DE2746100A1

DE2746100A1 - Verfahren zur bestimmung von fibrinogenabbauprodukt in menschlichem serum oder urin

Info

Publication number: DE2746100A1
Application number: DE19772746100
Authority: DE
Inventors: Francis Fremonte Buck
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1976-10-20
Filing date: 1977-10-13
Publication date: 1978-04-27
Also published as: NL7711146A; JPS5352621A; US4090846A; BR7706993A; BE859908A

Description

Case: 26,279

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6000 MÜNCHEN 40

AMERICAN CYANAMID COMPANY Wayne, Nes Jersey, USA

Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogenabbauprodukten in menschlichem Serum oder Urin.

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AMERICAN CYANAMID COMPANY Case: 26,279

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogenabbauprodukten in einer Probe menschlichen Serums oder Urins, das den herkömmlichen Bestimmungsmethoden dadurch überlegen ist, daß es beim Vergleich mit Standards bekannter Konzentration an Fibrinogenabbauprodukten quantiative Ergebnisse ermöglicht,daß erdie Ergebnisse auf indirektem Wege, basierend auf der Inhibierung der Antikörper/Fibrinogenabbauproduktlatex-Reaktion durch in der Probe vorhandene Fibrinogenabbauprodukte, ergibt, eine extrem geringe Wahrscheinlichkeit für falsche positive Ergebnisse zeigt, bezüglich der Bestimmung von Fibrinogenabbauprodukten spezifischer ist, da es gereinigte Fibrinogenfragmente D und E und ein für diese Fragmente spezifisches Antiserum anwendet, und schnell durchgeführt werden kann und keine speziellen Vorrichtungen benötigt. Die Fragmente D und E von Fibrinogen werden in Ann. Inst. Pasteur, Paris, 100 (1961) 377 diskutiert.

Fibrinogenabbauprodukte finden sich üblicherweise im Blut als Ergebnisse von Störungen des Koagulationssystems. Sie sind insbesondere ein Hinweis auf einen Zustand, der als verbreitete intravaskuläre Koagulation bekannt ist. Sie können auch bei drohenden Myokardinfarkten auftreten, so-daß die Überwachung ihrer Anwesenheit als Diagnosehilfsmittel benützt werden kann, um die Heilung von Patienten zu verfolgen, die einen Myokardinfarkt erlitten haben. Weiterhin ist die Anwesenheit dieser Fibrinogenabbauprodukte im Urin von Patienten, denen eine Niere tranaplantiert worden ist, ein Hinweis darauf, daß das Transplantat abgestoßen wird.

Zur Zeit sind eine Reihe von Untersuchungsmethoden und Untersuchungsreagentien bekannt, um den Gehalt des Serums und des Urins an Fibrinogenabbauprodukten zu analysieren. Die Untersuchungsmethoden sind die folgenden:

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A) Staphylokokken-Agglutinationstest

Dieser Test oder diese Untersuchungsmethode basiert auf der Tatsache, daß ein bestinunter Staphylokokkenstamm (Staphylococcus aureus Newman D₂C) in Gegenwart von monomeren) Fibrin 'oder höhermolekularen Fibrinogenabbauprodukten Klumpen bildet .Man vermischt Reihenverdünnungen der Proben mit einer Suspension der Staphylokokkenzellen, die auf Objektträgern oder in Reagenzgläsern vorliegen, und beobachtet das Auftreten oder das Nichtauftreten von Klumpen. Diese Testmethode basiert nicht auf immunologischen Prinzipien.

B) Fibrinogen-Latextest

Dies ist ein direkter Latexagglutinationstest, der auf einem Objektträger durchgeführt wird. Es werden Antikörper für menschliches Fibrinogen mit Latexteilchen verknüpft. Diese Testmethode kann wegen einer immunologischen Kreuzreaktionsfähigkeit zum Nachweis von Fibrinogenabbauprodukten angewandt werden, besitzt jedoch eine geringe Empfindlichkeit.

