DE69016858T2

DE69016858T2 - Verfahren und Reagenziensatz zur Bestimmung der funktionalen Aktivität von Protein S in menschlichem Plasma.

Info

Publication number: DE69016858T2
Application number: DE69016858T
Authority: DE
Inventors: Antonio Lombardi; Luigi Preda
Original assignee: Instrumentation Laboratory SpA
Current assignee: Instrumentation Laboratory SpA
Priority date: 1989-07-07
Filing date: 1990-07-02
Publication date: 1995-06-08
Anticipated expiration: 2010-07-03
Also published as: CA2019872C; EP0406971B1; EP0406971A1; IT1230744B; DE69016858D1; IT8921128A0; CA2019872A1; ES2068325T3; JPH03216199A; JPH0740959B2; US5147805A

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bei Protein S handelt es sich um ein vitamin-K-abhängiges Plasmaprotein. Es ist seit 1977 bekannt. Ursprünglich wurde Protein S keine Funktion zugeschrieben, erst in jüngster Zeit wurden Vermutungen über seine Rolle bezüglich der Manifestierung der gerinnungshemmenden Wirkung von aktiviertem Protein C geäußert.
Protein C ist ein Protein des Prothrombinkomplexes, dessen Funktion darin besteht, die enzymatische Kaskade der Plasmagerinnung auf der Faktor-V- und Faktor-VIII-Ebene zu inhibieren.
In Thrombosis Research 12, 455-466 (1978) und Thrombosis and Haemostasis 46, 684-686 (1981) werden Verfahren zur Reduzierung der Prothrombinzeit und in FR-A-2.571.497 wird ein Gerät zur Messung der Blutgerinnungszeit offenbart.
In klinischen Studien konnte auch nachgewiesen werden, daß Patienten mit angeborenem Protein-C-Mangel zu häufigen Thromboserezidiven neigen. In-vitro-Studien haben gezeigt, daß Protein-S als Co-Faktor für aktiviertes Protein C wirkt (siehe auch beispielsweise Thrombosis Research 49, 241-251 (1988)). Diese Studien lassen somit darauf schließen, daß Protein S eine wesentliche Rolle bei der Manifestierung der gerinnungshemmenden Wirkungen von aktiviertem Protein C zukommt.
Da Protein S zur optimalen Ausbildung der gerinnungshemmenden Wirkung von aktiviertem Protein C nötig ist, wurde angenommen, daß bei Personen mit Protein-S-Mangel eine Neigung zu thrombotischen Erkrankungen entstehen kann.
Deshalb ist die Bestimmung von Protein S im Plasma von außerordentlichem Interesse, weil ein stärker oder weniger stark ausgeprägter Mangel einen Thromboserisikofaktor darstellt.
Im Humanplasma bildet Protein S einen äquimolaren Komplex mit einem weiteren Plasmaprotein, und zwar mit C4b-BP.
Im Gleichgewicht unter physiologischen Bedingungen existiert das Protein S in zwei Formen, und zwar als an das C4b- BP gebundenes Protein S (60 %) und als freies Protein S. Allein in der Form von freiem Protein S zeigt es die biologische Funktion eines Co-Faktors für aktiviertes Protein C.
Die bisher vorgeschlagenen Verfahren zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Protein S umfassen im wesentlichen die folgenden nacheinander ablaufenden Schritte:
- Mischen der zu untersuchenden Probe, entweder unverdünnt oder in geeigneter Weise verdünnt, mit dem durch einen Mangel an Protein S charakterisierten Plasma;
- Zugabe einer optimalen Menge an aktiviertem Protein C oder PROTAC zur Aktivierung des Proteins C des durch Mangel charakterisierten Plasmas;
- Zugabe einer optimalen Menge an Phospholipiden und, falls erforderlich, an aktiviertem Faktor;
- Zugabe von CaCl&sub2; als ein die Gerinnungsreaktion in Gang setzendes Reagens;
- Bewertung der Protein-S-Aktivität in der Probe durch Angabe derselben in Form einer Prozentzahl, die mit Hilfe einer Eichkurve ermittelt wurde, wobei für die Konstruktion letzterer gepooltes Plasma von Gesunden verwendet wurde, bei dem für die Protein-S-Aktivität der Wert 100 % angesetzt wurde.
Funktionstests zur Messung der Protein-S-Aktivität im Plasma sind beispielsweise in "Thrombosis Research", Bd. 48, 427-437, 1987 (P. van de Waart et al.) u. a. a. O., Bd. 49, 241-251, 1988 (K. Suzuki et al.); in "Blood", Bd. 67, 406-410, 1986, und in "J. Clin. Invest.", Bd. 81, 1445-1454, 1988, sowie Bd. 74, 2082-2086, 1984, beschrieben.
Diese Tests beruhen deshalb auf dem Vermögen von Protein S, als Co-Faktor für die Gerinnungshemmung von aktiviertem Protein C zu wirken. Die durch aktiviertes Protein C bewirkte Verlängerung der Gerinnungszeit ist vom Gehalt an Protein S im Plasma der Probe abhängig.
Mit der vorliegenden Erfindung soll ein Verfahren zur Bestimmung der funktionalen Aktivität von Protein S zur Verfügung gestellt werden, das die Anwendung von weitgehend unkomplizierten Techniken in herkömmlichen analytischen Laboratorien bei annehmbarem Kostenaufwand sowie eine größere Genauigkeit und höhere Wiederholbarkeit als bei den zuvor vorgeschlagenen Verfahren ermöglicht.

