DE2601372A1

DE2601372A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von antithrombin iii

Info

Publication number: DE2601372A1
Application number: DE19762601372
Authority: DE
Inventors: Norbert Dr Heimburger; Hermann E Dr Karges
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1976-01-15
Filing date: 1976-01-15
Publication date: 1977-07-28
Also published as: AT350193B; ZA77210B; JPS5288094A; DE2601372B2; ATA18877A; CA1079166A; CH626919A5; DK15077A; US4106990A; FR2338496A1; AU2129277A; AU515025B2; DE2601372C3; BE850453A; GB1569392A; FR2338496B1; JPS6033480B2; ES455030A1

Description

BEHRINGWERICE AKTIENGESELLSCHAPT, Marburg(Lahn)

Aktenzeichen: Hoe 76/B 001 - Ma 255

Datum 1^. Januar 1976 <-

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Antithrombin III.

ψ ι

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Antithrombin III-Aktivität von wäßrigen Lösungen ,iasb.is, Korperflüssxgkeiten wie Plasma oder Serum über die Komplexbildung mit Heparin durch Bestimmung der Gerinnungszeit.

In der Reihe der Antithrombine, die mit den Zahlen I bis VI gekennzeichnet wurden, nimmt das Antithrombin III (ATIII) eine wichtige Stelle ein. Es wurde rein dargestellt und proteinchemisch charakterisiert als ein «^-Globulin mit dem Molekulargewxcht 65ΟΟΟ.

Seine biologische Wirkung als Inhibitor ist nicht auf das Thrsnbin. beschränkt, sondern es inhibiert in besonderem Maße auch Faktor X und die anderen Serinproteasen aus der Reihe der Gerinnungsfaktoren, aber auch das Plasmin.

Die Wechselwirkung des Inhibitors mit. Enzymen verläuft langsam in einer zeitabhängigen Reaktion, daher wird das AT III als ein Progressivinhibitor bezeichnet. Durch Heparin wird die Geschwindigkeit der Wechselwirkung zwischen Enzym und Inhibitor beschleunigt, so daß aus dem Progressivinhibitor AT III ein Sofcrtinhibitor wird.

Durch seine zentrale Stellung im Gerinnungs— und F ibrinolysesys tau und v/egen der Möglichkeit, seine Reaktionsgeschwindigkeit durch

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Heparin zu steigern, kommt dem AT III eine große Bedeutung in der Steuerung der Blutgerinnung zu. Relativ geringe Verminderungen des AT III-Gehaltes sollen schon"zu einer beträchtlichen Erhöhung dec ThrcmbcsGrisikos führen. Wegen, des Zusäiiuumniäacjes zwischen Thromboserisiko und AT III-Gehalt des Blutes wurde der Bestimmung des AT Ill's in den letzten Jahren wachsende Au fineries amke it geschenkt und· neben den immunologischen Be st immung srae tho den eine Reihe von funktioneilen Testen entwickelt. Die meisten biologischen Tests verlaufen in der Weise, daß Thrombin mit dem Probenplasma für eine bestimmte Zeit inkubiert wird und die ATctivität des Thrombins nach der Inkubation anhand einer Eichkurve bestimmt wird. Diese Methode erfordert in vielen Bestimmungsvorschriften wegen der Antithrombin I-Wirkung des Fibrins eine Defibrinierung des Plasmas, was in vielen Fällen durch Erwärmen auf 56°C oder durch ein fibrinbildendes Enzym aus Schlangengift, das durch .AT III nicht gehemmt wird (z.B. Reptilase), erreicht wird. Der Defibrinierungsschritt führt erfahrungsgemäß zu großen Unsicherheiten bei der Bestimmung und ist eine zeitaufwendige Maßnahme. Darüber hinaus erlaubt die Bestimmung keine Differenzierung zwischen AT III und den anderen aus der Literatur bekannten Progressiv-Thrombininhibitoren.

Wir haben nun gefunden, daß es Bedingungen gibt, unter denen man die AT III-Aktivität in verschiedenen Proben wie Plasma, Serum, anderen Körperflüssigkeiten oder sonstigen Flüssigkeiten bestimmen kann, ohne daß Fibrinogen, oC2-Makroglobulin oder vC^-Antitrypsin die Bestimmung stören.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von AT III in dessen wässrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass man verdünnte Lösungen von AT III, sulfatiertem Polymer und Thrombin mischt und nach Zusatz zsu einer Fibrinogenlösung die Gerinnungszeit bestimmt..

