DE3022681A1 - Verfahren zur herstellung eines reagens, das agglutination bewirkt und direkter agglutinationstest fuer koerperfluessigkeiten - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines reagens, das agglutination bewirkt und direkter agglutinationstest fuer koerperfluessigkeiten

Info

Publication number
DE3022681A1
DE3022681A1 DE19803022681 DE3022681A DE3022681A1 DE 3022681 A1 DE3022681 A1 DE 3022681A1 DE 19803022681 DE19803022681 DE 19803022681 DE 3022681 A DE3022681 A DE 3022681A DE 3022681 A1 DE3022681 A1 DE 3022681A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
antiserum
agglutination
serum
antigens
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19803022681
Other languages
English (en)
Other versions
DE3022681C2 (de
Inventor
George R Dr Siber
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of DE3022681A1 publication Critical patent/DE3022681A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3022681C2 publication Critical patent/DE3022681C2/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983Viruses
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811Test for named disease, body condition or organ function

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Verfahren zur Herstellung eines Reagens, das Agglutination bewirkt und direkter Agglutinationstest für . Körper flüssigkeiten
Die Erfindung betrifft direkte Partikelagglutinationstests, deren Ziel die Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Antigenen in Körperflüssigkeiten, z.B. Serum, Urin, cerebrospinaler Flüssigkeit o.dgl., als Hilfsmittel bei der Diagnose gewisser physiologischer oder pathologischer Zustände bei Mensch und Tier ist.
Der Nachweis von mikrobiellen Antigenen in Körperflüssigkeiten kann bei der schnellen Diagnose einer zunehmenden Zahl von Infektionen nützlich und vorteilhaft sein. Ein größeres Problem liegt jedoch darin, daß die zur Zeit verfügbaren Methoden nicht genügend empfindlich sind (Immundiffusion, CIE) und daher nicht die j Anwesenheit von Antigenen in einem wesentlichen Teil von; infizierten Patienten anzeigen, oder für eine schnelle Diagnose (RIA, ELISA) zu zeitraubend sind. In gewissen ι Fällen ist der Antigen-Antikörper-Komplex langsam zu ; bilden, und/oder die gebildeten Partikel sind zu klein, ' um mit Sicherheit beobachtet zu werden. Die Nachweisbar-! keit wurde durch Anwendung von Agglutinationstests ver- ; bessert, bei denen Partikel als Träger, an dessen Ober- : fläche das Antigen- oder Antikörpermolekül adsorbiert ■ oder gebunden wird, verwendet werden. j
Diese Agglutinationstests können nach der indirekten J Methode durchgeführt werden, bei der die klinische Probe: mit dem Antikörper bei einer ganz bestimmten Verdünnung , gemischt und nach geeigneter Inkubationszeit ein Indi- : katorsystem, das aus einem Komplex des an einen fein-
teiligen Träger gebundenen Antigens besteht, dem Gemisch ■ zugesetzt wird. Wenn Antigen in der klinischen Probe ; vorhanden ist, ist der Antikörper nicht verfügbar, um j
0300S4/Q67S
ORIGINAL INSPECTED
mit dem Antigen-Träger-Komplex zu reagieren, so daß keine Agglutination stattfindet, d.h. fehlende Agglu-
tination ist ein positiver Test für das Antigen. Wenn ι : umgekehrt das Antigen in der klinischen Probe nicht j 5 vorhanden ist, reagiert der Antikörper mit dem Antigen- ! : Träger-Komplex, wobei es zu Agglutination der Indikator-j ! probe kommt. Die Theorie, nach der solche Agglutina- !
. tionstests arbeiten, ist bekannt, beispielsweise aus den US-PSen 3 171 783, 3 775 536, 3 873 683, 3 879 262, j 10 4 003 898 und 4 045 384. j
' Man hat seit langem erkannt, daß die einzige aussagekräftige Diagnosemethode auf dem Gebiet der Infektionskrank-j
j
heiten der frühzeitige schnelle Nachweis der mit dem infektiösen Agens assoziierten Antigene ist, wobei eine ι
sofortige Anweisung zur wirksamen Behandlung gegeben ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein direkter Agglutinationstest für den Nachweis von Antigenen.
Gemäß der Erfindung wurde nun ein äußerst empfindlicher j Agglutinationstest für den Nachweis von Antigenen, z.B. ι Proteinen und den Polysacchariden der verschiedensten j Mikroorganismen einschließlich Bakterien, Protozoen und . Fungi in niedrigen Konzentrationen in Körperflüssig— j keiten entwickelt. Ein erfindungsgemäßer Test wird beschrieben, durch den routinemäßig bereits 0,2 ng/ml ' der in Verbindung mit pathogenen Bakterien auftretenden ' kapsulären Polysaccharide nachgewiesen werden. Dies : stellt eine Empfindlichkeit dar, die 25- bis 25Omal größer ist als bei den weitgehend angewandten Gegenstrom-Immunelektrophoresemethoden (CIE), und wenigstens die ; gleiche Empfindlichkeit wie beim Radioimmuntest (RIA).
Außerdem ist zwar der CIE-Test schnell, jedoch erfordert1 er geschultes Laboratoriumspersonal und mäßig kostspie- ■ lige Reagentien und Apparaturen und ergibt eine begrenzte Empfindlichkeit von 10 bis 50 ng/ml bei den meisten !
bakteriellen Polysacchariden. Da in Körperflüssigkeiten ;
030064/0B76
ORIGINAL INSPECTED
häufig niedrigere Konzentrationen des Antigens auftreten, werden häufig bei Patienten mit durch Kulturen belegten Bakterieninfektionen falsche negative CIE-Tests beobachtet. Der Radioimmuntest andererseits ist ι 5 10- bis lOOmal empfindlicher als der CIE-Test, jedoch viel zeitraubender und teurer.
