JPS6033480B2 - アンチトロンビン３の定量測定方法 - Google Patents

アンチトロンビン３の定量測定方法

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JPS6033480B2
JPS6033480B2 JP52002521A JP252177A JPS6033480B2 JP S6033480 B2 JPS6033480 B2 JP S6033480B2 JP 52002521 A JP52002521 A JP 52002521A JP 252177 A JP252177 A JP 252177A JP S6033480 B2 JPS6033480 B2 JP S6033480B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、水性溶液特に体液例えば血衆または血清中の
ァンチト。
ンビンｍ活性の凝固時間の測定によるへパリンとのコン
プレックス形成についての定量的測定方法に関する。１
〜Ｗの番号により特性づけられたアンチトロンビン系列
中で、アンチトロンビンｍ（ＡＴｍ）は重要な役割を演
じている。
それは純粋な形で合成されそして６５０００の分子量を
有するＱ２−グロブリンとして特性づけられている。イ
ンヒビターとしてのその生物学的作用はトロンビンには
限定されておらず、それは特定の程度で、一連の凝固因
子からのＸ因子および他のセリンプロテアーゼそしてま
たプラスミンをを阻害する。
酵素とのィンヒビターの相互作用は、徐々に、時間依存
性反応で進行しそして従ってアンチトロンビンｍは漸進
的ィンヒビターとも呼ばれている。
へパリンによって、酵素とィンヒビターとの間のこの相
互作用の速度は（鹿追される。それによって漸進的ィン
ヒピターＡＴｍはその特性を変化させそして瞬間的イン
ヒビターとなる。凝固および繊維素溶解系におけるその
中心的位置の故に、そしてへパリンによるその反応速度
上昇の可能性の理由から、ＡＴｍは血液凝固の制御にお
いて非常な重要性を有している。
ＡＴｍ含量の比較的小さな減少が血栓症の危険性のかな
りの増大を招く。血栓症危険度の血液のＡＴｍ含量との
間の関係の観点から、ＡＴｍの測定は過去数年間に漸増
的関０の的となり、そして免疫学的測定法の他に、一連
の機能試験が開発されてきた。ほとんどの生物学的試験
は、ある期間トロンビンを試験血数と共に培養し、そし
て培養後標準グラフの助けをかりてトロンビン活性を決
定することにより行なわれる。多くの測定の説明におい
て、この方法は、フィブリンのアンチトロンピン１作用
に由来する皿糠の脱繊維素化を必要とする。これは、多
くの場合、５６ｏｏに加熱するかまたは蛇毒からのＡＴ
ｍによっては阻害されないフィブリン形成性酵素（例え
ばレブチラーゼ）の助けをかりて行なわれる。経験によ
れば、脱繊維素化の段階は測定にあたって大なる不確定
性を招来し、そしてこれは時間のかかる方法である。更
に測定はＡＴｍと文献上既知の他の漸進的トロンビンィ
ンヒビタ−との間の区別を可能ならしめない。ここに本
発明者らは、種々の媒体例えば皿糠、血清、その他の体
液またはその他の流体中のＡＴｍ活性を、フィブリノー
ゲン、Ｑ２−マクログロブリンおよびＱ，一アンチトリ
プレンによるその測定の混乱ないこ測定できる条件が存
在することを発見した。
すなわち、本発明の目的は、その水性溶液中でのＡＴｍ
の測定法であるが、これはＡＴｍの希釈液、サルフェー
ト化重合体およびトロンビンを混合し、そしてフィブリ
ノーゲン溶液に加えた後その凝固時間を測定することを
包含するものである。
前記物質による測定の混乱は、例えば血※または血清の
場合には、測定を行なうべき試料を少なくとも１：５０
の比に予備希釈しておくことによって避けられる。その
ような予備希釈は可能である。何故ならば、試験される
試料のＡＴｍはへパリン作用を有するサルフヱート化有
機重合体例えば数千の分子量を有するポリエチレンスル
ホン酸好ましくはへパリンのナトリウム塩によって、漸
進的ィンビターから瞬間的ィンヒビタ−に変換されるか
