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Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf einen verbesserten Test zur Messung des Blutgerinnungspotentials
des Plasmas von Patienten zum Zweck der Vorhersage des Thromboserisikos.
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Hintergrund des Standes
der Technik
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Mechanismen zur Blutgerinnung, Thrombose
und Hämostase
werden in der internationalen Patentveröffentlichung WO91/01382 gut
beschrieben.
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Es ist aus der internationalen Patentveröffentlichung
WO93/01261 und Veröffentlichungen
von Bertina et al 1994 und Dahlback et al 1995 bekannt, daß das Risiko
von Thrombose in Patienten mit einem mutierten Faktor V Molekül, bekannt
als die Leiden Variante, oder mit einer Beeinträchtigung des aktivierten Proteins
C aufgrund anderer Gründe,
durch die Aktivierung des Koagulationssystems in einer Plasmaprobe
und einer Inkubation der Probe mit aktiviertem Protein C, was als
aktiviertes Protein C Beeinträchtigungs-,
Impedanz-, oder Resistenztest bekannt wurde, bestimmt werden kann.
Es gibt Präzedenzfälle für diesen
Test, bei welchen die Beeinträchtigung
des aktivierten Proteins C in Patienten mit erworbenen Thrombophilia
nachgewiesen wurde (Mitchell et al, 1986; Amer et al, 1988).
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Kürzlich
wurden neue Testverfahren vorgeschlagen, um für die meisten Defekte im Protein
C Weg (PCP) zu screenen, um so den Ansatz für individuelle Analysen für die Proteine
C, S und Faktor V (Leiden), welche momentan zusammen in allen Fällen von
Thrombophiliauntersuchungen benötigt
werden, bei einer sehr niedrigen Rate an Unregelmäßigkeitsbefunden,
zu rationalisieren. Diese zweistufigen Gerinnungstests beinhalten
normalerweise das Aktivieren des eigenen Plasmaproteins C des Patienten,
entweder mit einem Thrombin/Thromobomodulinkomplex oder mit dem
Aktivator des Agkistrodon Contortrix Giftes, üblicherweise als PROTAC
TM von Pentapharm, Basle bezeichnet. Das
aktivierte Protein C (APC) inaktiviert dann den eigenen Faktor Va
des Patienten auf eine S-abhängige
Art und Weise während
des nachfolgenden Gerinnungstests und sorgt so für längere Gerinnungszeiten, als
wenn Protein C nicht aktiviert worden wäre. Kürzere Gerinnungszeiten als
normal werden erreicht, wenn Defekte im Protein C und Protein S
auftreten, genauso wie wenn der APC-resistente Faktor V (Leiden)
vorhanden ist. Solche Tests wurden beschrieben, basierend auf Aktivierte
Partielle Thromboplastin Zeiten (APTT) z. B. AU 28416/95,
EP 718628 "Methode zur Diagnose
von Blutgerinnungsdefekten",
Verdünntes
Prothrombin Zeittests (PT) und WO 96/42018 "Thrombose Risikotest".
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Eine Substratumwandlungsreaktionsrate
kann durch die Gerinnungszeit oder durch die Zeit, die für die Umwandlung
eines chromogenen Subrats zu einem farbigen Produkt benötigt wird,
bestimmt werden. Die erreichte Umwandlungsrate wird mit Werten verglichen,
die in Abwesenheit von Protein C Aktivator oder PCA erlangt wurden,
und auch mit Ergebnissen von normalen Plasmaproben. Wenn die Umwandlungsrate
nicht ausreichend durch den Protein C Aktivator verlängert wird,
zeigt das an, daß das
Individuum, von welchem die Probe genommen wurde, ein höher als
normales Risiko für
Thrombosen hat.
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Es ist wohl bekannt, daß die Aktivierung
von endogenem Protein C im Plasma durch den Aktivator von A. Contortrix
Gift die nachfolgenden Gerinnungszeiten um einen Faktor verlängert, der
vom Protein C Gehalt abhängt.
Einige andere Faktoren jedoch beeinflussen oder stören diesen
Test. Diese Faktoren schließen
Protein S, Faktor V (Leiden) mit ein, welche inzwischen als eigene
Thromboserisikofaktoren angesehen werden.
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Der hier genannte Erfinder hat kürzlich einen
verbesserten APC-Resistenztest
entwickelt, welcher in WO 96/04560 beschrieben wird. Dieser Test
benötigt
die Zugabe von exogenen Reagenzien zu einer Plasmaprobe, welche
Faktor V aktivieren und den normalen Weg des Blutgerinnungsmechanismus
durch Faktor X oder durch das Auslösen der Bildung von Thrombin
in einer Faktor V abhängigen
Art und Weise, zusammen mit exogenem APC aktivieren. Es wurde entdeckt,
daß wenn
Faktor V spezifisch durch ein exogenes Reagenz aktiviert wird, zusätzlich zur
Aktivierung durch den normalen Weg durch Faktor X, der Test auf
APC-Resistenz sensitiver
und spezifischer als bisher bekannte Test gemacht werden kann. Der
hier genannte Erfinder hat auch entdeckt, daß eine erhöhte Genauigkeit erreicht wird,
wenn ein komplexer Faktor X Aktivator zusammen mit dem Faktor V
Aktivator benutzt wird. Dieser Test wird, da das Gift der Russells
Viper sowohl Faktor X als auch Faktor V Aktivatoren enthält, als
der Russells Viper Gift (RVV)-basierte Test bezeichnet. Ein gleiche
Ergebnis wird erreicht, wenn Prothrombin zu Thrombin durch in einen
Faktor V abhängigen
Aktivator in der Gegenwart eines Faktor V Aktivators, wie der aus
australischen Elapidgiften, aktiviert wird.
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Der Protein C Weg ist einer aus einer
Anzahl von Antithrombosemechanismen, die in normalen Blutgefäßen arbeiten,
um die Gerinnung zu kontrollieren und Thrombosen zu verhindern.