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Eine Störung der Bestimmung durch die oben genannten Substanzen kann vermieden, werden, wenn man z.B. im Falle von Plasma oder Serum die zu bestimmende Probe mindestens 1:5O vorverdünnt. Eine solche Verdünnung ist möglich, weil man

das ZiT III der Probe durch sulfätierte organische Polymers mit 'Hepciiiiiwirkung, wie z.B. polyäthylensulfonsaures Natrium mit .Molekulargewichten von mehreren Tausend, vorzugsweise Heparin, von einem Progressivinhibitor in einen Sofortinhibitor umwandelt.

Die Umwandlung -von AT III in den Sofortinhibitor kann in einem weiten Konzentrationsbereich mit den suifatierten Polymeren erfolgen. Auf eine Einheit AT III (Aktivität von 1 ml Normalplasma) können 10-500 IE, vorzugsweise 25 IE Heparin oder eines Heparinoids, gegeben werden. Ein höherer Überschuß an Heparin oder entsprechender Mengen der suifatierten Polymeren wirkt sich auf das Ergebnis der Bestimmung ungünstig aus.

Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt: Zu der Mischung aus z.B. 2 Volumenteilen verdünnter Probe und 1 Volumenteil sulfatiert er Polymer- bzw. Heparinlösung mit etwa 0,4-20 IE, vorzugsweise 1 IE,wird 1 Volumenteil einer Thrombinlösung der Aktivität 1-4o NIH-Einheiten, vorzugsweise 5-10 NIH-Einheiten, gegeben.Nach einer Inkubation dieses Gemisches bei definierter Temperatur von etwa 4°C bis 45°C, vorzugsweise 37°C, über einen Zeitraum 2~2O Min», vorzugsweise 4 Min., wird ein aliquoter Teil des Inkubationsansatzes zu einer standardisierten Fibrinogenlösung von ca. 0,05 bis 1% (g/v) , vorzugsweise 0,4%, pipettiert und die Gerinnungszeit gemessen. ■

Die Bestimmung ist erfindungsgemäß dahingehend zu vereinfachen, daß man Thrombin und das mit AT III reagierende Polymere (z.B. polyäthylensulfcnsaures'Natrium oder Heparin) zu einem AT III-Reagenz vereinigt und ggf. gefriertrocknet.

Gegenstand der Erfindung sind daher ferner Mittel zur Bestimmung von Antithrombin III in dessen wäßrigen Lösungen enthaltend ein sulfätiertes organisches Polymer mit Heparinwirkung und Thrombin in einer geeigneten Zubereitung.

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•ε -

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In einer bevorzugten und als Beispiel angeführten Ausführungsform wird die Bestimmung in der Weise durchgeführt, dass man zunächst z.B. Plasma mit einer ^Lösung eines alkalischen Puffers vom pH-Wert etwa 7»5-1O, vorzugsweise 0,1 M Trishydroxymethylaminomethan-Puffer pH 8,0, der 0,025 M NaCl enthält 1:25 1:400, vorzugsweise 1:100,vorverdünnt. Danach wird 1 Teil der verdünnten Probe mit einem Teil AT III-Reagenz gemischt. Das AT III-Reagenz besteht aus einer Mischung aus 0,2-10 IE sulfa~ tiertem organischem Polymeren, vorzugsweise 1 IE Heparin und 0,5-20 NIH-Einheiten, vorzugsweise 10 NIH-Einheiten Thrombin in einer Lösung eines mit Diisocyanat vernetzten Gelatinederivates, erhältlich unter dem Warenzeichen Haemaccel, das 1:2 mit einer physiologischen, die C4er Innung nicht beeinflussenden Salzlösung verdünnt wurde. Der Ansatz wird 4 Minuten bei 37 C inkubiert und mit einem aliquoten Teil des Inkubationsgeraisches die Gerinnungszeit an einer standardisierten Fibrinogen-· lösung bestimmt. " - - ! ·.■·-·' " ■

Mit einer Thrombinbezugskurve läßt sich, ermitteln, wieviel Thrombin durch die Probe gehemmt wurde. Im Vergleich mit einem Standard, z.B." Standard-Humanplasma,-wird festgestellt, wieviel Einheiten oder % der Norm AT III in der Probe enthalten waren, wobei 100% der Norm der Aktivität von 1 ml einer Mischung von Proben des Citratplasmas von mindestens IO gesunden Normalpersonen entspricht.

Die Aktivität kann auch anhand einer Standard-Regressionskurve für AT III bestimmt werden.

