DE69111399T2 - Chromogenes bestimmungsverfahren für den faktor viii:ca. - Google Patents
Chromogenes bestimmungsverfahren für den faktor viii:ca.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der chromogenen Assays und insbesondere einen chromogenen Assay zur Bestimmung von Pegeln des Blutgerinnungsfaktors VIII:Ca, der in einer Probe, z. B. Plasma, enthalten ist.
- Die Gerinnselbildung in Plasma wird durch die serielle enzymatische Aktivierung von Gerinnungsfaktoren ausgelöst, die in dem Auftreten von geringen Thrombinspuren resultiert. Jensen A. Hurlet-Birk et al., Factor V and VIII Activation "In Vivo" During Bleeding. Evidence of Thrombin Formation at the Early Stage of Hemostasis. Path. Biol. 1976; 24, S.6-10. Die explosive Natur des Gerinnungsvorgangs ist eine Folge der Positionsfeedback-Reaktionen, die diese Thrombinspuren auf die Kofaktoren V ausüben. R.W. Colman, The Effect of Proteolytic Enzymes on Bovine Factor VI. Kinetics of Activation and Inactivation by Bovine Thrombin, Biochem. 1969; 4: S.1438-1444, M.J. Lindhout, Activation of Bovine Factor V by Thrombin and a Protease from Russell's Viper Venom (RVV), Thromb. Haemost. 1979; 42: S.491. SI Rapaport et al., Further Evidence That Thrombin Activation of Factor VIII is an Essential Step In Intrinsic Clotting, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1965; 17: S.84-88, R. Biggs et al., Thrombin and the Interaction of Factors VIII and IX, Brit. J. Haemat. 1965; 11: S.276-295, HC Hemker et al., Reaction Sequence of Blood Coagulation, Nature 1967; 215: S.1201, B Osterud et al., Formation of Intrinsic Factor X Activator With Special Reference to the Role of Thrombin, Br. J. Haematol. 1971; 21: S.643-660, MV Hultin et al., Activation of Factor X by Factors IXa and VIII; A Specific Assay for Factor IXa in the Presence of Thrombin-Activated Factor VIII, Blood 1978; 52: S.928-940, und auf Blutplättchen, MG Davey et al., Actions of Thrombin and Other Proteolytic Enzymes on Blood Platelets, Nature 1967; 216: S.857-858. Die aktivierten Faktoren V und VIII:C verstärken die Leistung der Faktoren Xa und IXa dramatisch, wohingegen aktivierte Blutplättchen u. a. die negativ geladene Oberfläche bereitstellen, die für die meisten Gerinnungsreaktionen notwendig ist. EM Bevers et al., Generation of Prothrombin Converting Activity and the Exposure of Phosphatidylserine at the Outer Surface of Platelets, Eur. J. Bioch. 1982; 122: S.429-436.
