DE19714559C1

DE19714559C1 - Verfahren zur Bestimmung von aktivierten Blutgerinnungsfaktoren in Plasma und Plasmaderivaten

Info

Publication number: DE19714559C1
Application number: DE1997114559
Authority: DE
Inventors: Beate Gesien; Guenter Dr Woeber
Original assignee: BLUTSPENDEDIENST DER DRK LANDE
Current assignee: BLUTSPENDEDIENST DER DRK LANDE
Priority date: 1997-04-09
Filing date: 1997-04-09
Publication date: 1998-08-06
Anticipated expiration: 2017-04-10

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von akti vierten Blutgerinnungsfaktoren in Plasma und Plasma derivaten.

Bei der Lagerung von Plasma bei niedrigen Temperaturen oder im Verlauf von Reinigungsverfahren können in Plasma oder Plasmaderivaten aktivierte Blutgerinnungsfaktoren entstehen. Blutgerinnungsfaktoren sind normalerweise enzymatisch inakti ve Proenzyme, die durch begrenzte proteolytische Spaltung in ihre biologisch aktive Form umgewandelt werden. So entsteht beispielsweise am Schluß der Gerinnungskaskade aus Prothrom bin (Faktor II) Thrombin (aktivierter Faktor II = Faktor IIa), das Fibrinogen spaltet. Außerdem aktiviert Thrombin auch Faktor XIII, der Fibrin zu einem stabilen Gerinnsel vernetzt. Diese physiologische Aktivierung ist in den mei sten Fällen erwünscht.

Unerwünscht ist dagegen eine artifizielle Aktivierung von Blutgerinnungsfaktoren in gelagertem Plasma oder bei der Her stellung eines gereinigten Prothrombinkomplexes aus Plasma, enthaltend Faktoren II, VII, IX, X als therapeutisch wirksa me Bestandteile. Bei der Behandlung von Patienten mit umfas senden Gerinnungsstörungen mit Prothrombinkomplex-Kon zentraten, z. B. durch Blutverlust bei schweren Operationen, können thrombo-hämorrhagische Komplikationen als uner wünschte Nebenwirkung auftreten, deren Ursache unbekannt ist. Sicher ist, daß das Risiko solcher Komplikationen durch Gewebsthromboplastin, das nach schweren Operationen in pathologisch hoher Konzentration im Kreislauf des Patienten zirkuliert, erhöht ist. Es wird auch vermutet, daß aktivier te Faktoren IX oder X in Prothrombinkomplex-Konzentraten zu einem erhöhten Thrombose-Risiko beitragen können.

Es werden daher Labortests an den genannten Plasmen und Plas maderivaten durchgeführt, um die Abwesenheit aktivierter Fak toren nachzuweisen. Für Plasma ist eine Methode zur selektiven Messung von Faktor VIIa in Anwesenheit von Faktor VII bekannt (US-PS 5 472 850). In der Patentschrift ist ein Assay für einen Faktor VIIa beschrieben, der einen trunkierten (verkürzten) Gewebefaktor tTF verwendet. Der Gewebefaktor ist ein integrales Membranprotein, das sowohl Faktor VII als auch Faktor VIIa mit hoher Affinität bindet und dadurch die Gerinnungskaskade auslöst. Außerdem katalysiert der Komplex aus Faktor VIIa und Gewebefaktor auch die Aktivierung von Faktor VII zu Faktor VIIa. In der Patentschrift wird eine mutierte Form des Gewebefaktors beschrieben, dessen Aminosäuresequenz um jenen Abschnitt des Proteins verkürzt ist, der für die Bindung an die Membran verantwortlich ist. Der nunmehr lösliche Gewebefaktur tTF kann Faktor VIIa binden und ist in einem Gerinnungstest voll aktiv. Er hat jedoch die Fähigkeit zur Autokatalyse von Faktor VII zu Faktor VIIa verloren. Daher kann man mit Hilfe eines solchen löslichen mutierten Gewebefaktors in einem Gerinnungstest selektiv Faktor VIIa in Anwesenheit von Faktor VII in Plasma bestimmen.

Der Test ist jedoch relativ kompliziert durchzuführen und bringt außerdem nur ein Ergebnis für das Vorhandensein des Faktors VIIa.

Als Standard-Test bei Prothrombin-Komplex PPSB ist ein Gerin nungstest vorgeschrieben, der unter der Bezeichnung NAPPT (non-activated partial prothrombine time) bekannt und beschrieben ist (vergl.: H.S. KINGDON et al.; Potentially thrombogenic materials in factor IX concentrates; Thromb. Diath. Haemorrh. 1975; 617-631).