: Vor der Erfindung war die weit verbreitete Anwendung , von Partikelagglutinationstests, obwohl diese äußerst ι · einfach und billig sind, durch den geringen Grad der j 10 Empfindlichkeit dieser Tests gegenüber geringen Konzen-'■ trationen des Antigens und schlechte Spezifität, die sich durch das Auftreten nicht-spezifischer Agglutination insbesondere bei Serumproben zeigte, begrenzt.
Durch Anwendung der nachstehend beschriebenen Methode ι 15 gemäß der Erfindung wird eine Empfindlichkeit in der
Größenordnung von 0,2 ng/ml erreicht, und die Häufigkeit nicht-spezifischer Agglutination bei menschlichen Sera ist auf 2% oder weniger reduziert. Ferner ergaben eine ι wohlüberlegte Wahl und Vorbereitung des Antiserums einen Test, der durch gleichmäßige Empfindlichkeit, gute Stabilität und Spezifität gekennzeichnet ist.
■ Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein empfindlicher Partikelagglutinationstest, der den Nachweis von mikrobiellen Antigenen in Körperflüssigkeiten bei Konzentrationen bis hinab zu 0,2 ng/ml Körperflüssigkeit ermög- j
, licht und durch eine Rate von nicht-spezifischer Agglu- J tination bei menschlichen Sera von 2% oder weniger ge- ! kennzeichnet ist. Die Erfindung ist insbesondere auf i einen verbesserten Partikelagglutinationstest für den schnellen Nachweis von Polyribophosphat (PRP), des j kapsulären Polysaccharids von Haemophilus Influenzae, j
Typ b, gerichtet. ;
' ι
Begrenzte Empfindlichkeit ist das Hauptproblem bei den j bisher beschriebener Methoden zum Nachweis des Antigens '
. 35 von Mikroorganismen. Als Folge kann bakterielles Antigen J
030064/0676
ORIGINAL INSPECTED
nicht bei allen Patienten mit belegten Infektionen nach-, gewiesen werden. Beispielsweise haben Versuche ergeben, j daß 7 bis 22% der Patienten mit H.i.b.-Meningitis, ] 38% mit H.i.b.Epiglottitis, 20 bis 39% mit bakterämischer 5 -\ Pneumonia mit Pneumokokken als Erreger und 50 bis 90% j mit nicht-bakterämischer Pneumonia mit Pneumokokken als |
Erreger kein nachweisbares Antigen im Serum oder in der ' cerebrospinalen Flüssigkeit aufweisen, wenn der Test mit Hilfe verfügbarer Gegenstrom-Immunelektrophorese oder ' 10 Partikelagglutinationstests durchgeführt wird. Ein Radio-.;. immuntest, der 0,5 ng/ml oder weniger nachzuweisen ver- j mag, ermöglicht jedoch die Diagnose wirklich aller Fälle ! von H.i.b.-Meningitis, wenn sie erstmals dem Arzt vorge-j ι führt werden. Die Testergebnisse zeigen ferner, daß die j '. 15 Konzentration des Antigens bei 37% der Patienten gerinqer
war als 10 ng/ml und daher unter der Empfindlichkeit ; 1 der meisten verfügbaren Gegenstrom-Immunelektrophorese- : ; Methoden lag.
; Gemäß der Erfindung wurde ein Partikelagglutinationstest ί 20 entwickelt, dessen Empfindlichkeitsgrad mit dem des > 1 Radioimmuntests vergleichbar ist. Der durch den Test '■ • gemäß der Erfindung erreichte hohe Empfindlichkeitsgrad 1 ergibt sich aus Modifikationen von bisher bekannten
Partikelagglutinationstests, nämlich aus der Auswahl j 25 eines spezifischen H.i.b.-Antiserums, aus der Verwendung j einer Globulinfraktion des Antiserums, dem Waschen des I sensibilisierten Partikels und der Verlängerung der '' Inkubationszeit des Partikelagglutinationstests von den üblichen 5 Minuten auf etwa 45 Minuten oder mehr.
30 a) Empfindlichkeit ;
j Die Wahl des Antiserums beeinflußt erheblich die Empfindj lichkeit des Tests. Sechs Antisera, die in drei Tier- : spezies gebildet wurden, bilden Partikel mit Empfindlichkeiten im Bereich von 0,2 bis mehr als 1000 ng Polyribo-' 35 phosphat pro ml. Die funktioneile Qualität des spezifi- ;
030064/0676
ORIGINAL INSPECTED
- ίο - I
sehen Antikörpers sowie seine Konzentration sind wichtig* Das Antiserum, das das empfindlichste Partikel bildet, ! hat, wie durch den Radioantigenbindungstest bestimmt, nicht die höchste Antikörperkonzentration.
Sechs Antisera gegen ganzen Haemophilus influenzae Typ b wurden in vier Kaninchen, einem Esel (Burro = kleiner Packesel) und einem Pferd nach den Immunisierungsplänen hergestellt, die von H.E. Alexander et al in Journal of Immunology 54 (1946) 207-211 beschrieben werden.
Der im Rahmen der Erfindung gebrauchte Ausdruck "Partikel" bedeutet Teilchen oder Partikel, die gegenüber den anderen Komponenten inert und neutral sind und Antisera in irreversibler Weise zu adsorbieren vermögen. Diese Partikel können Glasperlen, Polybutadien, Polystyrol, Butadien-Styrol-Copolymerisate usw. mit einer mittleren Teilchengröße von etwa 0,15 bis 0,9 um sein. Vorzugsweise werden Polystyrol-Latexpartikel mit einem gleichmäßigen Durchmesser von etwa 0,81 um als 10%ige (Gew./ Vol.) Suspension in destilliertem Wasser mit den vorstehend genannten Antisera wie folgt sensibilisiert:
Die ganzen Antisera von Esel und Kaninchen wurden jeweils im Verhältnis von 1:500 und das ganze Antiserum des \ Pferdes im Verhältnis von 1:200 in mit Glycin gepufferter Standard-Kochsalzlösung (0,1 M Glycin, 0,9% Natrium- j
chlorid, pH 8,2) verdünnt. Der Antikörper wurde an den j Latex-Partikeln durch Zusatz von 1 Teil 10%iger Latexsuspension zu 80 Teilen verdünntem Antiserum adsorbiert, worauf 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Freies Antiserum wurde dekantiert, nachdem Io Minuten bei 12000 G zentrifugiert worden war. Das Latexpellet wurde in mit Glycin gepufferter Kochsalzlösung mit einer geringen Menge Protein, d.h. je nach Lage des Falles mit 0,1% Humanserumalbumin oder 0,1% Esel-, Kaninchenoder Pferdeserum suspendiert, wobei eine 0,125%ige Latex-
suspension^ erhalten wurde, worauf erneut zentrifugiert ;
030064/0678
und in mit Glycin gepufferter Kochsalzlösung suspendiert\
wurde. Fetales Kalbsserum, das gemäß Radioimmuntest j keinen Anti-PRP-Antikörper enthielt, wurde als Verdünnungsmittel für Standardlösungen von PRP-Antigen ver- ι wendet.