Wahrscheinlich der wichtigste dieser Mechanismen ist der Glycosaminoglycan-
(GAG)Weg, welcher Antithrombin III als Cofaktor und Heparin Cofaktor
2 benötigt.
Thrombin und Faktor Xa werden von zwei Plasmainhibitoren kontrolliert,
welche von Glycosaminoglycanen, wie Heparinsulfate, die normalerweise
auf Endothelzellen, die gesunde Blutgefässe bedecken, sind, moduliert
werden.
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Der hier genannte Erfinder hat die überraschende
Entdeckung gemacht, daß solche
Tests weiter modifiziert werden können, um eine verbesserte Unterscheidung
zwischen gesunden Individuen und Patienten mit beeinträchtigten
oder aberranten antithrombischen Mechanismen im Blut, zu ermöglichen.
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Offenbarung der Erfindung
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Als ersten Aspekt, besteht die Erfindung
aus einem Verfahren, um das Gerinnungspotential einer Plasmaprobe
zu bestimmen, wobei die Methode folgende Schritte mit einschließt:
- (a) das Vorinkubieren der Plasmaprobe mit verdünntem, im
Wesentlichen vollständigem
Schlangengiftreagenz, so daß
- (i) endogenes Protein C im Plasma zumindest teilweise durch
das Reagenz in aktiviertes Protein C überführt wird, und
- (ii) der Faktor Xa zugegeben wird, welcher stufenweise durch
Antithrombin III/Heparin Cofactor 2 während der Vorinkubation inaktiviert
wird;
- (b) die Zugabe der Reagenzien zu der vorinkubierten Plasmaprobe
(a), um die Gerinnung zu initiieren, welche umfassen:
- (i) ein exogenes Reagenz, welches den Faktor X zu Xa oder Prothrombin
zu Thrombin in einer Faktor V-abhängigen Art und Weise aktiviert,
und
- (ii) Bestandteile, wie ein Phospholipid und Calciumionen, die
für effektive
Koagulation der Plasmaprobe notwendig sind;
- (c) die Beobachtung einer Reaktion, die einen Hinweis auf die
Koagulationsrate der Plasmaprobe geben kann;
- (d) dem Vergleich der Koagulationsrate, die in Schritt (c) beobachtet
wurde, mit einer entsprechenden Rate der Koagulation, die für einen
normalen Patienten bestimmt wurde, oder dem Vergleich der Koagulationsrate,
die in Schritt (c) beobachtet wurde mit einer entsprechenden Rate
der Koagulation die für
die Plasmaprobe in Abwesenheit des Protein C Aktivators bestimmt
wurde; und
- (e) der Bestimmung des Koagulationspotentials der Plasmaprobe
von einem oder anderer der Vergleiche von Schritt (d).
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Das Reagenz, welches in Schritt (a)
verwendet wurde, enthält
vorzugsweise auch niedrige Mengen an Glycosaminoglycanen wie normal
oder niedrigmolekulargewichtige Heparine, Dermatan oder Dextransulfate, zusätzlich zu
Faktor Xa. Die Zugabe solcher Bestandteile zum Reagenz macht den
Test empfindlicher auf Antithrombin III.
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Das Reagenz, das in Schritt (a) verwendet
wurde, welches Protein C in aktiviertes Protein C umwandelt ist
vorzugsweise verdünntes
Schlangengift von Agkistrodon Contortrix, oder verwandten Spezies
wie A. Piscovorus, A. Bilineatus, A. C Laticinctus, A. C. Moccason.
Es wurde entdeckt, daß durch die
Auswahl einer geeigneten Konzentration des Schlangengifts es möglich ist,
eine Diagnose auf beeinträchtigte
Antigerinnung mit diesem Test zu erlangen. Eine Protein C Weg (PCP)
Rate unter einem vorbestimmten Wert kann ein Hinweis auf eine beeinträchtigte
Gerinnungskontrolle im Plasma eines Patienten sein. Wenn A. Contortrix
Vollgift, verdünnt
auf eine Konzentration von ungefähr
0,002%, benutzt wird, ist es möglich
zwischen Plasma von Normalen, egal ob dieses von gesunden oder schwangeren
oder Lupus Antikoagulant-positven Individuen stammt, und Plasma
von Individuen mit thrombotischen Risikofaktoren wie APS resistentem
Faktor V (Leiden) und einer Protein C Defizienz zu unterscheiden.
Eine PCP Rate von, in diesem Fall unter 2, wäre im vorliegenden Test positiv.
Genauso wäre
für eine
Konzentration von 0,003%, ein Wert unter 2,5 positiv (siehe 1).
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Vorzugsweise wird die Inkubation
in Schritt (a) bei neutralen oder leicht basischen Bedingungen durchgeführt, genauer
bei einem pH von ungefähr
7,5. Die Inkubation wird für
eine ausreichend lange Zeit für
die Aktivierung von Protein C im Plasma ausgeführt. Typische Inkubationszeiten
von ungefähr
5 Minuten, wie für die
Vorinkubationszeit in den meisten automatisierten APTT Testmethoden üblich, haben
sich als ausreichend herausgestellt. Der hier genannte Erfinder
hat die überraschende
Entdeckung gemacht, daß der
Protein C Aktivator, der aus A. Contortrix Gift gereinigt wurde
(ein kommerzielles Produkt "ProtacTM",
erhältlich
von Pentapharm AB (Schweiz)) nicht sehr gut in der vorliegenden
Erfindung funktioniert (siehe 2).