Bei diesem Test wird die Gerinnungszeit von Plasma in Gegen wart der zu untersuchenden Probe in Abwesenheit von Substan zen, wie Kaolin, die in vitro die Gerinnung in Gang setzen, gemessen. Diese Gerinnungszeit beträgt bei Abwesenheit von aktivierten Faktoren etwa 150 s; bei Anwesenheit von akti vierten Faktoren ist die Gerinnungszeit verkürzt. Dieser Test ist jedoch relativ wenig empfindlich und zeigt auch nicht in allen Fällen vorhandene aktivierte Faktoren an. Eine Kritik dieses Tests findet sich in dem Artikel von C.V. PROWSE und A.E. WILLIAMS "A Comparison of the in vitro and in vivo thrombogenic activity. . ."; Thromb. Haemost. 1980, S. 81-86.

Es stellt sich damit die Aufgabe, einen präziseren und emp findlicheren Test zur Ermittlung der Anwesenheit von akti vierten Faktoren anzugeben, der ein breites Spektrum von aktivierten Faktoren angibt.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit folgenden Verfahrensschritten:

a) eine Probenmenge an zu untersuchendem Plasma oder Plasma derivat wird mit aktiviertem Prothrombinkomplex und prokoagu latorischen Phospholipidvesikeln, letztere integrierten Gewe befaktor enthaltend, inkubiert, und die Thrombinbildung wird durch Zugabe einer geeigneten Menge von Ca-Ionen in Gang ge setzt,
b) nach einer festgelegten Inkubationszeit von beispiels weise 5 min und 10 min wird die Thrombinbildung beendet und die Menge des gebildeten Thrombins durch bekannte Methoden bestimmt.

Bekannt ist ein Testverfahren (Y. SULTAN, F. LOYER, In Vitro Evaluation of Factor VIII-bypassing Activity. . .; J. Lab. Clin. Med. 1993, S. 444 ff.), bei dem eine Thrombin-Bildung in Gegenwart einer mit Collagen aktivierten Blutplättchen- Suspension induziert wird. Blutplättchen müssen vor jedem Te stansatz frisch aus Vollblut durch wiederholte Zentri fugation präpariert, gewaschen und auf eine definierte Zel lenzahl eingestellt werden. Derartige Plättchensuspensionen sind nur wenige Stunden haltbar und können nicht konserviert werden. Dies bedeutet eine kostspielige und nur von geübten Kräften ausführbare Tätigkeit, die die Anwendung diese be kannten Tests auf hochqualifizierte und bestausgestattete Laboratorien beschränkt.

Das neue Testverfahren dagegen arbeitet mit Materialien, die in praktisch unbeschränkter Menge herstellbar sind und für längere Zeit gelagert werden können, so daß Tests ohne zeit liche Verzögerung wegen des Ansatzes einer Blutplättchen- Suspension durchführbar sind.

Der neue Test mißt die Thrombinbildung in defibriniertem Plasma bei Anwesenheit aktivierter Faktoren. Die Menge des gebildeten Thrombins wird unter Anwendung bekannter Verfah ren durch Spaltung eines synthetischen Substrats, beispiels weise des bekannten S 2238, gemessen (vergl. H.P. Schwarz et al.; Kyoto Satellite Symposia of XIIth Congress of ISTH; Kyoto, Japan, 1989; S. 34 - Abstract). Die sich ergebende Färbung wird photometrisch vermessen.

Neben defibriniertem Plasma enthält ein Testansatz eine klei ne Menge eines aktivierten Prothrombinkomplexes und prokoagu latorische Phospholipidvesikel, wobei letztere integrierten Gewebefaktor enthalten. Die Anwesenheit des aktivierten Prothrombinkomplexes ist deshalb gewählt, weil wegen der au tokatalytischen Natur der Thrombin-Bildung bei sehr kleinen Mengen aktivierter Faktoren die Anlauf-Phase (lag-phase) der Thrombin-Bildung unterschiedlich lang wäre.