- Nach bekannten Verfahren wurden Konzentrationen von Faktor VIII:C und auch die Aktivierung von Faktor VIII:C in Plasma unter Anwendung von Gerinnungs-Assays gemessen, wobei Plasma mit einem VIII:C-Mangel beteiligt ist. P Soulier et al., Deficit En Beme Facteur Prothromboplastique plasmatique, Rapports Entre le PTA et le Facteur Hageman, Thrombin. Diathes. Haemorrh. 1958; 2: S.1, SI Rappaport et al., A Simple Specific One-Stage Assay for Plasma Thromboplastin Antecedent Activity, J. Lab. Clin. Med. 1961; 57: S.771, RM Hardisty et al., A One-Stage Factor VIII (Antihemophilic Globulin) Assay and Its Uses on Venous and Capillary Plasma, Thrombos. Diathes. Haemorrh. 1962; 7: S.215, JJ Veltkamp et al., Detection of the Carrier State in Hereditary Coagulation Disorders, Thrombos. Diathes. Haemorrh. 1968; 19: S.279-303 und 403-422, H Suomela et al., The Activation of Factor X Evaluated by Using Synthetic Substrates, Thromb. Res. 1977; 1: S.267-281, G Van Dieijen et al., The Role of Phospholipid and Factor VIIIa in the Activation of Bovine Factor X, J. Biol. Chem. 1981; 256: S.3433-3442. Das Auftreten verschiedener Feedback-Reaktionen machte es jedoch unmöglich, auf eine quantitativ zuverlässige Weise diese Werte zu den Mengen von aktiviertem VIII:Ca in Beziehung zu setzen. Die Bereitstellung eines chromogenen Substrats für Faktor Xa und die Erkenntnis, daß eine Eigenschaft von aktiviertem Faktor VIII:C die beschleunigte Aktivierung von Faktor X durch IXa, Phospholipide und Calciumionen ist, machten eine direktere Methode der Bestimmung von funktionellem Faktor VIII:Ca denkbar. H Suomela et al., siehe oben, Van Dieijen et al., The Role of Phosoholipid and Factor VIIIa in the Activation of Bovine Factor X, J. Biol. Chem. 1981; 256: S.3433-3442. Feedback-Reaktionen von Faktor Xa auf Faktor VIII:C und die Inaktivierung von Faktor Xa durch das Antithrombin III und α1-Antitrypsin, das in Plasma anwesend ist, stellten jedoch immer noch ein ernsthaftes Hindernis für die Durchführbarkeit eines solchen Faktor-VIII:Ca-Assays in Plasma dar. GA Vehar et al., Preparation and Properties of Bovine Factor VIII (Antihemophilic Factor), Biochemistry 1980; 19: S.401-410, MB Hultin, Role of Human Factor VIII in Factor X Activation, J. Clin Invest. 1982; 69: S.950-955, P Lollar et al., Activation of Porcine Factor VIII:C by Thrombin and Factor Xa, Biochemistry 1985; 24: S.8056-8064, P Neuenschwanter et al., A Comparison of Phospholipid and Platelets in the Activation of Human Factor VIII by Thrombin and Factor Xa, and in the Activation of Factor X, Blood 1988; 72: S.1761-1770, und Factor X, J Jesty et al., The Mechanism of Activation of Factor X, J. Biol. Chem. 1974; 249: S.5614-5622. Ein Faktor-VIII-Assay wird in Haemostasis 1987; 17(1-2); S.14-24 beschrieben, wobei der gesamte Faktor VIII in der Probe gewollt zuerst in seine aktivierte Form umgewandelt wird, und diese wird dann analysiert ohne Unterscheidung der in der Probe anwesenden Menge an Faktor VIIIa vor dem Umwandlungsschritt. Auf der Basis der Beobachtung, daß in situ erzeugtes Thrombin das einzige Enzym ist, das Faktor VIII:C und Faktor V in Plasma wirkungsvoll aktiviert, haben wir ein Schema zur Messung von Faktor VIII:Ca in Plasma entwickelt, das diese Schwierigkeiten umgeht.
- Das klassische Verfahren zur Bestimmung der Faktor-VIII:Ca- Aktivität in Plasma schätzt die Aktivität des Gerinnungsfaktors in einer Plasmaprobe aufgrund der Zeitdauer, um die er die längere Gerinnungszeit eines Plasmas verkürzt, das einen angeborenen Mangel dieses Faktors hat, verglichen mit einem normalen Plasma. Da es keine solide theoretische Grundlage gibt, die die Beziehung zwischen der Gerinnungszeit und dem Prozentsatz der Aktivität des Gerinnungsfaktors stützt, sind diese Assays Bioassays in dem Sinn, daß die Aktivitäten von einer Standardkurve abgelesen werden müssen und daß die Werte dieser Aktivitäten nur in bezug auf das Verfahren gültig sind, nach dem sie gemessen werden. Infolgedessen besteht ein Bedarf für ein stärker quantitatives Verfahren zur Messung von Faktor VIII:Ca.