Der hier genannte Erfinder hat entdeckt, daß verdünntes A. Contortrix Gift besonders
geeignet ist. Es ist möglich,
daß der
Reinigungsprozeß,
der verwendet wird, um diesen kommerziellen Protein C Aktivator
zu produzieren, einen zusätzlichen
Aktivator oder ein Agens, das im Vollgift vorhanden ist, entfernt,
der für
die vorliegende Erfindung vorzugsweise benötigt wird. Die genaue Art dieses
Bestandteils ist noch nicht klar, jedoch scheint ein es Prokoagulant
zu sein, welcher nicht von einem Mangel an Vitamin K abhängigen Faktoren
oder einer Warfarinbehandlung beeinflußt wird. Es wird gewürdigt, daß der dieser
zusätzliche
Aktivator oder Agnes auch aus dem Vollgift gereinigt werden könnte, und
mit jedem kommerziell erhältlichem
gereinigten Protein C Aktivator zur Benutzung in der vorliegenden
Erfindung kombiniert werden könnte.
Die einzelnen aktiven Fraktionen können auch gereinigt und rekombiniert
werden, um ein Reagens, das geeignet für die vorliegenden Erfindung
ist, herzustellen.
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Faktor Xa aus entweder humanem oder
tierischem Ursprung kann mit einbezogen werden, und mit dem Protein
C Aktivatorreagens inkubiert werden. Dieser Faktor kann aus endogenem
Faktor X durch Giftaktivatoren gebildet werden. Faktor Xa tendiert
dazu, die Gerinnungszeit zu verkürzen.
So kann die Menge an Russells Vipergift, welche im zweiten Reagens
(mit Calcium und Phspholipid) anwesend sein muß, um Gerinnungszeiten von
80–120
Sekunden bei normalem Plasma zu ergeben, ähnlich jenen in normalen Protein C-Weg
Tests, proportional reduziert werden. Auch können Heparin oder Glycosaminoglycane
in das Vorinkubationsreagenz mit eingebracht werden, um die Interaktion
zwischen Antithrombin III und Faktor Xa zu erhöhen, und so die Empfindlichkeit
auf geringe Mengen Antithrombin III zu erhöhen.
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In einer bevorzugten Ausführung der
vorliegenden Erfindung wird die Plasmaprobe des Patienten mit einem
exogenen Aktivator für
Protein C und Faktor X inkubiert. Der exogene Aktivator für Protein
C ist vorzugsweise hoch verdünntes
und unfraktioniertes Agkistrodon Contortrix Gift. Der Faktor X Aktivator
wird vorzugsweise aus dem Gift der Russell Viper (Vipera Russelli)
und anderer immunologisch kreuzreaktiver Spezies gewonnen. Die Schlangengifte
können
entweder in einer verdünnten
aber unfraktionierten Form benutzt werden, was zur Einfachheit des
Tests beiträgt,
oder, vorzugsweise in einer fraktionierten Form, mit der Benutzung
isolierter Giftbestandteile. Statt der direkten Aktivierung von
Faktor X mit exogenen Reagenzien im zweiten Schritt solcher Tests,
kann auch eine Verbesserung über
die bekannten Tests mit aktiviertem Protein C erreicht werden, indem
ein exogenes Reagenz, das im Plasma die Anwesenheit von Thrombin
in einer Faktor V abhängigen
Art und Weise induziert. In dieser Ausprägung der Erfindung können Faktor
V-abhängige
Prothrombin Aktivatoren, wie jene aus bestimmten australischen Notechis
oder Pseudonaja Giften, wie Pseudonaja Textilis, Notechis Scutatus
und Oxyuranus Scutellatus benutzt werden. Die Nutzung dieses Systems
umgeht Faktor X und alle darüberliegenden
Faktoren und macht den Test deswegen spezifischer als wenn er alleine
auf dem Gift der Russells Viper basieren würde. Die Benutzung zusätzlicher,
aus Gift gewonnener, Faktor V Aktivatoren ist bevorzugt, genau wie
oben für
das aktivierte System mit Russell Vipergift beschrieben, welches
Faktor X Aktivierung mit einschließt.
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In einer Ausführung der Erfindung werden
die Bestandteile in Schritt (b), mit welchen das Plasma des Patienten
und seine Vorinkubationsmittel vermischt werden sollen, in eine
einzige Mischung zusammen gegeben. Eine solche Mischung enthält vorzugsweise
auch zusätzliche
Bestandteile, wie passende Puffer und Konservierungsmittel. Zusätzlich enthält die Mischung
vorzugsweise Polybren oder ein ähnliches
Agens um den Effekt von jedwedem Heparin, das in den Testproben
anwesend ist oder mit dem Vorinkubationsreagenz (i) zugegeben wird,
umzukehren. Die Inkubationsmischung enthält vorzugsweise zusätzlich relativ
hohe Mengen von Phospholipid mit einer hohen Ionenstärke um nicht-spezifische
Inhibitoren wie Lupus-Antikoagulantien, die in der Testprobe vorhanden
sein können,
zu überwinden.
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Ein weiterer, die Sache verkomplizierender
Faktor in den Testproben kann der Fehler sein, der von oralen Antikoagulantien
verursacht wird. Viele dieser thrombotischen Patienten können bereits
mit oralen Antikoagulantien behandelt werden und das beeinflußt die Koagulationstests,
die momentan benutzt werden, um die Resistenz gegen aktiviertes
Protein C zu bestimmen. Die herkömmliche
Methode solche Interferenz zu minimieren besteht darin, das Testplasma
mit Faktor V defizienten Plasma zu verdünnen. Die vorliegende Erfindung
jedoch, benötigt
solche Manipulationen nicht unbedingt, da jene antithrombotischen
Agenzien, wenn sie innerhalb ihres therapeutischen Rahmens genutzt
werden, den Test nicht unbedingt negativ beeinflussen. Der Hintergrund
des Ganzen wird aus 1 klar.