Es wäre nicht genau festzulegen, nach welchen Inkubationszei ten man die Thrombin-Bildung messen müßte. Legt man dagegen durch Hinzufügen einer kleinen, festgelegten Menge an akti viertem Prothrombinkomplex ein "Grundrauschen" fest, wird dieses durch aktivierte Faktoren verstärkt. Man kann in die sem Fall stets nach denselben Inkubationszeiten, beispiels weise nach 5 und 10 min, messen. Hervorzuheben ist, daß ins besondere die Verwendung des minimal "aktivierten" Prothrom binkomplexes in diesem Test und die Möglichkeit, aktivierte Faktoren XII, XI, IX und VII in einem Test zu bestimmen, den besonderen Wert der Erfindung ausmachen.

Es hat sich als günstig erwiesen, wenn der Gehalt an Faktor Xa im aktivierten Prothrombinkomplex etwa 1% des gesamten Faktor X-Gehalts bei nichtmeßbarem Gehalt an Faktor IIa be trägt, da hierdurch das "Grundrauschen" am besten zu reprodu zieren ist.

Der zu verwendende Gewebefaktor wird aus biogenem Ausgangsma terial hergestellt, wobei insbesondere Acetontrockenpulver vom Rinderhirn durch eine detergenzhaltige Lösung extrahiert wird.

Der Gewebefaktor wird zum Einbau in prokoagulatorischen Phos pholipidvesikeln in detergenzhaltiger Lösung mit Phosphati dylserin und Phosphattidylcholin vermischt und durch Dialyse in die prokoagulatorischen Phospholipidvesikel integriert.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden wie folgt erläu tert:

Beispiel 1 1. Herstellung von defibriniertem Plasma

Ancrod (Gift der Schlangenart Ankistrodon rhodostoma; Sigma Chemical Co.; Art. Nr. A 5042) wird mit destilliertem Wasser auf 10 U/ml verdünnt. 1 ml humanes Plasma von normalen Spen dern wird mit 10 µl Ancrod-Lösung gemischt, 1 Stunde bei 37°C inkubiert, rasch auf -70°C abgekühlt, wieder auf 37°C erwärmt und zentrifugiert. Der Überstand, defibrinier tes Plasma, wird bei Raumtemperatur aufbewahrt und muß inner halb von 10 min. verwendet werden. Das defibrinierte Plasma kann auch portioniert eingefroren werden. Es enthält nur vernachlässigbare Spuren von Thrombin.

2. Herstellung des partiellen Prothrombin-Komplexes (PPK)

Benötigte Reagentien:
normales Plasma
DEAE-Sephadex A 50
Elutionslösung. 30 g NaCl pro Liter dest. Wasser
Waschpuffer. 9 g Na₂

HPO₄

.2 H₂

O + 7 g NaCl pro Liter dest. Wasser, pH auf 7,0 gestellt;
Äquilibrierungspuffer. 6 g Na₃

-citrat.2 H₂

O + 7 g NaCl pro Liter dest. Wasser, pH nicht verändern.

50 ml normales Plasma werden eingefroren, über Nacht bei 4° C aufgetaut und 15 min. zentrifugiert. Der Überstand ist "Kryoüberstand"; letzterem werden 0,5 Einheiten Heparin pro ml Kryoüberstand zugesetzt.

DEAE-Sephadex läßt man in 1 M NaCl-Lösung 15 min bei Raumtem peratur (21-24°C) oder über Nacht bei 4°C quellen (20 mg Trockenmasse zu 2 ml Lösung), durch wiederholtes Filtrieren durch ein Nylonnetz und Resuspendieren in Äquilibrierungspuf fer äquilibrieren. Heparin-bindende Proteine werden aus dem Kryoüberstand an den Ionenaustauscher durch Inkubation bei 4°C während einer Stunde adsorbiert. Dabei werden 40 ml Kryo überstand zu äquilibriertem DEAE-Sephadex entsprechend 20 mg Trockenmasse gegeben. Der beladene DEAE-Sephadex wird abfil triert und durch Resuspendieren in Waschpuffer gereinigt. Nach erneutem Filtrieren wird DEAE-Sephadex in 1 ml Elutions puffer suspendiert und 15 min. bei Raumtemperatur geschüt telt.

Die Lösung des partiellen Prothrombinkomplexes wird nach Ent fernung von DEAE-Sephadex über Nacht gegen auf 4°C vorge kühltes destilliertes Wasser dialysiert und portioniert ein gefroren.