らである。瞬間的ィンヒビターへのＡＴｍの変換はサル
フェート化重合体の広い濃度範囲で行なわれうる。
１０〜５００１Ｕ好ましくは２５１Ｕのへパリンまたは
へパリノィドをＡＴｍ ｌ単位（１泌の正常皿糠の活性
）当りに加えることができる。
大過剰のへパリンまたは相当する量のサルフェート化重
合体は測定の結果に悪影響を有している。この方法は次
のようにして行なわれる。
例えば２容量部の希釈試験試料および約０．４〜２０１
Ｕ好ましくは１１Ｕを有する１容量部のサルフェート化
重合体またはへパリン溶液の混合物を、１〜４０ＮＩＨ
単位好ましくは５〜１皿ＩＨ単位を有するトロンビン溶
液１容量部と合する。約４℃〜４５ｑ０範囲好まし〈は
３７０の定義された温度で２〜２０分間好ましくは４分
間にわたってこの混合物を培養した後、この培養パッチ
の１区分量を、約０．０５〜１％（夕／ｖ）好ましくは
０．４％の標準化フィブリノータゲン溶液にピペットで
入れ、そして次いで凝固時間を測定する。本発明によれ
ば、この測定は、ＡＴｍと反応するトロンビンおよび重
合体（例えばポリエチレンスルホン酸またはへパリンの
ナトリウム塩）を合０してＡＴｍ試薬とし、そして場合
により凍結乾燥するという具合に単純化される。
すなわち、本発明の目的はまた、ヘパリン作用を有する
サルフェート化有機重合体およびトロンビンを適当な組
成で含有する水性溶液中でのアンタチトロンビンｍの測
定法をも意味する。
実施例として本明細書に与えられているこの測定法の好
ましい態様においては、第一に、例えば血糠を約７．５
〜１０のｐＨ値を有するアルカリ性バッファー溶液、好
ましくは０．０２９ＭＮａＣＩを含有する００．１Ｍト
リスヒド。
キシメチルアミノメタンバツフアー（ｐＨ８．０）で１
：２５〜１：４００好まし〈は１：１００の割合で前希
釈する。次いで、希釈試料１部を１部のＡＴｍ試薬と混
合する。このＡＴｍ試薬はジィソシアネートで交父結合
されたゼラチン誘導体の溶液中における０．２〜１０１
Ｕのサルフェート化された有機重合体好ましくは１１Ｕ
のへパリンおよび０．５〜２０ＮＩＨ単位好ましくはＩ
ＯＮＩＨ単位のトロンビンからなる混合物で構成される
。前記ゼラチン誘導体は市場的に「ヘマセル」の商品名
で入手でき、そして凝固には何の影響も有していない生
理的食塩水溶液で１：２の比で希釈されるものである。
このバッチを４分間３７０で培養しそして凝固時間を標
準フイブリノーゲン溶液上でこの培養混合物１区分量を
使用して測定する。トロンビン標準曲線を使用して、ど
れだけのトロンビンが試料により阻害されたかを決める
ことができる。標準品例えば標準人皿糠に比較すること
によって、何単位または何％の標準ＡＴ囚が試料中に含
有されていたかを決定することができる。標準の１００
％は少なくとも１０人の健康な正常人のサィトレ−ト加
血酸試料混合物１のとの活性である。この活性はまた、
ＡＴｍ対する標準回帰曲線の助けをかりて決定すること
もできる。
記載のＡＴｍ測定は試料のＡＴｍの再現性ある簡単なそ
して迅速な測定を可能ならしめる。
それは他のアンチトロンビン例えば以２ーマクログロブ
リン、Ｑ，ーァンチトリプシンにより妨害されず、直線
の回帰曲線を生成しそしてこれはＡＴｍの免疫学的測定
によく一致する。トロンビン標準曲線の作成は次のよう
にしてなされる。
トロンビン溶液を鮒ＩＨ単位に前希釈した。この溶液か
ら出発して、バッファーの添加によって５，４，３，２
および１各ＮＩＨ単位のトロンビン活性を有する溶液が
生成された。標準化フィブリノーゲン溶液（０．４％フ
イブリノーゲン、トリスバツフアー、ｐＨ８．０中）、
０．２叫フイブリノーゲン溶液および０．１の上トロン
ビン溶液との混合物中におけるこれら溶液の凝固時間を
測定した。凝固時間（縦軸）をトロンビン単位（機軸）
に対して両対数方眼紙にプロットした。トロンビン標準
曲線上では、培養バッチ中のトロンビンの残存活性は、
凝固時間の記録によって決定できる。トロンビン 標準曲線 トロンビン単位 凝固時間 鮒ＩＨ単位 ３１．１秒 刊ＩＨ〃 ３５．５〃 ４ＮＩＨ〃 ４１．３〃 刈ＩＨ〃 ５１．６〃 ２ＮＩＨ〃 ７０．７〃 ＩＮＩＨ″ １０５．４〃 本発明方法による血清または皿環試料中のＡＴｍ含量の