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In einer weiteren Ausführung der
vorliegenden Erfindung kann der Faktor Xa im Vorinkubationsreagenz
in einer so hohen Menge benutzt werden, daß kein zusätzliches Russells Vipergift
im zweiten vermischten Reagens (welches dann nur Calcium und Phospholipid
enthält)
benötigt
wird, um eine ideale Gerinnungszeit von 100 Sekunden mit normalen
Plasma zu erreichen (gewünschte
Spanne von 50–200
Sekunden). In diesem Fall sollte die Gerinnungszeit hauptsächlich von
der Menge an Antithrombin III (ATIII) und Heparin Cofaktor 2 (HCF2)
und nicht von Protein C oder S und auch nicht von der Anwesenheit
von Faktor V (Leiden) beeinflußt
werden. In diesem Fall sollte das Verfahren als Test für den Glycosaminoglycanweg
oder "GAG" Test bezeichnet
werden. Der GAG Test dient zusätzlich
zu den PCP Tests dazu, vorläufig
auf wahrscheinliche Defekte bei ATIII und HCF2 zu testen, jedoch
scheint er in der Praxis wenig empfindlich auf HCF2 (siehe 4). Das ist möglicherweise
jedoch kein Problem, da HCF2, im Vergleich zu ATIII nur von zweifelhafter Wichtigkeit
als Risikofaktor für
Thrombosen ist.
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Die meisten Tests auf ATIII und HCF2,
die momentan benutzt werden, benötigen
daß eine
vorhergehende hohe Verdünnung
der Testprobe durchgeführt
wird. Das passiert üblicherweise
in einem Puffer, der hohe Mengen an Heparin oder GAGs enthält, um die
vollständige
Interaktion von Thrombin oder Faktor Xa mit ATIII oder HCF2 zu erleichtern.
Der quantitative Verlust an Thrombin oder Faktor Xa Enzymaktivität wird dann auf
die Menge an funktionellem ATIII oder HCF2 im Testplasma übertragen.
Wenn sich jedoch ein einziger Thrombophilia Test als empfindlich
genug gegenüber
allen bekannten thrombotischen Risikofaktoren in der diagnostischen
Praxis erweist, ist ein geeignete Mischung von ACCV/PCA und Faktor
Xa im Vorinkubationsreagenz und verdünntes Russells Vipergift/Phospholipid/Recalcifizierungsreagenz,
welches gleiche Empfindlichkeit gegenüber allen bekannten thrombotischen
Risikofaktoren aufweist, vorzuziehen.
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Das Nachweissystem, um die möglichen
Raten an Veränderung
im Gerinnungssystem zu überprüfen, kann
eine Gerinnungszeitanalyse oder eine chromometrische oder flourometrische
Analyse, die ein geeignetes synthetisches Substrat verwendet, sein.
Solche Nachweissysteme sind wohl bekannt und werden in den Patentspezifaktion,
die in den einleitenden Abschnitten dieser Spezifikation erwähnt werden,
beschrieben.
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Das Plasma einiger Patienten kann
grenzwertige Ergebnisse haben, wenn es mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung untersucht wird, so daß es nicht möglich ist
eindeutig zwischen "normalen" und Faktor V (Leiden)
defizienten Plasmaproben zu unterscheiden. Der hier genannte Erfinder
hat die überraschende
Entdeckung gemacht, daß die
Verdünnung
dieser "grenzwertigen" Proben mit Lösungen mit
niedriger Ionenstärke,
einschließlich
Wasser, und dem Durchführen
des Verfahrens, gemäß der ersten
Ausprägung
der vorliegenden Erfindung, eine Unterscheidung zwischen normalen
und Faktor V (Leiden) Proben erlaubt. Das Verfahren gemäß der ersten
Ausprägung
der vorliegenden Erfindung, erlaubt auch eine verbesserte Unterscheidung
zwischen FVL Heterozygoten und homozygoten Individuen.
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In einer zweiten Ausprägung besteht
die vorliegende Erfindung in einem Verfahren um zwischen Patienten
mit Faktor V (Leiden) und normalen Individuen zu unterscheiden,
wobei die Methode umfaßt,
das Plasma der Patienten und der normalen Individuen mit Lösungen mit
niedriger Ionenstärke,
einschließlich
Wasser, zu verdünnen
und die Methode gemäß der ersten
Ausprägung
der vorliegenden Erfindung zu wiederholen.
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Vorzugsweise wird das Plasma 1 :
1 mit Wasser verdünnt,
vorzugsweise destilliertes oder gefiltertes Wasser, bevor die Gerinnungsanalyse
wiederholt wird. Das Faktor V (Leiden) Plasma wird üblicherweise
Raten aufweisen, die genau so hoch oder kleiner sind als die Raten
die von unverdünntem
Plasma erhalten wurden. Weiterhin werden die Raten, die für Faktor
V (Leiden) Plasma erhalten werden, üblicherweise kleiner sein, als
die Raten die für
normales Plasma, welches mit den gleichen Testbedingungen überprüft worden
ist, erhalten worden. Vor der vorliegenden Erfindung wäre es nötig gewesen
Faktor V defizientes Plasma zu allen Plasmatestproben zu geben und
dann nochmals auf Gerinnungsabnormitäten zu untersuchen.
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Die Benutzung von Lösungen mit
niedriger Ionenstärke,
und besonders destilliertem Wasser ist deutlich billiger als Faktor
V defizientes Plasma, das in den momentan verwendeten Tests benötigt wird.
Weiterhin sind Lösungen
mit niedriger Ionenstärke,
und besonders destilliertes Wasser deutlich leichter zu gewinnen
als Faktor V defizientes Plasma. Die vorliegende Erfindung bietet
daher einen echten Vorteil bei Kosten und Verfügbarkeit gegenüber anderen,
momentan gebräuchlichen
Tests, die Faktor V defizientes Plasma benötigen.