Die Agglutination wurde durch Zusatz von aliquoten Teilen von 0,05 ml Antigen enthaltender Flüssigkeit zu 0,01 ml sensibilisierter Latexlösung auf einem serologischen Objektträger mit Keramikringen durchgeführt. Der Objektträger wurde in einer Feuchtkammer bei Umgebungstemperatur gedreht (180 UpM) und nach 45 Minuten auf Agglutination untersucht. Die Agglutination wurde mit 4+ eingestuft, wenn das Agglutinationsgemisch sich klärte und grobe Klumpen von Latexteilchen beobachtet wurden.
Sie wurde mit 3+ eingestuft, wenn das Gemisch trübe blieb, aber grobe Klumpen beobachtet wurden, und mit 2+, wenn das Gemisch trübe blieb, aber Körnigkeit leicht beobachtet wurde, und mit I+, wenn dak Gemisch trübe blieb, aber nur minimale Körnigkeit beobachtet wurde.
Agglutination von 2+ oder höher galt als positiv. Die Vergleichsempfindlichkeiten sind in Tabelle 1 genannt.
gegen 1 Anti-PRP- α Empfindlich-:
Antikörper keit des ;
Tabelle lutinationstests mit sechs ' an Latex- LPT·· '
Empfindlichkeit des Latexagg! Hemophilus Influenzae Typ b . Partikeln (ng PRP/ml) ;
Antisera Anti-PRP- ^ adsorbiert
Serum Antikörper (ug Ak.-Pro
im ganzen tein/ml LP·)
Serum (ug Ak.. 3,40 0,2 .
Protein/ml) 7,84 1,0 '
1 7,20 1,0 !
2 6,56 5,0
3 11.200 1,95 10,0
Esel 4 96.000 1,84 loop !
Kaninchen 68.000
45.000
10.300
3.100
Pferd
030084/0676
ORIGINAL INSPECTED
1) Durch Radioantigenbindungstest gemessen.
2) Niedrigste Konzentration von PRP-5 in fetalem Kalbsserum, die eine Agglutination von 2+ oder größer ergibt.
*LP = Latex-Partikel
•♦LPT = Latex-Partikeltest
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen eindeutig, daß die Qualität des Antiserums, das zur Sensibilisierung der Latex-Partikel verwendet wird, für die Empfindlichkeit des Latexagglutinationstests zum Nachweis von PRP-Antigen entscheidend wichtig ist. Eine Betrachtung der Ergebnisse in Tabelle 1 zeigt ohne weiteres, daß die Empfindlichkeit nicht ausschließlich auf der Grundlage der durch den Radioantigenbindungstest gemessenen
Konzentration von PRP im Antiserum vorausgesagt werden ■
kann. Ein Esel-Antiserum, das, bezogen auf das beste ι
Kaninchen-Antiserum, nur 12% Antikörper enthielt, ergab j
ein Latexpartikelpräparat mit fünffach höherer Empfind- i lichkeit. Dieser Unterschied in der Empfindlichkeit
j 20 konnte nicht durch wirksamere Umhüllung der Latexteilchen mit Esel-Antikörper erklärt werden, da Latexteilchen, die mit Kaninchen-Antiserum umhüllt waren, 2,3mal mehr adsorbierende Antikörper enthielten. Die Agglutina-i tionsaktivität von Esel- und Kaninchen-Antiserum für rote Blutzellen des Schafs, die mit PRP umhüllt waren, war trotz der viel höheren Konzentration von PRP-Bin-
dungsaktivität im Kaninchen-Antiserum gleich. j
Die Messung der Assoziationsgeschwindigkeiten zeigt, daß ■ Esel-Antikörper sich viel schneller als Kaninchen-Antikörper mit PRP-Antigen bindet. Die Assoziations-Halbwertzeit beträgt 20 Minuten für Esel-Antikörper und mehr als 60 Minuten für Kaninchen-Antikörper. Der Grund für diesen Unterschied in der Assoziationsgeschwindigkeit ist unbekannt.
030 0 6 4/0678
/"Μ3Ι/ΊΙΜΛΙ
Die Dissoziationsgeschwindigkeit von Antigen-Antikörper-;
Komplexen in Gegenwart von überschüssigem Antigen ist I ein Maß der Festigkeit der Bindung oder Affinität des i Antikörpers. Der Kaninchen-Antikörper dissoziiert · ' langsamer von Polyribosephosphat, als dies bei Esel- j Antikörper der Fall war, und hat daher eine höhere j Affinität zum Antigen. Dieses Ergebnis stützt die Hypothese, daß die Geschwindigkeit der Bindung von Antigen
und Antikörper bei Agglutinationsprozessen viel bedeutsamer ist als die Stärke der Antigen-Antikörper-Wechsel-
wirkung. !