- Die Erfindung gibt einen hochempfindlichen, reproduzierbaren und zweckmäßigen Assay an zur Bestimmung der Pegel des Blutgerinnungsfaktors VIII:Ca, der in Blutserum, Plasma und anderen Fluiden enthalten ist. Da Faktor VIII:Ca kein Enzym ist, kann seine funktionelle Konzentration nicht direkt mittels eines chromogenen Substrats gemessen werden. Stattdessen wird die Fähigkeit von Faktor VIII:Ca genutzt, die Faktor-X-Aktivierung in Gegenwart von Faktor IXa, Phospholipiden und Ca&sub2;&sbplus; zu verstärken. Die Konzentration von Faktor Xa kann chromogen bestimmt werden, was eine quantitative Schätzung des Faktor-VIII:Ca-Spiegels erlaubt.
- Bei dem Assay der Erfindung wird eine Testprobe aus Blutserum, Plasma oder einem anderen Faktor VIII:Ca enthaltenden Fluid einer Lösung zugefügt, die aktivierten Blutgerinnungsfaktor IXa sowie Calciumionen und Phospholipid enthält. Faktor X wird dem Gemisch zugefügt. Faktor IXa und Faktor VIII:Ca sind wirksam, um die Umwandlung des Faktors X, der ein Zymogen ist, zu aktiviertem Faktor X (nachstehend als Faktor Xa bezeichnet) zu beschleunigen. Ein Indikator wird dem Reaktionsgemisch zugefügt und reagiert mit dem so gebildeten Faktor Xa, um ein Signalmolekül freizusetzen, das auf einfache Weise gemessen werden kann. Die nachstehenden Gleichungen verdeutlichen die Schritte des Verfahrens weiter: Faktor X Faktor VII:Ca Faktor IXa Phospholipid Ca&spplus;&spplus; Faktor Xa Indikator Faktor Xa Signalmolekül
- Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird ein Assay angegeben, der ein hohes Maß an Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit für die Konzentration von Faktor VIII:Ca hat. Durch die Erfindung wird ferner ein Set bereitgestellt zur bequemen Durchführung von routinemäßigen Labor-Assays von Faktor VIII:Ca enthaltenden Fluiden. Bevorzugt wird der Assay durch die Gegenwart von Heparin und anderen mit der Blutgerinnung in Wechselwirkung tretenden Substanzen nicht beeinflußt. Bevorzugt wird eine Massenquelle von Assay-Komponenten bereitgestellt, um den Betrieb der automatischen Einrichtung zu vereinfachen, die fähig ist, große Mengen Testproben für einen Assay zu verarbeiten. Eine Aufgabe der Erfindung ist die Unterdrückung einer Nebenreaktion von Faktor Xa, die die Korrelation verfälschen könnte. In dieser Hinsicht wurde gefunden, daß die Inhibierung dieser Nebenreaktionen erreicht werden kann, indem eine hohe Konzentration von chromogenem Substrat für Faktor Xa eingesetzt wird.
- Diese Assay-Methodik kann auch zur Messung von Blutgerinnungsenzymen angewandt werden, die andere aktivierte Faktoren enthalten, insbesondere beispielsweise Faktor V. Ein aktivierendes Enzym (Enzym A, d. h. der Faktor IXa - Faktor VIII:Ca - Phospholipidkomplex) wird gemessen durch indirekte Messung der Aktivierungsrate eines Enzyms, das sein natürliches Substrat ist. Dem Enzym, das aus dieser Aktivierung resultiert (Enzym B), wird gestattet, sofort an einem Indikatormolekül wirksam zu werden. Durch seine Reaktion mit dem Indikatormolekül (dessen Konzentration ausreichend sein muß, um das Enzym B zu sättigen), werden komplizierende Reaktionen, an denen das Enzym B beteiligt ist, blockiert (beispielsweise die Aktivierung von Faktor VIII:C durch Faktor Xa und die Inhibierung von Faktor Xa durch Antithrombin III). Da das Enzym B linear über die Zeit zunimmt, wird das Signalmolekül entsprechend einer parabolischen Kurve produziert. Die Neigung der ersten Ableitung dieser Parabel ist zu der Konzentration des Enzyms A proportional.
