gehirn Formulierung D:
40 mM Bicine, 5,25 % Glycin, 0,6 % PEG, 10 mM CaCl&sub2;, 134 mM NaCl, pH 7,1 Formulierung T:
80 mM TAPSO, 5,25 % Glycin, 0,6 % PEG, 10 mM CaCl&sub2;, 118 mM NaCl, pH 7,4 Beispiel VI: Herstellung von Thromboplastinen mit einer Empfindlichkeit, die für die in den USA verkauften typisch ist
Aceton-dehydratisiertes pulverisiertes Kaninchengehirn wurde in einer Lösung extrahiert, die 50 mM NaCl, 10 mM NaSCN, 0,02 % Triton X-100 und 0,4 g Bariumsulfat/g pulverisiertes Gehirn enthielt. Das pulverisierte Gehirn wurde wie in Beispiel I beschrieben extrahiert. Die Extrakte wurden Basen für drei verschiedene Formulierungen zugegeben: Formulierung E enthielt 10 % Extrakt in 53 mM TAPSO Puffer, 4,00 % Glycin, 0,3 % PEG, 11 mM CaCl&sub2;, 50 mM NaCl, pH 7,4; Formulierung F enthielt 12 % Extrakt in 50 mM TAPSO Puffer, 4,00 % Glycin, 0,3 % PEG, 11 mM CaCl&sub2;, 50 mM NaCl, pH 7,4; Formulierung G enthielt 10 % Extrakt in 53 mM TAPSO Puffer, 4,00 % Glycin, 0,3 % PEG, 11 mM CaCl&sub2;, 65 mM NaCl, pH 7,4. Die Formulierungen wurden gefriergetrocknet. Nach der Rekonstituierung wurden PT-Zeiten in Sekunden auf einem MLA Electra 800 aufgezeichnet.
Die Tabelle V zeigt, daß die hier beschriebenen Extraktionsfluide verwendbar sind, um herkömmliche Kaninchengehirn- Thromboplastine, die in den USA erhältlich sind, gleichartig wie Thromboplastin C zu machen. Relativ geringe Mengen Extrakt (10-12 % gegenüber 25 % bei Thromboplastin C) sind erforderlich, um ein Thromboplastin herzustellen, das ein kleineres COL2/COL1-Verhältnis und LAC/FNP-Verhältnis hat. Die Empfindlichkeit für Faktor VII wird jedoch erhöht. TABELLE V Extraktgemisch:
Pulverisiertes Gehirn extrahiert in 50 mM NaCl, 10 mM NaSCN, 0,02 % Triton X-100, 0,4 g Bariumsulfat/g pulverisiertes Gehirn Formulierung E:
10 % Extrakt, 53 mM TAPSO, 4,00 % Glycin, 0,3 % PEG, 11 mM CaCl&sub2;, 50 mM NaCl, pH 7,4 Formulierung F:
12 % Extrakt, 50 mM TAPSO, 4,00 % Glycin, 0,3 % PEG, 11 mM CaCl&sub2;, 50 mM NaCl, pH 7,4 Formulierung G:
12 % Extrakt, 50 nM TAPSO, 4,00 % Glycin, 0,3 % PEG, 11 mM CaCl&sub2;, 65 mM NaCl, pH 7,4 Varianten oder Äquivalente der Erfindung
Verhalten und Empfindlichkeit eines PT-Reagens sind das Ergebnis von Wechselwirkungen zwischen sämtlichen Bestandteilen des Reagens. Im allgemeinen erhöht sich durch Änderungen der Formulierungen, die die Empfindlichkeit steigern, auch der Wert der normalen PT-Zeit. Bei der Erfindung sind die Bestandteile des Extraktionsfluids sorgfältig im Hinblick auf die beste normale PT-Zeit und Empfindlichkeit abgewogen. Außerdem beeinflussen die Einzelbestandteile des Extraktionsgemischs das Reagensverhalten auf bestimmte Weise. Änderungen der Konzentrationen der verschiedenen Bestandteile ändern auch die Eigenschaften des hergestellten Extrakts; daher können Extrakte mit verschiedenen Eigenschaften in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Extraktionsfluids hergestellt werden.