b) Verwendung der Makroglobulinfraktion zum Umhüllen | von Latex-Partikeln ι
; Die Molekularsieb-Chromatographie verschiedener tieri-
; 15 scher Antisera gegen bakterielle Polysaccharide ergab,
j daß die Mehrzahl der Anti-Polysaccharid-Antikörper bei
' den pferdeartigen Tieren (Esel, Pferd) sich in der
Makroglobulinklasse findet, die im Zwischenraumvolumen
ί dieser Säule eluiert. Im Gegensatz hierzu befindet sich
20 die Mehrzahl der Kaninchen-Antikörper in der IgG-Klasse,
die später eluiert. Wie Tabelle 2 zeigt, kann die Verwendung der Makroglobulinfraktion von Esel- oder Pferde-Antiserum bei einer Konzentration von 50 ug Protein/ml , zur Sensibilisierung von Latex-Partikeln die Empfind] ich-' keit von verhältnismäßig schwachen Antisera von pferde- I artigen Tieren deutlich verbessern. Die Empfindlichkeit , der besten Antisera wird durch diese Modifikation nicht | ! weiter verbessert, obwohl die Deutlichkeit der Aggluti- !' nationsreaktion im allgemeinen bei der Zwischenraum- i volumenfraktion besser ist. Die Verwendung der IgG-
Fraktion von Kaninchensera ergibt keine vergleichbaren
, Verbesserungen in der Empfindlichkeit oder Klarheit oder
j Deutlichkeit der Agglutination. ;
030064/0B78
ORIGINAL INSPECTED
- 14 -
Tabelle
Vergleich der Empfindlichkeiten von Latex-Partikeln, die mit ganzem Serum oder der Makroglobulinfraktion von Equinus-Antisera gegen bakterielle Polysaccharide umhüllt sind.
Tier
Antiserum gerichtet gegen
Empfindlichkeit* von mit ganzem Serum umhüllten LP··
(Verdünnung 1:500) nq/ml
Empfindlichkeit von LP, die mil: Makroglobulinfraktion umhüllt sind (50 ug Protein/
ml) ng/ml
Burro-F
H.Influenzae
1
0,2
Typ b
Burro-132 ■ H.Influenzae Typ b
Burro-W.J. H.Influenzae Typ b
Burro-Y Neisseria meningitidis Gruppe Y
Pferd-49 N.meninqitidis
Gruppe A 0,5
Pferd-46 N.meninqitidis
Gruppe B >10.000
0,2
0,2
0,5
0,2
0,2
•Die niedrigste Antigenkonzentration, die Agglutination 2 oder höher hervorruft, ist angegeben.
♦•LP = Latex-Partikel
c) Waschen von umhüllten Latex-Partikeln
Um eine weitere Verbesserung der Empfindlichkeit der Burro-Antisera zu erzielen, werden die mit Antikörper umhüllten Latex-Partikel, die mit Burro-Antiserum in verschiedenen Verdünnungen in Glycin-gepufferter Kochsalzlösung umhüllt sind, ungewaschen und nach einer, zwei und drei Wäschen mit glycingepufferter Kochsalzlösung, die 1/1000 Teile fetales Kalbsserum enthält, verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.
030084/057«
ORiG[NAL [JSföPECTED
10
15
20
25
30
! 35
- 15 -
Tabelle 3
Einfluß der Verdünnung des Antiserums und des Waschens von Latex-Partikeln auf die Empfindlichkeit des Latex-Aqqlutinationstests für Polyribosephosphat
Verdünnung von zur Sensibilisierung von Latex-Partikeln verwendetem Burro-Antiserum
Nachgewiesene Mindestkonzentration von PRP* (nq/ml)
Ungewaschen
1 Wäsche 2 Wäschen 3 Wäschen
1/10
1/100
1/500
1/1000
1/2000
1/5000
0,5
0,2
>1000
>1000 >1000
0,5
0,2
0,2
0,2
>1000
0,5 0,2 0,2 0,2 >1000
>1000 0,5 0,2 0,2 0,5
>1000
♦Agglutination von 2+ oder mehr wurde als positives Ergebnis angesehen.
Wie die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, sind geringe Verdünnungen des Antiserums unempfindlich. Bei Verdünnungen von 1:500 und mehr wird maximale Empfindlichkeit erreicht, vorausgesetzt, daß die Latex-Partikel gewaschen sind. Ungewaschene Latex-Partikel erreichten maximale Empfindlichkeit nur in einem engen Bereich von Verdünnungen. Zwei Wäschen ergaben maximale Empfindlichkeit, während drei Wäschen zu verringerter Empfindlichkeit führen können.
Sensibilisierte Latexteilchen aus dem Waschversuch wurden bei 4°C aufbewahrt und nach 12 und 24 Monaten erneut getestet. Latex-Partikel, die mit Burro-Antiserum in Verdünnungen von 1:500 und 1:1000 sensibilisiert und zweimal gewaschen worden waren, bewahrten ihre ursprüngliche Empfindlichkeit, während ungewaschene Latexteilchen nach 24 Monaten 2- bis 4mal weniger empfindlich waren.
030064/0676
ORIGINAL INSPECTED
302268Ί
d) Dauer der Inkubationszeit
Die Abbildung veranschaulicht die Beziehung der Empfindlichkeit des Tests zur Inkubationszeit. Durch hohe Konzentrationen des Antigens wurden die Latex-Partikel 5 innerhalb von 5 Minuten agglutiniert. Die Empfindlich-■ keit stieg während der ersten 45 bis 60 Minuten schnell, j anschließend langsamer und erreichte ein Maximum von ' 0,05 ng/ml bei den empfindlichsten Präparaten nach 10 Stunden. Das Equinusserum gemäß der Erfindung war bei allen Inkubationszeiten empfindlicher als das Kaninchen-Serum. Die Vergleichsuntersuchung wurde wie folgt durchgeführt: 50 ul der Probelösung und 10 ul umhüllte Latex-Partikel, die nachstehend beschrieben werden, wurden auf einem serologischen Objektträger gemischt und bei Raumtemperatur mit 180 UpM gedreht. Die Objektträger wurden bedeckt, und die Feuchtigkeit wurde mit Schwämmen, die mit heißem Wasser getränkt waren, aufrecht erhalten. Die Objektträger wurden zu den genannten Zeiten beobachtet.