- Die Vorteile und die Durchführung der Erfindung ergeben sich im einzelnen durch Bezugnahme auf die nachstehende genaue Beschreibung und das Beispiel.
- Das Verfahren des Assays der Erfindung weist die folgenden Schritte auf:
- 1. Vereinigen einer Probe und einer Lösung, die eine ausreichende Menge Faktor IXa enthält, um im wesentlichen den gesamten Faktor VIII:Ca in der Probe zu sättigen; einer ausreichenden Menge eines Thrombin-Inhibitors, um die Thrombinaktivität zu hemmen, ohne die Aktivität von Faktor Xa zu beeinträchtigen, einer ausreichenden Menge Phospholipide und Calciumionen, um die Umwandlung von Faktor X zu Faktor Xa zu erleichtern.
- 2. Zusetzen einer ausreichenden Menge Faktor X zu dem Gemisch, um im wesentlichen den gesamten Komplex aus Faktor IXa, Faktor VIII:Ca und Phospholipid zu sättigen.
- 3. Zusetzen einer ausreichenden Menge eines Indikators zu dem Gemisch, der fähig ist, mit Faktor Xa zu reagieren, wobei die Menge des Indikators ausreicht, um Nebenreaktionen von Faktor Xa zu unterdrücken, um ein Signalmolekül freizusetzen; und
- 4. Messen des Signalmoleküls.
- Das obige Verfahren kann durch Bezugnahme auf die nachstehenden Gleichungen beispielhaft verdeutlicht werden: Faktor X Faktor VIII:Ca Faktor IXa Phospholipid CA&spplus;&spplus; Faktor Xa Indikator Faktor Xa Signalmolekül
- Bei der Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung können die Faktoren IX und X von praktisch jeder tierischen oder menschlichen Quelle erhalten werden, und sie können durch jedes bekannte Fraktionierungs- oder Konzentrationsverfahren präpariert werden. Rekombinante Vektoren, die sich in geeigneten Wirtszellinien fortpflanzen, sind außerdem eine hochreine Quelle für solche Faktoren. Ein Vorteil der Verwendung von Faktoren von tierischen oder rekombinanten Vektor-Quellen ist die Sicherheit, daß die Produktfaktoren nicht mit menschlichen Krankheitserregern wie Hepatitis A und B, HTLV-III oder anderen solchen Viren kontaminiert sind. Bei der bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens stammen die Blutgerinnungsfaktoren vom Rind.
- Es ist zu beachten, daß dadurch, daß die Probe in dem Assay- Gemisch eine erhebliche Verdünnung erfährt (30- bis 100fach), die endogene Faktor-IX-Konzentration sehr wahrscheinlich nicht ausreichend hoch ist, um den gesamten in der Probe anwesenden Faktor VIII:Ca (bis zu 1 E/ml) zu sättigen, was für einen zuverlässigen Assay notwendig ist. Daher muß eine ausreichende Menge Faktor IXa zugefügt werden.
- Die Umwandlung von Faktor X in Xa läuft am wirkungsvollsten in Gegenwart von Phospholipiden ab. Diese Phospholipide können so repräsentative Verbindungen wie Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin oder Cholesterin und Gemische davon in unterschiedlichen Anteilen sein. Andere Lipid- und Phospholipidzusammensetzungen können ebenso substituiert werden.