C) Hämagglutinations-Inhibierungstest

Diese Testmethode ist eine indirekte Bestimmungsmethode,und zwar eine Zwei-Stufen-Methode. Bei der üblichen Ausführung werden in der ersten Stufe Verdünnungen der zu untersuchenden Probe mit einer verdünnten Lösung von Antikörpern für menschliches Fibrinogen inkubiert. In der zweiten Stufe werden die nichtumgesetzten Antikörper (d. h. die Antikörper, die durch die in der Probe vorhandenen Fibrinigenabbauprodukte nicht inhibiert worden sind) nachgewiesen, indem man gefärbte rote Blutkörperchen, die mit menschlichem Plasma beschichtet sind, zusetzt. Wenn eine Agglutination auftritt, waren in der ursprünglichen verdünnten Probe keine Fibrinogenabbauprodukte vorhanden. Wenn keine Agglutination erfolgt,

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enthielt die ursprüngliche Probe eine Menge von Fibrinogenabbauprodukten, die dazu ausreichte, die Antikörper zu neutralisieren. Diese Untersuchungsmethode ist langwierig und erfordert kostspielige Vorrichtungen.

D) Thrombo-Wellcotest (Burroughs Wellcome Company, North Carolina, USA)

Diese Methode ist eine direkte Latexagglutinations-Testmethode, die auf Glasobjektträgern durchgeführt wird. Die Latexteilchen sind mit Antikörpern für die Fragmente D und E von Fibrinogen beschichtet und reagieren direkt mit den in dem Serum vorhandenen Fibrinogenabbauprodukten.

Die oben angesprochenen Untersuchungsmethoden leiden an einer Reihe von Nachteilen. So ist beispielsweise der Hämagglutinations-Inhibierungstest (C) nur mit speziellen Vorrichtungen durchzuführen, erfordert ein genaues Arbeiten und ist zeitaufwendig; der Staphylokokken-Agglutinationstest (A) basiert nicht auf immunologischen Prinzipien; die Untersuchungsmethode B ist relativ wenig empfindlich und die Untersuchungsmethode D zeigt ein hohes Maß von nichtspezifischer Latexagglutination. Bezüglich der Untersuchungsmethode D ist in Throm.Research, 2 (1970) 23 angegeben, daß die Seren von 25 % der Patienten, die an rheumatoider Arthritis litten, eine nichtspezifische Agglutination verursachen und bei der Untersuchung von Urin die Zahl der falschen positiven Ergebnisse selbst bei gesunden Probengebern auf 50 % anstieg.

Gegenstand der Erfindung ist daher eine indirekte Methode zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Fibrinogenabbauprodukten in einer Probe menschlichen Serums oder Urins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Probe des Serums oder des Urins mit Antiserum für die gereinigten Fragmente D und E von menschlichem Fibrinogen vermischt und ein Fibrinogenabbau-

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produkte enthaltendes Latexreagenz, das die gereinigten Fragmente D und E des menschlichen Fibrinogens in chemisch an die Latexträgerteilchen gebundener Form enthält, zu der Mischung zusetzt.

Erfindungsgemäß kann man beliebige Trägerteilchen verwenden.

So sind Latexträgerteilchen mit einer Größe von etwa O,1 bis etwa 2,0 ,um geeignet. Die geeignetsten Latexträgerteilchen sind die Polystyrolteilchen, die von der Firma Dow Chemical Company, Michigan, USA mit einer Vielzahl von Teilchengrößen vertrieben werden, insbesondere diejenigen mit einer Teilchengröße von 0,79 .um. Ferner sind Teilchen aus Lytron 615, die von der Firma Monsanto Chemical Company, Missouri, USA hergestellt werden, mit einer Teilchengröße von 0,15 bis 0,25 «um ebenfalls geeignet.