Eine Verlängerung der Inkubationszeit von 5 Minuten auf ,' 45 Minuten oder länger hat eine 10- bis 20-fache Steigej rung der Empfindlichkeit zur Folge. Für praktische , klinische Zwecke wurde eine Inkubationszeit von 45 Minuten, bei der normalerweise in Abständen von 5 bis 15 ι 25 Minuten abgelesen wurde, bei Verwendung von Latex—Par-
tikeln gewählt, die mit einem Equinus-Antiserum umhüllt waren. Diese Latex-Partikel hatten eine Empfindlichkeit von 0,2 ng Antigen/ml Flüssigkeit.
Es wurde erwartet, daß ■ die Steigerung der Empfindlich- j keit der Partikel-Agglutinationstests auch zu vermehrtem i Auftreten von nicht-spezifischen Agglutinationen führen ' würde, und tatsächlich agglutinierten im Falle von | Serumproben 69% der Sera von Kindern, die sich statio- ; när im Krankenhaus befanden, diese Latex-Partikel.
Dieser große Nachteil begrenzte bisher die weit ver-
- Ö3006A/087S
ORIGINAL INSPECTED
breitete Anwendung dieser Bestimmung. Faktoren, die bei j der Agglutination von mit Gammaglobulinen umhüllten Latex-Partikeln eine Rolle spielen, sind wärmelabile Serumkomponenten (vermutlich Komplement) und wärmestabile Antiglobuline, die in niedrigen Konzentrationen gewöhnlich in Humansera insbesondere von Patienten mit chronischen Entzündungskrankheiten zu finden sind.
Eine nicht-spezifische Agglutination wurde durch Agglutination von Kontrollatex-Partikeln erkannt, die mit ganzem tierischem Nicht-Immunserum sensibilisiert waren, Bei Verwendung von mit Makroglobulin umhüllten Latex-Partikeln werden die Kontroll-Latex-Partikel mit der Makroglobulinfraktion von Nicht-Immunserum umhüllt.
Gemäß der Erfindung wurde die Häufigkeit von nicht-spezifischer Agglutination bei Humansera auf 2% oder weniger verringert durch (I) Zusatz von tierischem Nicht-Immunserum zu den sensibilisierten Latex-Partikeln, (II) Zusatz eines Serumpuffers, der ein Polyanion und/oder ein Reduktionsmittel enthält, direkt zum Inkubationsgemisch und/oder (III) durch Wärmeinaktivierung der SeraJ
Das Auftreten nicht-spezifischer Agglutination wurde an Sera bestimmt, die von stationär im Krankenhaus befindlichen Kindern und erwachsenen Patienten, die nicht an Haemophilus influenza Typ b litten, entnommen wurden. Alle Sera wurden mit Latex-Partikeln, die mit Burro-Antiserum (Anti-PRP-LP) und mit Latex-Partikeln, die mit
Inunun-
Nichti-Burroserum (Kontroll-Latex-Partikel) sensibilisiert waren, getestet.
Bei Vorversuchen wurden Sera, die wärmebeständige Agglutinine enthielten, mit Zusatz von 10 ul eines Reduktionsmittels wie 1,4-Dithiothreit (DTT) oder 2-Mercaptoäthanol (ME), das dem Inkubationsgemisch zu • Beginn der Inkubation zugesetzt wurde, getestet. Optimal waren Konzentrationen von 0,018 M für DTT und 0,35 M für
030064/0876
ORIGINAL INSPECTED
ME (die Endkonzentrationen im Inkubationsgemisch betrugen 0,0026 M bei DTT und 0,05 M bei ME).
! In der folgenden Tabelle 4 sind die Ergebnisse zusammengestellt, die mit 104 pediatrischen Sera, die vor dem Test wenigstens 24 Stunden bei 4°C gehalten worden waren erhalten wurden.
Tabelle 4
Auftreten von nicht-spezifischer Agglutination bei gelagerten Sera"! von Kindern mit stationärem Krankenhausaufenthalt ohne die Krankheit Haemophilus influenzae
Typ b
Agglutination mit Anti-PRP-LP negativ positiv negativ positiv
Agglutination 'mit Kontroll-LP negativ positiv positiv negativ
j Keine Behandlung des Se-' 20 rums (N=104) 32(31%) 65(63%) 3 (3%) 4 (4%)
j Inaktivierung des Serums mit Wärme (n=104) 49(47%) 47(45%) 1 (1%) 7 (7%)
Zusatz von normalem Burro-Serum (2,5%) zu LP (n=104) 72(69%) 23(22%) 7 (7%) 2 (2%)
Inaktivierung des Serums mit Wärme und Zusatz von ι normalem
Burro-Serum
(2,5%) zu LP ; (n = 104) 75(72%) 23(22%) 5 (5%) 1 (1%)
; Zusatz von
[ normalem
Burro-Serum (2,5%) zu LP
und Zusatz
von DTT^ zum
Serum (n=53)3> 52(99.%) 1 (2%)
030064/0678
. ORlGrNfALiNSPECTED
- 19 -
-1
Vor dem Test wenigstens 24 Stunden bei 4°C gehalten.
Dithiothreit, Endkonzentration 0,0026 M im Inkubationsgemisch.
3
Nur 53 von 104 Proben enthielten genügend Serum für diesen Test.
69% der Sera riefen eine nicht-spezifische Agglutination mit Anti-PRP hervor, und alle mit Ausnahme von 4% wurden durch Kontroll-LP identifiziert.
Durch Inaktivierung durch Wärme (15 Minuten bei 60°C) wurde das Auftreten der nicht-spezifischen Agglutination nur geringfügig auf 53% verringert, und durch Zusatz von Nicht-Immunburroserum sowohl zu Anti-PRP als auch Kontroll-LP wurde die nicht-spezifische Agglutination auf 31% verringert. Der Zusatz von 10 ul eines
j 15 Reduktionsmittels, nämlich Dithiothreit, verringerte das Auftreten von nicht-spezifischen Reaktionen auf 2%. Die Ergebnisse, die bei 52 gelagerten Sera von Erwachsenen erhalten wurden, waren ähnlich. Nur ein Serum ergab eine nicht-spezifische Agglutination (positiv bei Anti-PRP-LP und Kontroll-LP), wenn 2,5 N-Burroserum den
j Latex-Partikeln und DTT dem Inkubationsgemisch zugesetzt wurde.