- Unsere Erfahrungen haben gezeigt, daß optimale Ergebnisse erzielt werden mit Vesikeln von 20 Mol-% Phosphatidylserin und 80 Mol-% Phosphatidylcholin Das ist jedoch nicht kritisch; die akzeptablen Zusammensetzungsbereiche sind 5 bis 40 Mol-% Phosphatidylserin, 1 bis 20 Mol-% Cholesterin und 50 bis 90 Mol-% Phosphatidylcholin.
- Jede chemische Quelle von Calciumkationen kann verwendet werden, um die Umwandlung von Faktor X zu bewirken. Ausreichend Calciumionen können dem ursprünglichen Inkubationsgemisch zugefügt werden, um die Reaktion der Umwandlung von Faktor X in Faktor Xa zu verstärken, oder es kann eine zweite Menge Calciumionen zu dem Zeitpunkt zugefügt werden, zu dem Faktor X umgewandelt werden soll. Die Quelle von Calciumkation (Ca&spplus;&spplus;) kann CaCl&sub2;, Ca(NO&sub2;)&sub2;, CaSO&sub4; oder andere anorganische, Calciumkation enthaltende Verbindungen sein, die bevorzugte Quelle ist aber CaCl&sub2;.
- Ein Thrombininhibitor wird eingesetzt, um die Thrombinaktivität an dem chromogenen Substrat für Faktor Xa zu blockieren. Geeignete Thrombininhibitoren umfassen α-NAPAP und Hirudin.
- Bei der Durchführung des Assays der Erfindung kann eine Vielzahl von verschiedenen Proteinkonzentrationen, Inkubationszeiten, Reagenskonzentrationen und Temperaturen angewandt werden. Die Wahl von bestimmten Assay-Parametern wird beeinflußt durch Quelle, Typ und Größe der zu analysierenden Probe, die zu erwartenden Werte von darin enthaltenem Faktor VIII:Ca sowie die gewünschte Empfindlichkeitsgrenze. Unter Berücksichtigung dieser Umstände ist die Wahl von Assay- Parametern für den Fachmann ersichtlich. Die Parameter des Assays, die es jedem Fachmann ermöglichen, den Assay gemäß einer bevorzugten Ausführungsform durchzuführen, sind in dem nachstehenden Beispiel angegeben.
- Es ist zu beachten, daß zwar die Rate der Faktor-X-Aktivierung zu dem Pegel von Faktor VIII:Ca linear proportional ist, aber die Rate der Amidolyse des chromogenen Substrats ist dies nicht. Tatsächlich ist die Beziehung zwischen dem Absorptionsmaß und der Konzentration von Faktor VIII:Ca ein Polynom zweiter Ordnung. Deshalb werden wenigstens zwei Punkte für eine Bestimmung der Konzentration von Faktor VIII:Ca benötigt. Wir haben gefunden, daß die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn das Absorptionsmaß kontinuierlich über die Zeit gemessen wird. Die resultierende Kurve wird dann mit Hilfe einer Fehlerquadratmethode zweiter Ordnung analysiert. Das ergibt die Parameter A, B und C (Gleichung: A + B.t + C.t²). C ist zu der Konzentration von Faktor VIII:Ca proportional.
- Daher besteht ein fakultativer zusätzlicher Schritt bei dem vorliegenden Assay in der Zugabe eines Quenchmittels zu dem Inkubationsgemisch zu einem festen Zeitpunkt nach Beginn der Reaktion, in der Faktor X zu Faktor Xa umgewandelt wird. Die Quenchzusammensetzung kann jede Substanz sein, die fähig ist, eine Protein-vermittelte chemische Reaktion zu unterbrechen, aber die bevorzugte Zusammensetzung ist eine gepufferte Lösung aus Tris, Ethylendiamintetraessigsäure, Natriumchlorid und Natriumazid.