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In einer dritten Ausprägung besteht
die vorliegende Erfindung aus einem Verfahren Antithrombin III Mangel
in einer Plasmaprobe zu testen, wobei das Verfahren folgende Schritte
umfaßt:
- (a) Vorinkubieren einer ersten Probe des Testplasmas
mit Faktor Xa;
- (b) Zugabe eines Reagenz zu der vorinkubierten, ersten Plasmaprobe
um die Gerinnung zu starten und Messung der Gerinnungszeit der vorinkubierten
Plasmaprobe;
- (c) Zugabe eines Reagenz zu einer zweiten Probe des Testplasmas
um die Gerinnung zu starten und Messung der Gerinnungszeit der zweiten
Testprobe; und
- (d) Vergleich der Gerinnungszeiten der ersten und zweiten Testproben,
wobei eine kürzere
Gerinnungszeit bei der ersten Plasmaprobe auf Antithrombin III-Mangel
in der Plasmaprobe hinweist.
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Vorzugsweise wird in Schritt (a)
das erste Testplasma mit einem gleichen Volumen von Faktor Xa im Puffer
für ungefähr 5 Minuten
bei 37°C
inkubiert. Besser wird in Schritt (a) das Testplasma (0,1 ml) mit
einem gleichen Volumen an Faktor Xa (optimal 0,002 u/ml oder mehr
wenn GAG zugegeben wird) in 0,02 M HEPES Puffer bei pH 7,2 für 5 Minuten
bei 37°C
inkubiert.
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Vorzugsweise wird in Schritt (b)
ein weiterhin gleiches Volumen an Calciumchlorid, welches Lecithin aus
Sojabohnen enthält,
zugegeben, um die Gerinnung der vorinkubierten Probe zu beginnen,
und die Zeit bis zur Gerinnung wird gemessen. Besser wird in Schritt
(b) ein weiterhin gleiches Volumen (0,1 ml) an 0,02 M Calciumchlorid,
welches 0,1% Lecithin aus Sojabohnen enthält, zugegeben, um die Gerinnung
der vorinkubierten Probe zu beginnen. Eine Zielspanne von 80–120 Sekunden
wurde für
Normale bestimmt.
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Das obige Resultat wird mit jenem
verglichen, das erlangt wurde, wenn das gleiche Testplasma mit einer
Mischung aus zwei Reagenzien (z. B. das FXa Reagenz und das Calciumchlorid/Phospholipidreagenz) zur
Gerinnung gebracht wurde. Vorzugsweise wird das gleiche Testplasma
(0,1 ml) mit 0,2 ml einer 1 : 1 Mischung der zwei Reagenzien (z.
B. das FXa Reagenz und das Calciumchlorid/Phospholipidreagenz) zur
Gerinnung gebracht. Eine Zielspanne von 30–35 Sekunden wurde für Normale
bestimmt.
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Innerhalb dieser Spezifikation soll,
solange es der Kontext zuläßt, das
Wort "umfassen", oder Variationen
wie "umfaßt", verstanden werden
als Implikation daß ein
benanntes Element oder eine Zahl oder Gruppen von Elementen oder
Zahlen mit eingeschlossen werden, aber nicht daß andere Elemente oder Zahlen oder
Gruppen von Elementen oder Zahlen damit ausgeschlossen werden.
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Zum Zweck, daß das Wesen der Erfindung besser
verstanden wird, wird eine bevorzugte Ausführung mit Hinblick auf das
folgende Beispiel und die beiliegenden Zeichnungen beschrieben.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
den Effekt von unterschiedlichen Mengen an ACCV Menge in PCP/FVL
Tests in verschiedenen Testplasmas. Testplasmas die für 5 Minuten
mit unterschiedlichen Mengen an ACCV vorinkubiert wurden, und dann
mit RVV/Phospholipid/Calciumreagenzien (LA-Confirm) in ACL300 im
APTT Modus zur Gerinnung gebracht wurden. Zeigt RVV Gerinnungszeitraten
(PCP Raten) aufgetragen gegen die Konzentration von ACCV (%).
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2 zeigt,
daß ProtacTM oder Verdünnungen von verdünntem Agkistrodon
Contortrix C. Vollgift (ACCV) mit vereinigtem normalen Plasma für 5 Minuten
vorinkubiert wurden, und dann mit phospholipidreichem Russells Vipergift
zur Gerinnung gebracht wurden (LA-Confirm). Die Ergebnisse zeigen
die RVV Gerinnungszeiten, die mit einer ACL300 Gerinnungsmaschine
erlangt wurden, aufgetragen gegen die Konzentration die von ProtacTM (u/ml/20) oder ACCV (ug/ml) benutzt wurde.
(Beachten Sie, daß die
PCP Raten als RVV Gerinnungszeiten mit jeder gegebenen ACCV oder
ProtacTM Menge, geteilt durch die Gerinnungszeiten
ohne vorhandenem Aktivator angegeben werden).
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3 zeigt
den Effekt von individuellen thrombotischen Risikofaktoren auf das
PCP, durchgeführt
mit verdünntem
ACC Vollgift. Sie zeigt die PCP Raten (RVV Gerinnungszeiten mit
und ohne Protein C Aktivierung) aufgetragen gegen die Menge von
jedem gezeigten Faktor. Von oben nach unten; HCF2; ATIII; Prot.
S, Prot. C, Faktor V (Leiden). Mischungen hergestellt aus in einzelnen
Faktoren defizientem oder Faktor V (Leiden) positiv (heterozygot)
Plasmas und vereinigtem normalem Plasma das selbst für 100% steht.
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4 zeigt
den Effekt auf individuelle Risikofaktoren in einem gemischten GAG/PCP
Testsystem. Das Vorinkubationsreagenz enthält verdünntes ACC Vollgift und 0,002
u/ml Faktor Xa. Das Reagenz wurde mit jedem Testplasma für 5 Minuten
bei 37°C
gemischt, bevor es mit einem reduzierten Russells Vipergiftreagenz/Phospholipid/Calciumreagenz
zur Gerinnung gebracht wurde. Die Ergebnisse zeigen die Raten der
Gerinnungszeiten mit und ohne Vorinkubation aufgetragen gegen die
Faktormenge. In absteigender Reihenfolge auf der linken Achse: HCF2,
Prot. S, ATIII, Prot. C, Faktor V (Leiden).