Um zu ermitteln, ob frische Sera eine höhere Rate von nicht-spezifischer Agglutination ergeben, wurden 100 Sera von Erwachsenen gewonnen, unmittelbar auf Eis j gelegt und am gleichen Tag getestet. Jeies Serum wurde j mit und ohne Reduktionsmittel (ME) und mit und ohne
Inaktivierung durch Wärme (5 Minuten bei 600C) getestet. i
Die Agglutination wurde mit Anti-PRP-LP und Kontroll-LP, | die je 2,5% normales Burro-Serum enthielten und in allen j Fällen korrespondierten, getestet. Die Muster der Agglu- ; tination sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. ι
030054/0676
ORIGINAL INSPECTED
Tabelle 5
Nicht-spezifische Agglutination mit frischen Sera von 100 Erwachsenen ohne die Krankheit Haemophilias influenza Typ b^
Muster
Keine Wärme-Inaktivierunc kein ME ME2
Inaktivierung Zahl Auswertung durch Wärme ? der
kein ME ME Sera
1.
43
2, 3. 4.
28
14
10
keine Antiglobuline, kein Komplement
Nur Antiglobuline
Nur Komplement
Nur Komplement (durch ME "reaktiviert")
Antiglobuline und Komplement
Zahl der Sera, die nichtspezifi sche Agglutination ergeben
42
38
1)
2)
Alle Tests wurden mit Anti-PRP und Kontroll-LP durchgeführt, die 2,5% normales Burro-Serum enthielten. Die Übereinstimmung der Ergebnisse mit Anti-PRP und Kontroll-LP stimmten vollständig überein.
2-Mercaptoäthanol, Endkonzentration im Inkubationsgemisch 0,05 M.
Ö30064/0S7S
42% der unbehandelten Sera (keine Wärme, kein Reduktions-i mittel) ergaben eine nicht-spezifische Agglutination. Bei Zusatz eines Reduktionsmittels (ME) wurden 28 der | Sera negativ (Muster 2), ein Zeichen für die Anwesenheit! von Antiglobulinen. 14 Sera, die anfänglich negativ waren, wurden positiv (Muster 4), ein Zeichen, daß ein wärmelabiles Agglutinin durch Mercaptoäthanol reaktiviert war. Die reine Wirkung von ME allein bestand in der Verminderung nicht-spezifischer Agglutination auf 38%. Eine ähnliche Rate der nicht-spezifischen Agglutination wird durch Inaktivierung durch Wärme allein erreicht. Die Kombination von Inaktivierung der Sera durch Wärme und des Zusatzes eines Reduktionsmittels zum Inkubationsgemisch verringerte jedoch das Auftraten von nicht-spe-15 zifischer Agglutination auf eine Größenordnung von 2% oder weniger.
j Da die Inaktivierung durch Wärme zeitraubend ist, wurde j eine andere Methode zur Ausschaltung der nicht-spezifii
sehen Agglutination durch wärmelabile Serumfaktoren ent-ι wickelt. Verschiedene Polyanionen einschließlich Natriumpolyanetholsulfonat (SPS), Dextransulfat, Carrageenin '
und Heparin verhindern die nicht-spezifische Agglutina- J tion von mit Globulin umhüllten Latex-Partikeln durch j wärmelabile Serumfaktoren. !
100 frische Sera von Erwachsenen wurden mit einem Serumpuffer getestet, dersowohl ME (wie oben) als auch SPS
in einer Konzentration von 0,05% enthielt. Nur eines der;
i 100 Sera ergab eine nicht-spezifische Agglutination mit ; Anti-PRP und Kontroll-LP. Nicht-spezifische Agglutina- ! tion bei diesem Serum wurde durch Erhitzen ausgeschaltet;
Zweckmäßig wird ein Serumpuffer, der sowohl ein Reduk- !
tionsmittel als auch ein Polyanion enthält, dem Inkuba- j tionsgemisch aus einem stabilisiertem sensibilisierten
Latex-Partikel und einer Serumprobe zugesetzt. Ein j
030064/0676
ORIGINAL INSPECTED
solcher Serumpuffer wird wie folgt hergestellt:
Man verdünnt 14-molares 2-Mercaptoäthanol (Standardlösung von voller Stärke) im Verhältnis von 1:40 in glycingepufferter Kochsalzlösung (GBS) (0,1 M Glycin, 0,9% Natriumchlorid, pH 8,2). Man verdünnt 5%ige wässrige Lösung von Polyanetholsulfonat im Verhältnis von 1:100 in der gleichen glycingepufferten Kochsalzlösung.
An Stelle von 2-MercaptoMthanol kann der Serumpuffer auch andere Reduktionsmittel enthalten, z.B. Dithiothreit, Glutathion und Cystein. Darüber hinaus können andere Polyanionen wie Dextransulfat, Heparin und Carrageenin u.dgl. verwendet werden, solange sie die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht stören.
In der folgenden Tabelle 6 ist die optimale Konzentration der Reagentien im Serumpuffer genannt. Durch höhere Konzentrationen der Reduktionsmittel oder Polyanionen wurde die Empfindlichkeit des Tests verschlechtert, und durch niedrigere Konzentrationen wurde eine nicht-spezifische Agglutination nicht ausgeschaltet. Dies gilt für alle Sera.
Tabelle 6 Optimale Konzentrationen der Reaqentlen im "Serumpuffer"
DTT
2-ME
SPS
(Endkonzentrationen im Testgemisch)
Verringerte Empfindlichkeit 12,8 mM 400 mM 0,07%
Gute Empfindlichkeit +
Ausschaltung der nichtspezifischen Agglutination 2,6 mM 50 mM 0,007%
Keine Ausschaltung der
nicht-spezifischen Agglutination O,65mM 10 mM 0,0007%
DTT = Dithiothreit 2-ME = 2-Mercaptoäthanol SPS = Natriumpolyantitholsulfonat
030064/067S ORIGINAL INSPECTED
Die effektive Konzentration von tierischem Nicht-Immunserum in der Latexsuspension wurde im Testsystem unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Serumpuffers überprüft.