- Die Blutgerinnungsfaktoren des vorliegenden Assays und das Faktor-VIII:Ca-Protein, die zu analysieren sind, sind zerbrechliche funktionelle Proteine, und vorteilhaft kann während der Inkubation eine stabilisierende Substanz oder solche Substanzen zugefügt werden, um die Assay-Bedingungen zu optimieren und die Funktionalität von Assay-Komponenten zu schützen. Solche Stabilisierungssubstanzen schützen auch die Funktionalität während der Lagerung, wobei die Assay-Komponenten entweder in einem nassen oder einem lyophilisierten Zustand gehalten werden. Es sind verschiedene Stabilisatoren auf dem betroffenen Gebiet bekannt; die bevorzugten Substanzen sind dabei Polyethylenglykol und Rinderserumalbumin, und zwar entweder einzeln oder in Kombination.
- Der Indikator der Erfindung ist ein Molekül, das fähig ist, mit Blutgerinnungsfaktor Xa zu reagieren. Bei einer solchen Reaktion müssen Nebenprodukte der chemischen Reaktion erzeugt werden, die einen meßbaren Signalanteil produzieren; die US-Patentscriften 4 480 030 und 4 666 831 beschrieben eine Klasse von chromogenen Verbindungen, die fähig sind, mit Faktor Xa zu reagieren. Der Indikator mit der Formel CH&sub3;OCO-D-CHG-Gly-Arg-pNA-AcOH, bei dem (siehe US-A-4 480 030, Spalte 7) D-CHG D-2-Cyclohexylglycin und pNA p-Nitroanilid ist (Pentapharm, Basel, Schweiz), wird bevorzugt. Bei Reaktion mit Faktor Xa wird ein Signalmolekül P- Nitroanilin freigesetzt, das zweckmäßig mittels spektralphotometrischer Bestimmung bei 405 nm gemessen wird.
- Weitere chromogene Indikatoren, die bei der Erfindung einsetzbar sind, sind ebenfalls verfügbar. Aus der obigen Offenbarung ist es für den Fachmann ersichtlich, daß der Signalanteil des Zielindikators radiomarkiert werden kann, bevorzugt mittels Tritium oder Carbon 14, und daß das Signalmolekül nach Freisetzung mittels Ausschluß-Chromatographie, Dialyse, Immunoadsorption oder sonstigen zweckmäßigen Trennverfahren isoliert werden kann. Radiomarkierte Indikatoren sind zwar in der Verwendung umständlicher, bieten aber den Vorteil größerer Empfindlichkeit in Fällen, in denen eine ungewöhnlich hohe Empfindlichkeit verlangt wird.
- Im Rahmen der Erfindung ist daran gedacht, daß die Komponenten des Faktor-VIII:Ca-Assays als ein Set oder Kit zur bequemen und routinemäßigen Durchführung einer großen Anzahl solcher Assays verfügbar sein können.
- Ein Set zur Durchführung eines Faktor-VIII:Ca-Assays an einer Probe weist folgendes auf: a) ein erstes Gefäß, das enthält: eine ausreichende Menge an Faktor IXa, um den gesamten Faktor VIII:Ca in der Probe zu sättigen, eine ausreichende Menge eines Thrombininhibitors, um die Thrombinaktivität zu inhibieren, ohne die Aktivität von Faktor Xa zu beeinträchtigen, eine ausreichende Menge an Phospholipid und Calciumionen, um die Umwandlung von Faktor X in Faktor Xa zu erleichtern; b) ein zweites Gefäß, das eine ausreichende Menge Faktor X enthält, um den Komplex aus Faktoren IXa und VIII:Ca und Phospholipid zu sättigen; c) ein drittes Gefäß, das eine ausreichende Menge eines Indikators enthält, der zur Reaktion mit Faktor Xa fähig ist, wobei die Indikatormenge ausreicht, um Nebenreaktionen von Faktor Xa zu unterdrücken. Ein fakultatives viertes Gefäß mit einer Quenchzusammensetzung kann vorgesehen sein.