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5 zeigt
grenzwertige PCP/FVL Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen die Streuung
der PCP/FVL Raten die bei einigen ausgewählten Warfarinpatienten mit
reinen und wasserverdünnten
Plasmas erhalten wurden. Acht (8) reine Plasmas gaben alle grenzwertige
Ergebnisse, aber nach der Verdünnung
mit Wasser wurde eine verbesserte Unterscheidung der FVL Fälle von
den Normalen erreicht.
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Art und Weise die Erfindung
auszuführen
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VERFAHREN
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Ein Verfahren für ein Gerinnungstest wird beschrieben,
welches genauer bei der Entdeckung von Resistenz gegenüber aktiviertem
Protein C, aufgrund der Faktor V (Leiden) Mutation ist, als das
ursprüngliche System
beschrieben von Dahlback. Das Verfahren beinhaltet zwei Schritte.
Im ersten Schritt wird das Testplasma mit verdünntem Agkistrodon Contortrix
Vollgift bei 0,002–0,004%
und pH 7,5 für
5 Minuten inkubiert. Im zweiten Schritt wird phospholipidreiches
Russell Vipergift zugegeben und die Zeit bis sich eine Fibringerinnung bildet,
wird gemessen.
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Eine "Kontrolle" oder Leertest um grundlegende Gerinnungsabnormitäten festzustellen
kann auf die genau gleiche Art und Weise durchgeführt werden,
außer
das kein Agkistrodon Contortrix Gift im ersten Vorinkubationsschritt
vorhanden sein sollte. Chromogene Substrate können als Ersatz zur Gerinnselformation
verwendet werden, um die Bildung von Thrombin festzustellen, jedoch
sind diese teurer.
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Mechanismus
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Es ist bekannt, daß Agkistrodon
Contortrix Gift einen Aktivator von Protein C enthält. Der
aktive Bestandteil wurde isoliert und wird unter dem Handelsnamen "ProtacTM" von Pentapharm AB
(Schweiz) verkauft. ProtacTM wurde für die Benutzung
in Tests zur Quantifizierung von Protein C patentiert und kürzlich auch
für Tests,
die die Funktion des Protein C Wegs (PCP) bestimmen sollen, wie
oben beschrieben. Während
des Verlaufs der ersten Inkubation (oben) wird Protein C im Testplasma
in eine enzymatisch aktive Form gebracht (aktiviertes Protein C
oder APC). Dies ist ein starkes Antikoagulans, welches die Faktoren
Va and VIIIa zerstört, damit
den Gerinnungsmechanismus stört
und einige Gerinnungstests verlängert.
Bei Individuen, die in Protein C oder S defizient sind, ist der
gerinnungshemmende Effekt des Protein C Aktivators aus dem Gift
reduziert gegenüber
normal und die Gerinnungszeiten sind kürzer als normal. Auch wenn
das Plasma des Patienten eine häufig
auftretende Mutation im Faktor V aufweist, die FV (Leiden) Variante
genannt wird, sind die Gerinnungszeiten weniger verlängert, entweder
durch das aktivierte Protein C oder den Protein C Aktivator aus
Gift, als mit normalem Plasma. FV (Leiden) fehlt eine spezifische,
APC sensitive Schnittstelle, die bei der Inaktivierung von normalem
Faktor V eine Rolle spielt, deswegen verbleibt es im Testsystem
und verkürzt
die Gerinnungszeiten.
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Alle diese Defekte stören das
normale Funktionieren des PCP und sind mit klinischer Thrombose
assoziiert. Alle drei Defekte können
normalerweise durch kürzer
als normale Gerinnungstestergebnisse in Anwesenheit eines Protein
C Aktivators entdeckt werden. Patienten die mit oralen Antikoagulanzien
behandelt werden, haben reduzierte Mengen an Vitamin K – abhängigen Gerinnungsfaktoren,
sowie an Protein C und S und können üblicherweise
mit so einem Test nicht auf Faktor V (Leiden) überprüft werden. Es ist normal geworden, das
Plasma solcher Patienten mit Faktor V defizientem Plasma zu mischen,
um so alle Gerinnungsfaktordefekte und Protein C und S Mengen vor
der Durchführung
eines APC Resistenztests auf Faktor V (Leiden) zu "korrigieren".
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Der hier genannte Erfinder hat entdeckt,
daß die
Benutzung von verdünntem
Agkistrodon Contortrix Vollgift (ACCV) der Benutzung von isoliertem
Protein C Aktivator in den RVV-basierten PCP Tests, die in WO96/04560
beschrieben werden, aus den folgenden Gründen vorzuziehen ist. Der Test
wird unsensibel auf Protein S Mangel (was ein weniger wichtiger
thrombotischer Risikofaktor ist als FVL oder Protein C) und wird weniger
durch niedrige Mengen an Protein C beeinflußt und wird empfindlicher auf
Faktor V (Leiden). Die Wirkung von relativ hohen Mengen von ACCV
auf den RVVT von normalem Plasma scheint ähnlich zu sein, wie jene bei
niedrigen Mengen, anders als bei dem das isolierten Aktivators,
welcher den RVVT mit der Konzentration steigert. Größere Mengen
an ACCV können
verwendet werden, um die geringen Konzentrationen an Protein C,
die bei Patienten, die mit oralen Antikoagulanzien behandelt werden,
aufgefunden werden, um einen deutlicheren Effekt im Test zu erreichen,
zu aktivieren und die erworbene APC Resistenz bei Patienten die orale
Verhütungsmittel
nehmen oder schwanger sind, auftritt, zu überwinden. So ist es durch
die Benutzung größerer Mengen
des vollständigen
ACCV möglich,
auf den Faktor V (Leiden) hin bei Warfarinpatienten, Plasma von
Schwangeren, und anderen Umständen,
die es bisher nötig
machten, mit Faktor V defizienten oder anderen normalisierenden
Faktoren zu mischen, zu untersuchen.