Konzentrationen von tierischem Nicht-Immunserum von weniger als 0,25% in der Partikelsuspension (weniger als 0,035% im endgültigen Testgemisch) ergaben gelegentliche nicht-spezifische Agglutination trotz der Verwendung des Serumpuffers.
Konzentrationen von tierischem Nicht-Immunserum bis etwa 25% in der Latexsuspension (3,5% im endgültigen Testgemisch) sind wirksam hinsichtlich der Verringerung des Auftretens von nicht-spezifischer Agglutination, jedoch wurde durch die höchste Konzentration, nämlich 25%, die Empfindlichkeit des Tests für Polyribophosphat um das 2-fache verringert.
Nicht-spezifische Agglutination in anderen Körperflüssigkeiten I
ι Die meisten Urinproben ergeben nicht-spezifische Agglu-20 tination mit Anti-PRP und Kontroll-LP. Dies kann entweder durch Erhitzen (5 Minuten bei 100°C) oder durch Filtration des Urins ausgeschaltet werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird ein 0,45 um-Filter verwendet.
Bei Proben der cerebrospinalen Flüssigkeit tritt sehr
ι selten nicht-spezifische Agglutination ein, die durch ι
j Erhitzen (5 Minuten bei 1000C) ausgeschaltet wird. Das
, PRP-Antigen ist gegenüber den vorstehend genannten Maß- !
j nahmen des Erhitzens und der Filtration beständig. J j i
J 30 Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird durch das folgende spezielle Beispiel beschrieben.
030064/0676
ORIGINAL INSPECTED
- 24 -
a) Umhüllen oder Beladen von Latex-Partikeln
Zur Herstellung von Anti-PRP-Latexpartikeln wird ganzes Burro-Antiserum gegen H.Influenzae Typ b im Verhältnis von 1:500 in glycingepufferter Kochsalzlösung (GBS) verdünnt und 30 Minuten auf 56°C erhitzt. 1 Teil Latexsuspension (eine 10%ige Suspension von Partikeln von 0,81 um Durchmesser in destilliertem Wasser) wird zu 80 Teilen verdünntem Antiserum bis zu einer Endkonzentration der Latexpartikel von 0,125% gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und 10 Minuten bei 12000 G zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Das Pellet wird erneut in dem gleichen Volumen der glycingepufferten Kochsalzlösung, die 0,1% Nicht-Immunburroserum enthält, suspendiert, in der vorstehend beschriebenen Weise erneut zentrifugiert und dann erneut in einem gleichen Volumen von glycingepufferter j Kochsalzlösung, die 2,5% Nicht-Immunburroserum enthält, suspendiert. Kontroll-Latexpartikel werden in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt, wobei jedoch Nicht-Immunburroserum, das mit glycingepufferter Kochsalzlösung im Verhältnis von 1:500 verdünnt worden ist, ι verwendet wird, um die Latexteilchen erstmals zu umhüllen. Das in jedem Fall verwendete Nicht-Immunburroj serum sollte ein Serum sein, das vor der Immunisierung , 25 vom gleichen Tier, das immunisiert wurde, gewonnen wurde,
Wenn die Makroglobulinfraktion zu verwenden ist, werden das ganze Nicht-Immunserum und das Immunburroserum an einer Gelfiltrationssäule der Handelsbezeichnung "Sephacryl G-200" chromatographiert, und die im Zwischen-; raumvolumen der Säule eluierenden Fraktionen werden zusammengegossen. Die zusammengegossenen Fraktionen des Zwischenkornvolumens werden dann nach Verdünnung auf eine Proteinkonzentration von 50 jug Protein pro ml in glycingepufferter Kochsalzlösung für verdünntes ganzes Serum bei der vorstehend beschriebenen Methode substituiert.
030064/0676
ORIGINAL INSPECTED
- 25 -
b) Herstellung von Serumpuffer
Man verdünnt 14-molares 2-Mercaptoäthanol (Standardlösung von voller Stärke) mit GBS im Verhältnis von 1:40. Man gibt Natriumpolyanetholsulfonat bis zu einer Endkonzentration von 0,05% zu.
c) Bestimmunqsmethode
Die Bestimmungsmethode gemäß der Erfindung wird wie folgt durchgeführt:
Je 50 AiI positives Kontroll serum, negatives Kontrollserum und jeweils Proben jedes Serums, jeder cerebrospinalen Flüssigkeit und Urinproben, die zu testen sind, gibt man in jedes von zwei Zuführungsgefäßen eines sauberen, trockenen serologischen Objektträgers gemäß dem nachstehenden Schema. Das positive Kontrollserum enthält 2 ng PRP-Antigen/ml. Das negative Kontrollserum enthält Antiglobuline, die sowohl Anti-PRP-LP und Kontroll-LP I agglutinieren, wenn kein SB zugesetzt wird, so daß eine j Überprüfung der Aktivität des Serumpuffers gegeben ist. Urinproben werden mit einem 0,45 um-Filter vorfiltriert,
Positives Negatives Test- Test- Urin-
Kontroll- Kontroll- serum CSF probe serum serum
Reihe A: s~>.
Anti-PRP-LP (SP) (SP
O O O O
SP = Zusatz von Serumpuffer
25 Reihe B:
Kontroll-LP (SP) (SP
Man gibt 10 ul Serumpuffer zu jedem Zuführungsgefäß, das positives Kon troll serum, negatives Kontrollserum oder
j 30 eine Serumprobe enthält. Die Latexsuspensionen werden ! ohne Schaumbildung sachte gemischt, und 10 u\ Anti-PRP- : Latexpartikel werden zu einem Zuführungsgefäß jedes
: Paares (Reihe A) geqeben, worauf die Reagentien gut gemischt werden.