- Zur Optimierung der Lagerzeit der Komponenten des Sets ist es erwünscht, sie in den vorgenannten Gefäßen zu lyophilisieren. Die genannten Komponenten können leicht durch Zugabe von Wasser zum Zeitpunkt der Durchführung der Assays rekonstituiert werden. Die Gefäße, die Assay-Komponenten enthalten, sind ohne weiteres an eine automatische Assay- Vorrichtung anpaßbar
- Die Erzeugung von Faktor VIII:Ca wird durch Zugabe von 10 µl einer Lösung aus CaCl&sub2; (167 mM), die Thromboplastin vom menschlichen Gehirn (Verdünnung 1/18) enthält, zu 90 µl defibriniertem Plasma ausgelöst. Zu verschiedenen Zeitpunkten werden Teilmengen dieses Gemischs zur Analyse der Konzentration von Faktor VIII:Ca entnommen. Jede Teilmenge wird 100fach verdünnt in einer Küvette, die Faktor IXa (100 nM), Phospholipid-Vesikel (20 µM, 20 Mol-% Phosphatidylserin/80 Mol-% Phosphatidylcholin), CaCl&sub2; (5 mM) und -NAPAP (1 µM) in Puffer bei 37 ºC enthält. Nach 10 s wird der Küvette chromogenes Substrat (CH&sub3;OCO-D-CHG-Gly-Arg-pNA-AcOH; Pentapharm, Basel, Schweiz) für Faktor Xa zugefügt, um eine Konzentration von 400 µM zu erreichen. Die Aktivierung von Faktor X wird nach weiteren 10 s durch die Zugabe von Faktor X auf eine Konzentration von 0,33 µM gestartet. Die genannten Konzentrationen sind Endwerte, d. h. sie werden erhalten, nachdem sämtliche Zugaben zu der Küvette erfolgt sind. Der Verlauf des Absorptionsmaßes bei 405 nm wird dann kontinuierlich über die Zeit gemessen.
- Der Aufbau des Absorptionsmaßes über die Zeit ist durch die folgende Gleichung bestimmt:
- A(t).= A&sub0; + k1 [X&sub2;]&sub0; t + k2 [VIII:Ca] t
- Der quadratische Term, der eine Funktion der Konzentration von Faktor VIII:Ca ist, wird aus der Absorptionsmaß-Zeit- Kurve mit einer quadratischen Fehlerquadratmethode geschätzt. Daraus wird die Konzentration von Faktor VIII:Ca abgeleitet, wobei für k2 ein Wert von 1,164 mA/min²/%VIII:ca genutzt wird, der vorher bestimmt worden ist.
- Konzentrationen von Faktor VIII:Ca zu jedem Zeitpunkt, angegeben als Prozentsatz des Gesamtfaktors VIII:Ca, sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt. TABELLE 1 Zeit (min)
Claims (17)
1. Set zum Durchführen eines Faktor-VIII:Ca-Assays an einer
Probe, das aufweist:
a) ein erstes Gefäß, das enthält: eine ausreichende
Menge an Faktor IXa, um den gesamten Faktor VIII:Ca
in der Probe zu sättigen, eine ausreichende Menge
eines Thrombininhibitors, um die Thrombinaktivität zu
inhibieren, ohne die Aktivität von Faktor Xa zu
beeinträchtigen, eine ausreichende Menge an
Phospholipid und Calciumionen, um die Umwandlung von Faktor
X in Faktor Xa zu erleichtern;
b) ein zweites Gefäß, das eine ausreichende Menge an
Faktor X enthält, um den Komplex aus Faktoren IXa und
VIII:Ca und Phospholipid zu sättigen; und
c) ein drittes Gefäß, das eine ausreichende Menge eines
Indikators enthält, der zur Reaktion mit Faktor Xa
fähig ist, wobei die Indikatormenge ausreicht, um
Nebenreaktionen von Faktor Xa zu unterdrücken.
2. Set nach Anspruch 1, wobei die Faktoren IXa und X vom
Rind stammen.