Bariumsulfat und irgendein nichtionisches Detergens wie etwa Triton X-100, Brij-35, Nonidet P40, FSN und Tergiton bewirken eine starke Erhöhung der Empfindlichkeit, insbesondere für spezifische Gerinnungsfaktor-Defizienzen wie etwa Faktor-VII-Defizienz. Chaotrope Ionen (Thiocyanat, Guanidin, Iodid, perchlorat) alleine in dem Extraktionsfluid erhöhen die Empfindlichkeit sowohl gegenüber Proben von coumadinisierten Patienten als auch spezifischen Faktordefizienzen wie etwa Faktor-VII-Defizienz. Um das Thromboplastin-Reagens herzustellen, wird das Gewebe in einem Extraktionsfluid extrahiert, das Natriumchlorid (30-180 mM), das nichtionische Detergens (0,01-0,25 %) und das chaotrope Ion wie Thiocyanat, Guanidin, Iodid und Perchlorat (5-100 mM) enthält. Bariumsulfatpulver wird dem Extraktionsfluid mit 0,1-1,0 g/g pulverisiertes Gehirn zugegeben. Alternativ kann das Extraktionsfluid nur Natriumchlorid (0-150 mM) und Natriumthiocyanat (5-100 mM) enthalten. Die Extraktion wird bei 43-47 ºC für 15 min durchgeführt; das Extraktionsgemisch wird dann für 10 min mit 2500 U/min zentrifugiert, um das Bariumsulfat und große Partikel zu entfernen. Der Extrakt wird einer Base zugegeben, die Calciumionen (7-14 mM), Natriumchlorid (70-150 mM), Puffer und Stabilisatoren enthält. Die Puffer und Stabilisatoren können verändert werden, um auch die Stabilität des Produkts zu verbessern.
Das Extraktionsverfahren und die -komponenten können mit jeder Quelle von Thromboplastin enthaltendem Gewebe angewandt werden, etwa Kaninchengehirn und -lunge, Rindergehirn und -lunge und Humangehirn, -lunge und -placenta.
1. Verfahren zur Extraktion von Thromboplastinen, das folgende Schritte aufweist:
(a) In-Kontakt-Bringen von Thromboplastin enthaltendem Gewebe mit einer wirksamen Menge von Extraktionsfluid unter Bedingungen, die in der Extraktion von Thromboplastin resultieren, und
(b) Trennen des extrahierten Thromboplastins von dem verarmten Gewebe,
dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsfluid aufweist:
i) chaotrope Ionen oder
ii) nichtionisches Detergens, Bariumsulfat und ein Salz.
2. Verfahren nach Anspruch 1,wobei das Extraktionsfluid aufweist: chaotrope Ionen zusammen mit einem Salz; oder chaotrope Ionen zusammen mit einem Salz, einem nichtionischen Detergens und Bariumsulfat; oder chaotrope Ionen zusammen mit einem Salz und Bariumsulfat.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die wirksame Menge des Extraktionsfluids ca. 100 ml pro 5 g Gewebe ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Konzentration des chaotropen Ions ca. 5-100 mM ist.
5 Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Konzentration des chaotropen Ions ca. 10-100 mM ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nichtionische Detergens bei ca. 0,01-0,25 % liegt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des Salzes im Bereich von ca. 30-180 mM liegt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die wirksame Menge von Bariumsulfat ca. 0,1-1,0 g/g Thromboplastin enthaltendem Gewebe ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Extraktion bei 43-47 ºC für ca. 15 min durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gewebe pulverisiertes Kaninchengehirn ist.
11. Extrahierte Thromboplastinzusammensetzung, die annähernd normale Prothrombinzeiten, die in dem Bereich von ca. 9-15 s liegen, und eine Empfindlichkeit gegenüber Gerinnungsfaktormängeln von mehr als 60 s sowie eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Coumadin-Therapie hat, wobei das Thromboplastin durch das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellt ist.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Coumadin-Therapie, die durch das COL2/COL1-Verhältnis gezeigt ist, im Bereich von ca. 1,8 bis 3,0 liegt.