3. Herstellung des aktivierten Prothrombinkomplexes (APK)

Eine geeignete Verdünnung des PPK gemäß Punkt 2 muß im Throm bin-Bildungstest (siehe Punkt 5) ermittelt werden. Hierfür wird eine Verdünnungsreihe mit HEPESpuffer hergestellt (z. B. 1 : 20, 1 : 40 und 1 : 80; HEPES = N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N' -(2-ethansulfonsäure)). Jede Verdünnung wird 5 min bei 37°C mit CaCl₂ in einer Endkonzentration von 10 mM inkubiert. Eine geeignete Verdünnung ist durch die Linearität der Ge schwindigkeit der Spaltung des chromogenen Substrats S 2238 charakterisiert. Der gebrauchsfertige APK kann portioniert eingefroren werden. Durch diese Vorgangsweise kann reprodu zierbar ein APK mit einem Gehalt an Faktor Xa von etwa 1% von der Gesamtmenge Faktor X in der Präparation hergestellt werden. Thrombin ist nach Inkubation des APK mit dem chromo genen Substrat S 2238 nicht nachweisbar.

4. Herstellung von prokoagulatorischen Phospholipidvesikeln mit integriertem Gewebefaktor

Benötigte Reagentien:
Dialyseschlauch, Cellulosemembran von Sigma (Art. Nr. D 9402) oder Slide-A-Lyzer™ Dialysekassette von Fa. Pierce;
Acetontrockenpulver vom Rinderhirn (Brain Acetone Powder, Sigma, Art. Nr. B 0508);
n-Octyl-β-D-glucopyranosid (kurz octylglucosid) von Fa. Ale xis (Art. Nr. 500-001-G005); 100 mg/ml dest. Wasser (10% G/V Lösung);
Phosphatidylserin (PS), (Sigma Art. Nr. P 1185) Phosphatidylcholin (PC), (Sigma Art. Nr. P 4139). Beide Phos pholipide können ungesättigte, vorzugsweise jedoch gesättig te Fettsäuren enthalten;
Dialysepuffer in Form von 94,5 g Saccharose und 0,27 g NaCl pro Liter dest. Wasser. Der Dialysepuffer kann auch 0,5% NaN₃

enthalten.

0,216 g Acetontrockenpulver wird mit 1 ml der 10%igen Octyl glucosidlösung unter Schütteln bei etwa 30°C im Ultraschall bad digeriert. Das Unlösliche wird durch Zentrifugation ent fernt, pro ml Überstand wird 20 mg Phospholipidmischung (Mol verhältnis PC zu PS 6 zu 4) gelöst und gegen den Dialysepuf fer dialysiert. Unter täglichem Wechsel des Dialysepuffers wird 3 Tage dialysiert, anschließend weitere 2 Tage gegen Dialysepuffer, der ein Gel zum Binden von Detergentien (z. B. Biorad SM-2) enthält. Durch Dialyse wird das Detergenz entfernt, und es entsteht spontan eine Suspension von Vesi keln, die den Gewebefaktor integriert enthalten. Die gewonne nen Vesikel können portioniert eingefroren werden.

Bei jeder neuen Präparation wird anhand des Blindwertes im Thrombin-Bildungstest (siehe Punkt 5) eine geeignete Verdün nung gesucht, wobei der Blindwert ein Delta OD von 0,005 bis 0,010 betragen soll.

5. Thrombin-Bildungstest

Benötigte Reagentien:
HEPES/NaCl-Puffer. 6 mM HEPES, 139 mM NaCl, 3,5 g Albumin pro 1 Puffer, pH 7,35;
Citratpuffer: 20 mM Na₃

citrat.2 H₂

O, 125 mM NaCl, pH 7,35;
Startlösung 375 mM CaCl₂

, Stoplösung 40 mM EDTA;
APK und Vesikel (Punkt 4) mit integriertem Gewebefaktor in geeigneter Verdünnung.

5.1. Test von Plasma auf die Gegenwart aktivierter Gerin nungsfaktoren

Gepooltes Plasma, hergestellt entweder aus Vollblut oder durch Plasmapherese, wird zur Inaktivierung membranumhüllter Viren in bekannter Weise mit 1% Triton X-100 und 1% Tributyl phosphat versetzt (Neurath, A. R. und Horowitz, B., EP-PS 131 740) und 4 h bei 30°C inkubiert. Die beiden Chemikalien werden anschließend in bekannter Weise durch hydrophobe Chro matographie entfernt (Bonomo, R. J., EP-PS 366 946). Zur Vor bereitung für den Test auf vorhandene aktivierte Gerinnungs faktoren wird eine Plasmaprobe wie in Beispiel 1 beschrieben defibriniert.