Im folgenden sei die Erfindung näher erläutert. Herstellung des Reagenz

Man bereitet ein gerinigtes Präparat der Fragmente D und E von Fibrinogen, indem man gereinigtes menschliches Fibrinogen (das man nach derinAskiv. Kemi, 10 (1956) 415 beschriebenen Weise gefolgt von einer Chromatographie auf O,5m Agarose ^w gereinigt hat) dem Abbau durch die Einwirkung des proteolytischen Enzyms Plasmin unterwirft, worauf man eine Chromatographie auf ver-

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netztem Polydextran (Sephadex ^ G-200) oder 0,5m Agarose ^ durchführt. Die Fraktionen, die die Fragmente D und E enthalten, werden gesammelt. Das noch vorhandene Plasmin wird durch Behandeln mit dem Inhibitor Tosyl-L-lysin-chlorketon (TLCK) inhibiert. Der restliche Inhibitor (TLCK) wird durch Dialyse entfernt. Man kann auch andere Enzyme verwenden, um Fibrinogen abzubauen und Fragmente zu bilden, die in den Fragmenten D und E ähneln.

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Die gereinigten Fragmente D und E werden wie folgt an Polystyrollatexteilchen gebunden:

Zu 1,5 bis 3 mg Fibrinogenabbauprodukten (die gereinigten Fraktionen D und E) in 3 ml eines Puffers, der aus 0,05 Mol pro 1 Glycin, 0,15 Mol pro 1 Natriumchlorid und 0,02 % Natriumazid besteht und einen pH-Wert von 8,2 aufweist, gibt man 1 ml einer IO X-igen Suspension des Latex und 1 ml einer wäßrigen Lösung, die pro ml 40 mg l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid enthält, mischt durch und erhitzt die Mischung während 10 bis 15 Minuten auf 55°C. Dann kühlt man die Reaktionsmischung ab und zentrifugiert. Man wäscht den Latex mehrfach mit einem Puffer aus O,01 Mol pro 1 Phosphat,und 0,15 Mol pro 1 Natriumchlorid, der 0,02 * Natriumazid enthält und einen pH-Wert von 7,0 aufweist. Man suspendiert den Latex dann in einer Konzentration von 1 % in diesem Puffer, der O,02 X Natriumtaurocholat und 0,02 % eines oberflächenaktiven Mittels (Triton ^w X-IOO) enthält.

Der verwendete Latex wird von der Firma Dow Diagnostics, USA, vertrieben und besitzt einen mittleren Teilchendurchmesser von 0,794.Um mit einer Standardabweichung von + 0,O044 ,um.

Durchführung des Bestimmunqsverfahrens

Man führt das Bestimmungsverfahren auf einem Glasobjektträger durch, der eine Vielzahl (üblicherweise 3) von ovalen Vertiefungen aufweist. In der ersten Stufe gibt man einen Tropfen der verdünnten, zu untersuchenden Probe (Serum oder Urin) zusammen mit einem Tropfen eines Antiserums für die Fibrinogenabbauprodukte in jede Vertiefung. (Dieses Antiserum für die Fragmente D und E bildet man in Kaninchen unter Anwendung üblicher Methoden und verdünnt das Antiserum vor der Verwendung bei der Untersuchung in geeigneter Weise.) Dann vermischt man das Antiserum und die Probe während etwa 30 Sekunden mit einem

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Auftragsstäbchen und versetzt den Objektträger dann in Drehbewegung. In der zweiten Stufe gibt man einen Tropfen des Fibrinogenabbauprodukte enthaltenden Latexreagenz zu den zuvor gebildeten Mischungen aus der Probe und dem Antiserum, mischt mit einem Auftragsstäbchen durch und bewegt die gesamte Mischung durch Drehen des Glasobjektträgers während 2 Minuten. Wenn keine Agglutination der Latexteilchen erfolgt, bedeutet dies, daß in der Probe in der untersuchten Verdünnung Fibrinogenabbauprodukte vorhanden sind (da die Fibrinogenabbauprodukte eine Reaktion des Antikörpers mit dem Fibrinogenabbauprodukte enthaltenden Latex inhibieren). Wenn eine Agglutination (Verklumpen) der Latexteilchen auftritt, sind keine Fibrinogenabbauprodukte in der Probe enthalten, da der nichtinhibierte Antikörper ohne weiteres mit dem Fibrinogenabbauprodukte enthaltenden Latexreagenz reagieren kann.