Zusammenfassung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Protein S in einer Humanplasmaprobe umfaßt demzufolge die Zugabe einer Plasmaprobe zu einem aktivierten Substratplasma und das Messen eines auf die Zeit, in der die Gerinnungsreaktion abläuft, bezogenen Parameters.
Mit anderen Worten, es wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Protein S in einer Humanplasmaprobe zur Verfügung gestellt, zu dem das Zumischen eines durch einen Protein-C-Aktivator aktivierten Protein-S-Minus-Plasmas zu der Plasmaprobe, anschließend das Zumischen von Rinderthromboplastin zu dem Gemisch zur Ingangsetzung einer Gerinnungsreaktion und das Messen eines auf die Zeit, in der die Gerinnungsreaktion abläuft, bezogenen Parameters gehören.
Von der vorliegenden Erfindung wird zudem ein Kit zur Bestimmung der Aktivität von Protein S in einer Humanplasmaprobe zur Verfügung gestellt, zu dem folgendes gehört:
a) ein erstes Reagens, bei dem es sich um durch Protein-S-Mangel charakterisiertes Humanplasma handelt,
b) ein zweites Reagens, das einen Protein-C-Aktivator enthält, und
c) ein drittes Reagens, das Rinderthromboplastin enthält.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Zur genaueren Darlegung der Grundprinzipien der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend ein Beispiel für die mögliche Vorgehensweise bei der Bestimmung der Aktivität von Protein S in Humanplasma beschrieben.
Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren kann das durch Protein-S-Mangel charakterisierte Plasma, mit dem nach der Aktivierung die zu untersuchende Probe gemischt wird, mittels eines beliebigen bekannten Verfahrens unter der Bedingung gewonnen werden, daß die Aktivität des freien Proteins S bei weniger als 1 % liegt.
Dabei ist in dieser Beschreibung unter dem durch Protein- S-Mangel charakterisierten Plasma ein Plasma mit einer sehr niedrigen Aktivität von freiem Protein S, die vorzugsweise unter 1 % liegt, zu verstehen, das auf herkömmliche Weise durch Immunadsorptionsverfahren unter Einsatz von Anti- Protein-S-Antikörpern (mono- oder polyklonal) gewonnen wird. Zur Herstellung des aktivierten Substratplasmas für den Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren wird das durch Protein- S-Mangel charakterisierte Plasma mit einem Protein-C-Aktivator gemischt, der eine beliebige Substanz sein kann, die diese Funktion erfüllt; PROTAC, d.h. eine oder mehrere gereinigte Fraktionen vom Gift der Agkistrodon contortrix, hat sich beispielsweise als besonders geeignet erwiesen und zeichnet sich zudem durch Einfachheit aus.
Die Aktivierung kann aber auch in der heterogenen Phase erfolgen, indem das durch Mangel charakterisierte Plasma, das aktiviert werden soll, einem inerten Träger oder einem unlöslichen Medium, an das der Aktivator gebunden ist, zugesetzt oder mit dem es in Kontakt gebracht wird. Bei dem Aktivator kann es sich um eine oder mehrere gereinigte Fraktionen vom Gift der Agkistrodon contortrix oder um Human- oder Rinderthrombin handeln.
In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel für das erfindungsgemäße Verfahren wurde PROTAC (1,5 Einheiten/ml) in einem Verhältnis von 1 Teil PROTAC auf 2 Teile des durch Protein-S-Mangel charakterisierten Plasmas eingesetzt.
Das Gemisch aus dem durch Protein-S-Mangel charakterisierten Plasma und PROTAC (das als aktiviertes Substratplasma dient) sollte vorzugsweise ca. 15 Minuten nach der Zubereitung verwendet werden, wenn die Aktivierung hoch ist.
Zudem sollte es vorzugsweise innerhalb von 60 Minuten zur Anwendung kommen. In diesem Zeitraum ist die Abnahme der Aktivierung von Protein C vernachlässigbar klein, wobei diese Abnahme auf die Anwesenheit des physiologischen Inhibitors für aktiviertes Protein C in dem durch Mangel an Protein S charakterisierten Plasma zurückzuführen ist.
Zur erfindungsgemäßen Bestimmung ist es zunächst erforderlich, die Eichkurve zu konstruieren, mit der die Ergebnisse der Untersuchungen an Humanplasmaproben zu vergleichen sind.
Zu diesem Zweck werden Standards zubereitet, wozu Gemische aus gepooltem Human-Plasma von Gesunden und aus Plasma mit Protein-S-Mangel hergestellt werden, wobei der Anteil des letzteren im Bereich zwischen 0 und 100 % der zwei Komponenten variiert. Jeder Standard wird im Verhältnis 1:10 verdünnt, und dabei wird eine NaCl-Lösung (100 mmol) verwendet (in dieser Einfügung fehlt im Original das Prädikat - Anm. d. Übersetzers), und der verdünnte Standard wird dem aktivierten Substratplasma im Verhältnis 1:1 zugesetzt.
Rinderthromboplastin mit zugesetztem Calcium wird dem Gemisch des Standards im aktivierten Substratplasma in einer solchen Menge hinzugefügt, daß dieses Gemisch in einem Zeitraum von mindestens 60 Sekunden gerinnt. Bei dem verwendeten Thromboplastin handelt es sich wie üblich um eine wäßrige Suspension von Gewebeextrakt.
Für die Untersuchungen sind beispielsweise folgende Mengen der verschiedenen Reagenzien einsetzbar:
Aktiviertes Substratplasma 40 ul
Probe (d.h. Standard) 40 ul
Rinderthromboplastin 80 ul