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Vorteile
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- 1. Keine Notwendigkeit das Testplasma mit Faktor
V defizientem Plasma zu mischen, zur Detektion von Faktor V (Leiden)
bei komplexen Patienten.
- 2. Plateaukonzentrationsabhängigkeiten
ergeben, daß größere Mengen
an ACCV zugegeben werden können
mit kürzerer
normaler Gerinnungszeit.
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VERFAHREN
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Der verbesserte Test basisiert auf
einem Faktor V (Leiden)-spezifischem PCP Screeningtest, welcher ein
phospholipidreiches RVV Reagenz verwendet. Die Zusammensetzung des
Reagenz wurde verändert,
um es weniger empfindlich als gewöhnlich auf Veränderungen
der Protein C und Protein S Mengen in Anwesenheit eines Protein
C Aktivators zu machen. Da dieser Test bereits darauf hin entwickelt
ist, resistent gegen Heparin und Lupus Antikoagulant zu sein und
da sein Mechanismus auf dem normalen Weg basiert, ist dieser Test
zuverlässiger
als jene, die auf APTTs und PTs basiert sind.
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Reagenzien
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1. Protein C Aktivator
(PCA)
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Herstellung
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- – Zur
ursprünglich
Konzentration in destilliertem Wasser lösen, wie auf der Ampulle angegeben
ist
- – Vorsichtig
invertieren um zu vermischen – NICHT
schütteln
- – Vor
der Verwendung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen lassen
-
2. PRVV Reagenz (Phospholipidreiches
Russell Vipergiftreagenz)
-
Herstellung
-
- – Zur
ursprünglich
Konzentration in destilliertem Wasser lösen, wie auf der Ampulle angegeben
ist
- – Vorsichtig
invertieren um zu vermischen – NICHT
schütteln
- – Vor
der Verwendung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen lassen
-
Stabilität der auf
ursprüngliche
Konzentration gebrachten Proben
-
Probe
-
Mische neun Teile frisch entnommenen
Bluts mit einem Teil 3,5% (0,12 M) Trinatriumcitrat. So schnell wie
möglich
nach der Entnahme bei ≥ 1500
g für 15
Minuten zentrifugieren. Plasma abtrennen und bei 2–8°C lagern.
Innerhalb von 4 Stunden nach der Entnahme testen. Plasma kann bei –30°C oder weniger
gefroren, für
bis zu 6 Monate gelagert werden. Durch Gelbsucht, Lipämie und
Hämolyse
veränderte
Proben können
falsche Gerinnungszeitergebnisse liefern. Diese Ergebnisse können auch
bei Patienten mit abnormalen Hämatokritwert
auftreten, da die Plasma zu Citratkonzentration bei diesen Proben
nicht optimal ist.
-
Testdurchführung
-
Verfahren
-
Der PCP Test wird nicht von Heparinmengen
von bis zu 0,5 IU/ml beeinflußt.
-
Es wird empfohlen, daß eine 1
: 1 Mischung von Patientenplasma zu Faktor V defizienten Plasma
bei der Überprüfung von
Patienten die mit oralen Antikoagulantien behandelt werden, verwendet
wird. Das wird die Faktordefizienzen korrigieren, die ansonsten
den Test beeinträchtigen
können.
-
Test mit dem PC Aktivator
-
- 1. Ein leichtes Übermaß an PRVV Reagenz, welches
0,1 ml pro Test erlaubt, auf 37°C ± 1°C in einem
Reagenzreservoir vorwärmen.
- 2. 0,1 ml des Testplasmas in ein Teströhrchen geben
- 3. 0,1 ml des Aktivators zum Testplasma zugeben und bei 37°C für 5 Minuten
erwärmen.
- 4. 0,1 ml des vorgewärmten
PRVV Reagenz zugeben und die Zeit von der Zugabe des Reagenz bis
zu einem Gerinnungsendpunkt mit Hilfe der Tilt-Tube Technik messen
- 5. Wiederholen um doppelte Testwerte zu erhalten und den Durchschnitt
von diesen als Ergebnis angeben.
-
Test ohne PC Aktivator
-
- 1. Ein leichtes Übermaß an PRVV Reagenz, welches
0,1 ml pro Test erlaubt, auf 37°C ± 1°C in einem
Reagenzreservoir vorwärmen.
- 2. 0,1 ml des Testplasmas in ein Teströhrchen geben
- 3. 0,1 ml destilliertes Wasser zum Testplasma zugeben und bei
37°C für 5 Minuten
erwärmen.
- 4. 0,1 ml des vorgewärmten
PRVV Reagenz zugeben und die Zeit von der Zugabe des Reagenz bis
zu einem Gerinnungsendpunkt mit Hilfe der Tilt-Tube Technik messen
- 5. Wiederholen um doppelte Testwerte zu erhalten und den Durchschnitt
von diesen als Ergebnis angeben.
-
Die Ergebnisse der PCP-Tests von
verschiedenen A. Contortrix Vollgiftmengen auf verschiedene Testplasmas
werden in 1 gezeigt.
Die Benutzung von Mengen von zwischen 0,002 bis 0,004% ACCV im Test erlaubt
die Unterscheidung zwischen Seren von normalen Individuen (PNP1,
PNP2 und PNP3), einem Pool von oralen Antikoagulantien (O/A Pool)
und vereinigte Seren von schwangeren Individuen (PREG.POOL), von Patienten
mit beeinträchtigten
Gerinnungsfunktionen (FV(L) und FV(L) + O/A). PCP Werte unter jeweils
2 und 2,5, für
Tests die 0,002 und 0,004% ACCV benutzten, können als hinweisend für beeinträchtigte
Gerinnung angesehen werden.