Wenn man diese Untersuchungsmethode im Rahmen einer Reihenuntersuchung auf verschiedene Verdünnungen der zu untersuchenden Probe anwendet, kann eine quantitative Bestimmung der in der Probe vorhandenen Fibrinogenabbauprodukte erreicht werden, indem man einen Vergleich mit Vergleichsstandards bekannter Konzentration an Fibrinogenabbauprodukten durchführt.

Man untersucht eine Serumprobe mit dem Untersuchungssystem (1 : 200 Verdünnung von Kaninchenantikörpern für Fibrinogenabbauprodukte) als solche und nach der Zugabe eines aliquoten Anteils eines Fibrinogenabbauprodukte enthaltenden Präparats (das gereinigte Fragmente D und E enthält), der in einer solchen Menge zugesetzt wird, daß das Serum eine Konzentration an Fibrinogenabbauprodukten von 22,UgZmI aufweist. Die Untersuchungsergebnisse sind die folgenden:

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Verdünnung des Serums

Untersuchungsergebnis (Agglutination)

Verdünnung des Serums + Fibrino genabbauprodukte

Untersuchungsergebnis (Agglutination)

unverdünnt 1 : 2
1 : 5

unverdünnt 1 : 2
1 : 5
1 : 10

Anhand einer Verdünnungsanalyse ist zu erkennen, daß das System dazu geeignet ist, eine Konzentration der Fibrinogenabbauprodukte von 4,4-ug/ml, jedoch nicht von lediglich 2,2 .ug/ ml nachzuweisen. Im Mittel zeigt das Testsystem eine Empfindlichkeit von 3,3yug/ml.

Wenn man zwei unbekannte Serumproben mit Hilfe des Testsystems untersucht, so ergeben sich folgende Ergebnisse:

Verdünnung der Serumprobe

Agglutination Serum Nr. 1 Serum Nr. 2

unverdünnt 1 : 2 1 : 4

Aus einem Vergleich mit einem Vergleichsstandard zeigt sich, daß das Serum Nr. 1 weniger als 3,3,ug Fibrinogenabbauprodukte pro-ml enthält. Das Serum Nr. 2 enthält 3,3,ug Fibrinogenabbauprodukte pro ml multipliziert nut dem Verdünnungsfaktor 3, d.h, 9,9 ,ug Fibrinogenabbauprodukte pro ml.

Mit wachsender Erfahrung ist es für den Benutzer des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, eine "teilweise" Agglutinationsreaktion von einer vollständigen Agglutinationsreaktion zu unterscheiden und in dieser Weise eine bessere quantitative Abschätzung der Konzentration der Fibrinogenabbauprodukte zu erzielen.

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Die bei dem erfindungsgemaßen Verfahren verwendeten Reagentien können ohne weiteres zu einem diagnostischen Reagenzsatz verpackt werden, der als wesentliche Bestandteile das Fibrinogenabbauprodukte enthaltende Latexreagenz, unverdünnte konzentrierte Antikörperlösung und Vergleichsstandards mit bekannter Konzentration von Fibrinogenabbauprodukten enthält.

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Claims

. . AMERICAN CYANAMID COMPANY PFENNINQ-MAA3 Case: 26,279

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PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogenabbauprodukten in einer Probe menschlichen Serums oder Urins, dadurch g e kennzeichnet , daß man eine Probe des Serums oder Urins mit Antiserum für die Fragmente D und E des menschlichen Fibrinogens vermischt und ein Fibrinogenabbauprodukte enthaltendes Latexreagenz, das die Fragmente D und E des menschlichen Fibrinogens in chemisch an die Latexteilchen gebundener Form enthält, zu der Mischung zusetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Methode im Rahmen einer Reihenuntersuchung auf verschiedene Verdünnungen der Probe anwendet und einen Vergleich mit Vergleichsstandards bekannter Konzentration an Fibrinogenabbauprodukten durchführt.
3. Reagenzsatz zur Bestimmung von Fibrinogenabbauprodukten in einer Probe menschlichen Serums oder Urins, dadurch gekennzeichnet , daß er als wesentliche Bestandteile ein Fibrinogenabbauprodukte enthaltendes Latexreagenz, eine vorverdünnte Antikörperlösung und Vergleichsstandards mit bekannter Konzentration an Fibrinogenabbauprodukten umfaßt.

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