3. Set nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Phospholipid
besteht aus: 5 bis 40 Mol-% Phosphatidylserin, 0 bis 20 Mol-%
Cholesterin, und 50 bis 90 Mol-% Phosphatidylcholin.
4. Set nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Phospholipid aus
20 Mol-% Phosphatidylserin und 80 Mol-% Phosphatidylcholin
besteht.
5. Set nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der
Indikator aus der Klasse ausgewählt ist, die aus folgendem
besteht: enzymatischen, radiometrischen, fluoreszierenden und
chromogenen Indikatoren.
6. Set nach Anspruch 5, wobei der Indikator chromogen ist.
7. Set nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ein
viertes Gefäß aufweist, das eine ausreichende Menge an
Quenchmittel enthält, um die Umwandlung von Faktor X in
Faktor Xa abzubrechen.
8. Set nach Anspruch 7, wobei das Quenchmittel irgendeine
Substanz ist, die fähig ist, eine Protein-vermittelte
chemische Reaktion zu unterbrechen.
9. Set nach Anspruch 8, wobei die Quenchsubstanz eine
gepufferte Lösung aus Tris, Ethylendiamintetraessigsäure,
Natriumchlorid und Natriumazid ist.
10. Verfahren zum Bestimmen der Konzentration des
Blutgerinnungsfaktors VIII:Ca in einer Fluidprobe, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte aufweist:
a) Vereinigen zu einem Gemisch: der Fluidprobe mit einer
ausreichenden Menge an Faktor IXa, um im wesentlichen den
gesamten Faktor VIII:Ca in der Probe zu sättigen; einer
ausreichenden Menge an Thrombininhibitor, um die Thrombinaktivität
zu inhibieren, ohne die Aktivität von Faktor Xa zu
beeinträchtigen, in Gegenwart einer ausreichenden Menge an
Calciumionen und Phospholipiden, um die Umwandlung von Faktor X
in Faktor Xa zu erleichtern;
b) Zusetzen einer ausreichenden Menge an Faktor X, um
den Komplex aus Faktoren IXa und VIII:Ca und Phospholipid zu
sättigen;
c) Zusetzen einer ausreichenden Menge eines Indikators,
der zur Reaktion mit Faktor Xa fähig ist, so daß ein
Signalmolekül freigesetzt wird, wobei die Menge des Indikators
ausreicht, um Nebenreaktionen von Faktors Xa zu unterdrücken;
und
d) Messen des Signalmoleküls.
11. Verfahren nach Anspruch 10 gemeinsam mit dem weiteren
Schritt des Zusetzens einer Quenchsubstanz zu einem
bestimmten Zeitpunkt nach dem Zusetzen von Faktor X, um die
Umwandlung von Faktor X in Faktor Xa zu verhindern.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Faktoren
IXa und X aus einer tierischen Quelle erhalten werden.
13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Faktoren
IXa und X von einem in einer Wirtszellinie fortgepflanzten
rekombinanten Vektor erhalten werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei der
Indikator aus der Klasse ausgewählt ist, die aus
enzymatischen, radiometrischen, fluoreszierenden und chromogenen
Indikatoren besteht.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Indikator chromogen
ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Indikator CH&sub3;OCO-D-
CHG-Gly-Arg-pNA-AcOH ist.
17. Verfahren zum indirekten Bestimmen der Konzentration von
Blutgerinnungsenzym, wobei das Substrat für das Enzym das
Zymogen eines zweiten Enzyms in einer Fluidprobe ist, wobei
das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
a) Vereinigen des Blutgerinnungsenzyms, des Zymogens
eines zweiten Enzyms und eines Indikators für das zweite
Enzym in ausreichenden Mengen, um sämtliche Reaktionen des
zweiten Enzyms, die nicht das Freisetzen eines Signalmoleküls
aus dem Indikator sind, zu blockieren, und
b) Messen des Signalmoleküls.
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