Anschließend wird für jeden Standard die Prothrombinzeit (bekannt als PZ, ein allgemein bekannter Gerinnungsparameter, der vorzugsweise in einer Küvette eines Rotors [sic] in dem Meßgerät gemessen wird, das im US-Patent 4,777,141 von Calzi et. al., 11. Oktober 1988, beschrieben ist) bestimmt, um die Eichkurve konstruieren zu können.
Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren werden die zu untersuchenden Plasmaproben der gleichen Behandlung unterzogen, wie sie für die Standards beschrieben ist, wobei auch die gleichen Verdünnungswerte vorgesehen sind. Die Bewertung der Aktivität von Protein S erfolgt durch Vergleich der erzielten Ergebnisse mit einer Eichkurve.
Es muß darauf hingewiesen werden, daß die erfindungsgemäße Verwendung von Rinderthromboplastin mit zugesetztem Calcium eine Analysemethode ergibt, die sich im Gegensatz zu den Fällen, in denen Thromboplastin anderer Herkunft wie beispielsweise Human- oder Kaninchenthromboplastin verwendet wird, durch eine überraschend gute Empfindlichkeit auszeichnet. So betrugen die Unterschiede in der PZ bei Verwendung von Rinderthromboplastin mit zugesetztem Calcium in den Fällen, in denen beispielsweise Messungen an Standards mit Endkonzentrationen 0 und 100 % durchgeführt wurden, ca. 50 Sekunden. Im Falle der Verwendung von Thromboplastin anderer Herkunft beliefen sich die Unterschiede in der PZ entsprechend nur auf einen Bruchteil dieses Zeitraums, beispielsweise auf wenige Sekunden. Eine erhöhte Empfindlichkeit und Wiederholbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens sind somit bei Verwendung von Rinderthromboplastin mit zugesetztem Calcium offensichtlich. Diese Empfindlichkeit ist unmittelbar aus der hier beigefügten Figur ersichtlich, die das Verhalten der verschiedenen Thromboplastine veranschaulicht. In der graphischen Darstellung sind auf der Ordinate die PZ für unterschiedliche Standards abgetragen, auf der Abszisse deren Gehalte an gepooltem Human-Plasma von Gesunden im Bereich von 0 bis 100 %. Kurve a) ist die Darstellung der Werte, die bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Rinderthromboplastin erzielt wurden, die Kurven b) und c) der Werte, die bei Anwendung desselben Verfahrens mit Human- bzw. Kaninchenthromboplastin gewonnen wurden.
Aus den oben beschriebenen und zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienenden Arbeitsschritten sind die Konzentrationswerte und die Mischungsverhältnisse ersichtlich, die für die Gewinnung wichtiger analytischer Ergebnisse vorteilhaft sind. Diese Werte sind jedoch nicht als obligatorisch zu erachten und können entsprechend den Forderungen des Operators variiert werden, ohne dabei vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Die Zubereitung der Substanzen und der aus ihnen bestehenden Mischungen, wie sie für das erfindungsgemäße Verfahren benötigt werden, kann mit Hilfe der herkömmlichen Techniken erfolgen.
Bei der Messung der Prothrombinzeit und bei der Gewinnung einer geeigneten Eichkurve kann anders, als in den obigen Beispielen beschrieben, vorgegangen werden. In der Eichkurve sollten signifikante Unterschiede in der PZ als Funktion der Protein-S-Konzentration dargestellt werden, so daß aussagefähige Ergebnisse für die zu untersuchenden Proben gewonnen werden können.
Bei Untersuchungen, die auf der Grundlage der oben beschriebenen und zur Erläuterung dienenden Arbeitsschritte durchgeführt wurden, war das Verhältnis zwischen Verlängerung der PZ und Protein-S-Aktivität im wesentlichen linear.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Protein S in einer Humanplasmaprobe, zu dem das Zumischen eines durch einen Protein-C-Aktivator aktivierten Protein-S-Minus-Plasmas zu der Plasmaprobe, anschließend das Zumischen von Rinder- Thromboplastin zu dem Gemisch in Gegenwart von Calciumionen zur Ingangsetzung einer Gerinnungsreaktion und das Messen eines Parametern bezüglich der Zeit, in der die Gerinnungsreaktion abläuft, gehören.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Rinder- Thromboplastin als dar die Reaktion in Gang setzende Reagens dient, das auch Calciumionen und Phospholipide enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der auf die Zeit, in der die Gerinnungsreaktion abläuft, bezogene Parameter die Prothrombinzeit (PZ) ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem ein Vergleich der PZ, die für eine zu untersuchende Probe bestimmt wurde, mit den PZ, die für gepooltes Humanplasma von Gesunden ermittelt wurden, vorgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bei dem das mit einem Protein-C-Aktivator aktivierte Protein-S-Minus-Plasma, das der Probe zugesetzt wird, aus einem Gemisch aus Plasma mit Protein-S-Mangel und einem protein-C-Aktivator gebildet wurde.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem es sich bei dem Protein-C-Aktivator um mindestens eine gereinigte Fraktion des Gifts der Agkistrodon contortrix handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das aktivierte Substratplasma, das der Probe zugesetzt wird, durch Inkontaktbringen eines durch Protein-S-Mangel charakterisierten Plasmas mit einem an ein unlösliches Medium gebundenen Protein-C-Aktivator gebildet wurde.

g. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem es sich bei dem Protein-C-Aktivator um mindestens eine gereinigte Fraktion des Gifts der Agkistrodon contortrix handelt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das mit einem Protein-C-Aktivator aktivierte Protein-S-Minus-Plasma, das der Probe zugesetzt wird, durch Inkontaktbringen eines durch Protein-S-Mangel charakterisierten Plasmas mit an ein unlösliches Medium gebundenem Thrombin gebildet wurde.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das mit einem Protein-C-Aktivator aktivierte Protein-S-Minus-Plasma durch Aktivieren des Proteins C in einem durch Protein-S-Mangel charakterisierten Plasma hergestellt wurde und anschließend die Schritte des Zumischens und Zusetzens so schnell auszuführen sind, daß die Protein-C-Aktivität zu dem zeitpunkt hoch ist, zu dem die Gerinnungsreaktion in Gang gesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Gerinnungsreaktion 15 bis 60 Minuten nach Aktivierung des Proteins C im durch Protein-S-Mangel charakterisierten Plasma in Gang gesetzt wird.

12. Kit zur Bestimmung der Protein-S-Aktivität in einer Humanplasmaprobe, zu dem folgendes gehört:

a) ein erstes Reagens, bei dem es sich um durch Protein-S-Mangel charakterisiertes Humanplasma handelt,

b) ein zweites Reagens, das einen Protein-C-Aktivator enthält, und

c) ein drittes Reagens, das Rinder-Thromboplastin und Calciumionen enthält.

13. Kit nach Anspruch 12, bei dem dar zweite Reagens eine gereinigte Fraktion des Gifts der Agkistrodon contortrix enthält.

14. Kit nach Anspruch 12, bei dem das dritte Reagens zusätzlich Phospholipide enthält.