Pipettierschema

- für den Blindwert: 250 µl HEPES/NaCl-Puffer + 250 µl defi briniertes Plasma (Punkt 1);
- für den APK: 125 µl HEPES/NaCl-Puffer + 250 µl defibrinier tes Plasma + 125 µl APK;
- für die Plasmaprobe: 125 µl HEPES/NaCl-Puffer + 125 µl de fibriniertes Plasma + 125 µl APK + 125 µl defibrinierte Plas maprobe des auf aktivierte Faktoren zu untersuchenden Plas mas.

Jedem Ansatz werden 50 µl Citratpuffer, 140 µl HEPES/NaCl-Puffer und 10 µl Phospholipidsuspension, hergestellt nach Punkt 4, zugesetzt und 5 min bei 37°C inkubiert. Mit 10 µl CaCl₂-Lösung wird die Reaktion gestartet, nach 5 min und 10 min wird je 50 µl der Mischung zu 50 µl einer vorge legten EDTA-Lösung (EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure) zu gesetzt, um dadurch die Thrombinbildung anzuhalten.

6. Test auf Thrombinaktivität

Das Verfahren ist an sich bekannt und wird als "Kit" gelie fert. Es wird hier nur der Vollständigkeit halber referiert.
Benötigte Reagentien:
Chromogenes Substrat S 2238, Fa. Chromogenix, Art. Nr.
41202. Der Inhalt eines Fläschchens S 2238 (25 mg) wird in 20 ml dest. Wasser gelöst; durch Verdünnen im Verhältnis 1+1 mit dest. Wasser wird eine Arbeitsverdünnung von 1 mM herge stellt. Thrombin, 53 nkat, Fa. Chromogenix, Art. Nr. 41217, wird in 1 ml dest. Wasser gelöst. Ein Pufferkonzentrat aus 500 mM Tris, 75 mM EDTA, 10% G/V PEG 6000, pH 8,4, wird mit dest. Wasser 1 : 10 verdünnt. Ein Arbeitspuffer wird durch Mi schen von Pufferkonzentrat (30 ml) mit humanem Serum-Albu min (HSA), 20% HSA (0,75 ml) hergestellt. Daraus wird Sub stratpuffer gemischt, der 26 ml Arbeitspuffer und 2,4 ml Substratlösung enthält.

20 µl der unter Punkt 5.1 "Pipettierschema" genannten Proben mengen werden jeweils mit 500 µl Substratpuffer, der auf 37°C vorgewärmt ist, gemischt. Die Extinktion wird in Minu tenabständen gemessen. Zur Kontrolle der Linearität der Sub stratspaltung werden 5 Extinktionszyklen à 1 min bei 405 nm gemessen. Eine Eichgerade wird mit Verdünnungen von Thrombin mit Arbeitspuffer im Bereich von 5,3 bis 0,53 nkat erstellt.

Mit virusinaktivierten Plasmaproben, hergestellt wie in Punkt 5, wurden folgende Ergebnisse erhalten:

1,2,3. . . verschiedene Produktionschargen von virusinakti viertem Plasma

Die angegeben Zahlen sind Extinktionsänderungen pro Minute und wurden nach einer Inkubation von 10 min beim Thrombinbildungstest erhalten. Der Meßpunkt mit 5 min Inkuba tion lieferte keine oder sehr geringe Extinktionsänderungen.

Zur Auswertung auf Thrombinbildung aus aktivierten Gerin nungsfaktoren werden von der gemessenen Extinktionsdifferenz pro Minute die Werte für APK und der Blindwert subtrahiert. Am Beispiel der Charge 9 ergibt dies einen Wert von 0,029. An einer Eichgerade mit Thrombinverdünnungen wird eine Throm binaktivität von 2 nkat abgelesen.

Sofern Plasmaproben Heparin enthalten, muß dieses vor dem Test mit Protaminsulfat oder Polybren™ (Hexadimethrinbro mid) neutralisiert oder vorzugsweise mit Heparinase inakti viert werden.

Beispiel 2 - Nachweis von aktiviertem Faktor IX, Faktor XI und Faktor XII

Faktor IXa, Faktor XIa und Faktor XIIa wurden von Fa. Ale xis, Art. Nr. 73510-1, 200-039-C025 und 200-042-UCO2 bezo gen. Defibriniertes Plasma wurde durch Inkubation mit Throm bin (1,66 nkat, 10 min. bei 37°C) aktiviert, anschließend wurde die Thrombinaktivität mit Pefabloc SC™ (4-(2-Aminoä thyl)-benzolsulfonylfluorid Hydrochlorid), Boehringer Mann heim, Art. Nr. 1 429 868, inhibiert. In einem Vorversuch wurde die zur Inhibition der vorgelegten Thrombinaktivität benötigte Menge Pefabloc SC™ ermittelt.