Die beschriebene AT HI-Bestimmung erlaubt eine reproduzierbare, einfache und schnelle Ermittlung des AT III-Gehaltes einer Probe. Sie wird durch andere Antithrombine, wie ^-Makroglobulin und fli^-Antitrypsin nicht gestört, ergibt eine gerade Regressionskurve und stimmt gut mit der immunologischen Bestimmung des AT Ill's über ein. - «· -

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•Ιο-

Erstellung der Thrombin eichkurve: -,---.."

Eine Thrombinlösung wird auf 6 NIH-Einheiten vorverdünnt. Von dieser Verdünnung ausgehend werden durch Pufferzugabe Lösungen mit den Thrombinaktivitäten 5, 4, 3, 2 und 1 NIH-Einheiten hergestellt. Die Gerinnungszeiten dieser Lösungen in der Mischung mit einer standardisierten FibrinogenlÖsung (0,4% Fibrinogen in Trispuffer pH 8,0) -Ό,2 ml FibrinogenlÖsung und 0,1 ml Thrombinlösung - werden bestimmt. Auf doppeltlog-arithmischera Papier werden Gerinnungszeiten (Ordinate) gegen die Einheiten Thrombin (Abszisse) aufgetragen. An einer Thrombineiclikui've können die Restaktivitäten Thrombin in den Inkubationsansätzen nach Ermittlung der Gerinnungszeiten abgelesen werden,

Thrombineichkurve .

Einheiten Thrombin Gerinnungszeit

6 NIH-E · - 31,1 Sek.,

5 NIH-E ' -35,5 Sek.

4 NIH-E 3 NIH-E

41,3 Sek. 51,6 Sek.

2 NIH-E . 70,7 Sek. " ■

1 NIH-E ^: 105,4 Sek.

'BeiSj)JeI;

Bestimmung des AT III-Gehalfces in einer Serum- oder Plasmaprobe.

Die Bestimmung erfolgt in drei Arbeitsgängen:

1. VorVerdünnung

Probe mit 0,1 M Trispuffer pH 8,0, der 0,025 M NaCl enthält, in zwei Schritten 1:100 verdünnen (z.B. 1. Schritt: 0,1 ml

/ Probe + 0,9 ml Puffer; 2. Schritt: 0,1 ml der 1:10 verdünnten Probe +0,9 ml Puffer).

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2. Inkubation

0,2 ml 1:100 verdünnte Probe^ aus ^Arbeitsgang 1 und 0,2 ml AT III-Reagenz mischen, _r 4 Min= bei 37⁰C inkubieren.

3. Gerinnung

0,2 ml Fibrinogenlösung standardisiert auf O,4 Gew.% und 0,1 ml Inkubationsgemisch, aus Arbeitsgang 2 mischen, Gerinnungszeit bei 37 C bestimmen.

An der Thr omb ine ichkurve liest man die zur Gerinnungszeit- korrespondierende Restaktivität des Thrombins im Inlcubationsansatz-ab und kann' damit nach folgender Formel .

T = T - T

ν a »

in welcher bedeuten T die Zahl der gehemmten Einheiten Thrombin in der Probe, T die Zahl der im Inkubationsansatz vorgelegten Einheiten Thrombin und T die Zahl der nach der Inkubation

wieder gefundenen Einheiten Thrombin, errechnen, wieviel Einheiten Thrombin durch die Probe gehemmt werden. Im Vergleich mit einem Standard lässt sich die AT III-Menge in der Probe nach der einfachen Formel berechnen:

T
G = . G

^s »

T
s

in der G den AT Ill-Gehalt der· Probe, T die Zahl der gehemmten Einheiten Thrombin einer Standardlösung und G den AT III-

Gehalt der Standardlösung bedeuten.

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Claims

Ma 255 PATENTANSPRUCHS

1. Verfahren zur Bestimmung von Arxtithrombin III in wäßrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet/ daß man

a) die Antithrombin Ill-enthaltende'Lösung,

b) eine verdünnte Lösung eines sulfatierten organischen Polymers mit Heparinwirkung,

c) eine verdünnte Thrombinlösung

mischt, die Mischung einer Fibrinogenlösung zusetzt und die . Gefinnungszeit bestimmt. . .' "

2. Mittel zur Bestimmung von Antithrombin III in dessen wäßrigen Lösungen enthaltend ein sülfatiertes organisches Polymer mit Heparinwirkung und Thrombin in geeigneten Zubereitungen ggf.

,in gefriergetrockneter Form.

3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das sulfatierte organische Polymer Heparin ist.

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