側定を実施例として次に示す。
測定は三段階で行なわれる。１ 前希釈 試料を０．０２８ＭＮａＣＩを含有する０．１Ｍ トリ
スバツフアー（ｐＨ８．０）で１：１００の比に２段階
で前希釈した（例えば第１段階では試料０．１の‘十バ
ッファー０．９の‘、第２段階では１：１０に希釈した
試料０．１の【十バッファー０．９凧【）。
２培養 第１段階からの１：１００に希釈した試料０．２の上を
、０．２泌のＡＴｍ試薬と混合しそして３７０で４分培
養したｏ３凝固 ０．４重量％に標準化したフィプリノーゲン溶液０．２
の‘を０．１の‘の第２段階培養混合物と混合しそして
３７二０における凝固時間を測定する。
凝固時間に相当する培養バッチ中のトロンビンの残存活
性を、トロンピン嬢準曲線から次いで読み取る。これか
ら次の式Ｔ＝Ｔｖ−Ｔａ （式中Ｔは試料の阻害されたトロンビン単位数を表わし
、Ｔｖは培養バッチ中に使用されたトロンビン単位数を
表わし、そしてＴａは培養後に見出されるトロンビン単
位数を表わす）によって、トロ，ンビン何単位が試料に
より阻害されたかを計算することができる。
参照と比較することによって、試料中のＡＴｍの量は簡
単な式Ｇ者‐Ｇ３ （式中Ｇは試料中のＡＴｍ含量を表わし、Ｔｓは阻害さ
れた参照溶液のトロンビン単位数を表わし、そしてＧｓ
は参照溶液のＡＴ皿舎量を表わす）によって計算するこ
とができる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ （ａ）アンチトロンビン含有溶液、（ｂ）ヘパリン
    作用を有するサルフエート化有機重合体の希釈溶液およ
    び（ｃ）希釈トロンビン溶液を混合し、この混合物をフ
    イブリノーゲン溶液を加え、そして凝固時間を測定する
    ことからなる、水性溶液中のアンチトロンビンIIIの測
    定方法。 ２ サルフエート化有機重合体がヘパリンである前記第
    １項記載の測定方法。
JP52002521A 1976-01-15 1977-01-14 アンチトロンビン３の定量測定方法 Expired JPS6033480B2 (ja)

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DE2601372A DE2601372C3 (de) 1976-01-15 1976-01-15 Verfahren zur Bestimmung von Antithrombin III
DE2601372.9 1976-01-15

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JPS5288094A JPS5288094A (en) 1977-07-22
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AU (1) AU515025B2 (ja)
BE (1) BE850453A (ja)
CA (1) CA1079166A (ja)
CH (1) CH626919A5 (ja)
DE (1) DE2601372C3 (ja)
DK (1) DK15077A (ja)
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FR (1) FR2338496A1 (ja)
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ZA (1) ZA77210B (ja)

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ATA18877A (de) 1978-10-15
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ZA77210B (en) 1977-12-28
GB1569392A (en) 1980-06-11
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