Pipettierschema:

- Blindwert: 250 µl HEPES/NaCl-Puffer + 250 µl defi briniertes Plasma;
- APK: 125 µl APK + 125 µl HEPES/NaCl-Puffer + 250 µl defibriniertes Plasma;
- Faktor IXa, 10 µl einer Lösung mit 0,2 Plasmaein heiten oder 10 µl Faktor XIa oder 10 µl Faktor XIIa + 125 µl APK + 115 µl HEPES/NaCl-Puffer + 250 µl de fibriniertes Plasma.

Anschließend wird jedem Ansatz 50 µl Citratpuffer, 140 µl HEPES/NaCl-Puffer und 10 µl Phospholipidsuspension, herge stellt nach Beispiel 1, Punkt 4, zugesetzt und 5 min bei 37°C inkubiert. Mit 10 µl CaCl₂-Lösung wird die Reaktion ge startet, nach 5 min und 10 min wird je 50 µl der Mischung zu 50 µl einer vorgelegten EDTA-Lösung zugesetzt, um dadurch die Thrombinbildung zu stoppen.

Der Hersteller von Faktor IXa, Faktor XIa und Faktor XIIa gibt lediglich bei Faktor IXa die Aktivität in Plasma einheiten an, wobei 1 Plasmaeinheit der Menge des Faktors in 1 ml Normalplasma entspricht. Anhand des Pipettierschemas und der Testdurchführung läßt sich errechnen, daß 0,003 Plasmaein heiten Faktor IXa im Test bereits nach 5 min Inkubationszeit im Thrombinbildungstest eine deutlich meßbare Thrombinbildung auslösen.

Beispiel 3 - Nachweis von aktiviertem Faktor VII

Faktor VIIa wurde von der Fa. Alexis, Art. Nr. 73560-1 oder HF086-1 bezogen. Defibriniertes Plasma wurde nicht mit Throm bin aktiviert. Pipettierschema und Testdurchführung waren analog wie in Beispiel 2 angegeben. Im direkten Vergleich wur den bei Faktor VIIa Phospholipidvesikel mit und ohne inte grierten Gewebefaktor als Kofaktor im Thrombinbildungstest un tersucht. Vesikel ohne Gewebefaktor wurden unverdünnt einge setzt, während Vesikel mit integriertem Gewebefaktor um den Faktor 2000 vorverdünnt werden mußten. In einem solchen Ver gleich wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

In beiden Versuchsreihen befanden sich 0,002 Plasmaeinheiten Faktor VIIa im Test. In einer Versuchsreihe mit Vesikeln mit integriertem Gewebefaktor waren noch 0,001 Plasmaeinheiten Fak tor VIIa deutlich nachweisbar.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung aktivierter Gerinnungs faktoren in Plasma oder Plasmaderivaten, mit folgenden Verfahrensschritten:

a) eine Probenmenge an zu untersuchendem Plasma oder Plasmaderivat wird mit aktiviertem Prothrombinkomplex und prokoagulatorischen Phospholipidvesikeln, letztere integrierten Gewebefaktor enthaltend, inkubiert, und die Thrombinbildung wird durch Zugabe einer geeigneten Menge von Ca-Ionen in Gang gesetzt,
b) nach einer festgelegten Inkubationszeit von beispiels weise 5 min und 10 min wird die Thrombinbildung beendet und die Menge des gebildeten Thrombins durch bekannte Methoden bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an Faktor Xa im aktivierten Prothrombinkomplex etwa 1% des gesamten Faktor X-Gehalts bei nichtmeßbarem Gehalt an Faktor IIa beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Gewebefaktor aus biogenem Ausgangsmaterial hergestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Gewebefaktor mit einer detergenzhaltigen Lösung aus Acetontrockenpulver vom Rinderhirn extrahiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gewebefaktor in prokoagulatorische Phospholipidvesikel integriert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Gewebefaktor in detergenzhaltiger Lösung mit Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin vermischt wird und durch Dialyse in die prokoagulatorischen Phospholipidvesikel integriert wird.