-
1 zeigt
die Protein C Weg (PCP) Gerinnungszeitraten (Gerinnungszeiten mit
Protein C Aktivator anwesend/Jene ohne Aktivator) die von einer
Serie von Patienten und Normalen, unter Benutzung ansteigender Mengen
an Agkistrodon Contortrix Contortrix Gift (ACCV), erhalten wurden.
Normale Plasmas zeigen zu Beginn den größten Effekt aber scheinen bei
ACCV Mengen über
0,002% einzubrechen. Mit oralen Antikoagulantien behandelte, Faktor
defiziente (teilweise Aluminiumoxid absorbiert) und Plasma von Schwangeren zeigten
eine graduelleren Anstieg ohne Beleg für einen Einbruch. Faktor V
(Leiden) Plasmas bleiben alle niedrig. So ist es durch Auswahl einer
geeigneten ACCV Menge von ungefähr
0,003% möglich,
alle FVL negativen Fälle
in einem engen PCP Ratenbereich unterzubringen, welcher den Normal
oder Referenzbereich repräsentiert,
unabhängig
von weitern komplizierenden Faktoren. (Beachten sie das dieses RVV-basierte
System bereits unempfindlich auf therapeutische Mengen von Heparin
und jeder Abnormität,
die Faktoren die über
Faktor X im Gerinnungsweg liegen betrifft, ist).
-
2 zeigt
einen direkten Vergleich von ProtacTM mit
Agkistrodon Contortrix Gift (ACCV) im PCP Test. Ansteigende Mengen
von beiden Protein C Aktivatoren wurden vor dem Testen mit dem phospholipidreichen,
verdünnten
RVV Reagenz zu vereinigtem, normalem Plasma gegeben. Beide Aktivatoren
resultierten in gleichartig verlängerten Gerinnungszeiten,
bei Mengen unter 10 ug/ml für
ACCV oder 0,5 u/ml für
Protac. Jedoch über
dieser Konzentration rief ProtacTM eine
weitere Verlängerung
hervor, wohingegen ACCV kürzere
Gerinnungszeiten ergab. Das ist der Grund für die unerwarteten "Einbrüche" in den PCP Raten
für normales
Plasma bei ACCV Mengen über
0,002% in 1. Es ist
dieser PCP Raten"einbruch" bei Normalen, welcher
begründete
Vergleiche gegenüber
gleichartigen Messungen von APC Resistenz und PCP Defekten von Plasmas mit
Defekten wie jenen aufgrund von oralen Antikoagulantien wie in 1 gezeigt.
-
Faktor V (Leiden) Bestätigungsanalyse
-
Um zwischen normalen und Faktor V
(Leiden) Proben, welche "grenzwertige" Ergebnisse in der
Blutgerinnungsanalyse gemäß der vorliegenden
Erfindung aufwiesen, zu unterscheiden, wurden die Proben nachmals
untersucht nachdem sie zuerst 1 : 1 mit destilliertem Wasser verdünnt wurden.
Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt.
Die drei Faktor V (Leiden) Proben erzeugten niedrigere Raten als
jene der normalen Proben, die nach der Verdünnung mit Wasser nochmals untersucht
wurden. Diese Entdeckung erlaubt die Überprüfung von Proben ohne die Notwendigkeit
Faktor V defizientes Plasma zu den Proben zu geben, damit sie untersucht werden
können.
-
GAG Test
-
Dieser einfache Test wird in zwei
Teilen ausgeführt:
Zuerst ein zweistufiger Vorgang, der eine Vorinkubation mit einschließt, wie
ein APTT und zweitens ein einstufiger Test ohne Vorinkubation, genauso
wie ein PT Test.
-
Im zweistufigen Test wird Testplasma
(z. B. 0,1 ml) mit einen gleichen Volumen an Faktor Xa (optimal 0,002
u/ml oder mehr wenn GAGs zugegeben werden) in 0,002 M HEPES Puffer
bei einem pH von 7,2 für
5 Minuten bei 37 °C
vorinkubiert. Dann wird ein weiterhin gleiches Volumen (0,1 ml)
von 0,02 M Calciumchlorid, welches 0,1% Sojabohnenlecithin enthält, zugegeben
und die Zeit bis zur Gerinnung wird gemessen. Die Zielspanne ist
80–120
Sekunden bei Normalen.
-
Das obige Ergebnis wird mit jenem
verglichen, daß erhalten
wird, wenn das selbe Testplasma (0,1 ml) mit 0,2 ml einer 1 : 1
Mischung von zwei Reagenzien (z. B. das FXa Reagenz und das Calciumchlorid/Phospholipidreagenz)
zur Gerinnung gebracht wird. Die Zielspanne ist 30–35 Sekunden.
-
Es wird von Personen, die sich auf
diesem Gebiet auskennen, bemerkt werden, daß zahlreiche Variationen und/oder
Modifikation an der Erfindung, wie sie hier in den spezifischen
Ausprägungen
gezeigt wird, gemacht werden können,
ohne daß man
sich vom Geist und Umfang der Erfindung, wie hier grob beschrieben, entfernt.
Die vorliegenden Ausführungen
sind deshalb, in allen Aspekten als illustrierend und nicht als
einschränkend
anzusehen.
-
Referenzen
-
- BERTINA RM, KEULMANS BPC, KOSTER T, et al. – Mutation
in blood coagulation factor V associated with resistance to activated
protein C. Nature 369; 64–67,
1994
- DAHLBACK B – Inherited
Thrombophilia: Resistance to activated protein C as a pathogenic
factor of venous thromboemblism. Blood 85; 607–614, 1995
- MITCHELL CA, ROWELL JA, HAU L, et al. – Fatal thrombotic disorder
associated with an acquired inhibitor of protein C. N. England J.
Med. 317; 1638–16,
1987
- AMER L, KISIEL W, SEARLES RP, WILLIAMS JRC – Impairment of the protein
C anticoagulant pathway in a patient with systemic lupus erythemaosus,
anticardiiolipin antibodies and thrombosis. Thromb. res. 57, 247-1990