030064/0676 ORIGINAL
! I
10 ajI Kontroll-Latexpartikel werden zum zweiten Zufüh-
j rungsgefäß jedes Paares gegeben, worauf die Reagentien ι
gut gemischt werden. Der Objektträger wird auf eine serologische Schüttelvorrichtung gelegt und etwa 45 Minuten gedreht. Die Kammer sollte durch Schwämme, die mit heißem Wasser getränkt sind, so befeuchtet werden, daß Kondensation während des gesamten Versuchs sichtbar ist. Der Objektträger wird aus der Kammer genommen. Kondensat wird abgewischt, und die Agglutination wird ermittelt, während der Objektträger in schräg einfallendem Licht nach hinten und vorn über einem schwarzen Hintergrund gekippt wird. Die folgende Bewertung wird vorgenommen:
4+ .- große Klumpen - klarer Hintergrund
3+. große Klumpen - milchiger Hintergrund
2+ kleine Klumpen
1+ feinkörnig
0 milchig
Die Reaktionen 3+ und 4+ müssen leicht von den Kontrollen unterscheidbar sein, wenn der Objektträger auf Armlänge betrachtet wird. Reaktionen mit der Bewertung 2+ erfordern genauere Untersuchung und Betrachtung.
_ ι
! Auswertung der Ergebnisse: J
ι Haemophilus LP Kontroll-LP Auswertung j
ι
25 (+) (_) positiv für H.influenzae
Typ b-Antigen
C-) C-) negativ für H.influenzae
Typ b-Antigen
C+) C+) nicht-spezifische Agglu-
tination. H.influenzae
Typ b-Antigen kann vorhanden sein oder nicht.
Positive Agglutination mit der Bewertung 2+ sollte als "schwach positiv" angegeben werden. ;
030064/0676
ORIGINAL INSPECTED
Die hier genannten Zeiten und Temperaturen, die während der Wärmebehandlung und Inkubation angewandt werden, sind optimal, wobei zu bemerken ist, daß die gleichen Ergebnisse bei höheren Temperaturen in kürzerer Zeit oder umgekehrt bei niedrigeren Temperaturen in längerer Zeit erhalten werden können. Ferner sind in der vorstehenden Beschreibung Reagentien, Mittel und Methoden genannt, die zur Sicherstellung der Durchführbarkeit der Erfindung angewandt wurden, jedoch ist es für den Fachmann einleuchtend, daß Änderungen der Methoden, Zeiten, Mengen und Arten von Materialien, Mitteln und Apparaturen möglich sind, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
030064/0676
ORIGINAL INSPECTED
Leerseite

Claims (25)

  1. VON KREISLER SCHÖNWALD EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER
    PATENTANWÄLTE
    Dr.-Ing. von Kreisler t 1973
    Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln
    Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden
    Dr. J. F. Fues, Köln
    Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln
    Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln
    Dipl.-Ing. G. Selting, Köln
    Dr. H.-K. Werner, Köln
    DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF
    D-5000 KÖLN 1
    AvK/Ax 16.Juni 198o
    George R. Siber,
    Corey Road, Brookline, Massachusetts (U.S.A.).
    Patentansprüche
    ν DjVerfahren zur Herstellung eines Reagens, das Agglutination bewirkt, wenn es mit Antigene enthaltenden Körperflüssigkeiten in Berührung kommt, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a) eine Antigenmenge einer Tier-Spezies injiziert und ein Antiserum gegen das Antigen in der Tier-Spezies sich bilden läßt,
    b) das in dieser Weise gebildete Antiserum gewinnt,
    c) das Antiserum mit einem verträglichen physiologischen Puffersystem verdünnt,
    d) die hierbei erhaltene Antiserumlösung mit einer Suspension von Partikeln mischt,
    e) die Suspension inkubiert,
    f) die Suspension zentrifugiert und nicht adsorbiertes Antiserum dekantiert,
    g) das erhaltene Sediment in einem verträglichen physiologischen Puffersystem erneut suspendiert
    03006Α/0878
    Telefon: (0221) 131041 · Telex: .1WJ2307 dopa d · Telegramm: Dompalent Köln
    ORIGINAL INSPECTED
    ! und
    ι h) das Sediment erneut zentrifugiert und das Sediment
    j im Puffersystem, das Nicht_Immuntierserum der gleichen Spezies, die das Antiserum bildete, enthält, erneut suspendiert.
  2. 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tierspezies eine Pferde-(equinus) Spezies ist.
  3. 3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Pferde-Spezies der Esel (Burro) ist.
  4. r 4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antigen ein Polysaccharid verwendet.
  5. 5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Partikel Polystyrolpartikel mit einer·mittleren Teilchengröße von etwa 0,15 bis 0,9 um verwendet.
  6. 6) Verfahren zur Herstellung eines Reagens, das Agglutination hervorruft, wenn es mit Polysaccharide enthaltenden Körperf liissigkeiten in Berührung gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß man
    a) eine Menge eines Polysaccharids einem Tier der Pferde-Spezies injiziert und das Antiserum gegen das Antigen, sich bilden läßt,
    b) das hierbei gebildete Antiserum gewinnt,
    j c) Makroglobulinfraktionen mit hohem Titer aus dem
    ; gewonnenen Antiserum auswählt,
    d) die Fraktion mit einem verträglichen physiologischen
    ; Puffersystem verdünnt, ■
    ' i
    e) das verdünnte Antiserum mit einer wässrigen Partikel- ;
    suspension zusammengibt,
    f) die Suspension inkubiert, '
    g) die Suspension zentrifugiert und nicht adsorbiertes ' Antiserum dekantiert, I
    030004/087«
    fAB Inspected
    h) das erhaltene Sediment in einem verträglichen physiologischen Puffersystem erneut suspendiert und
    i) das Sediment erneut zentrifugiert und im Puffersystem, das Nicht-Immunpferdeserum enthält, erneut suspendiert.
  7. 7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid Polyribophosphat, das kapsuläre Polysaccharid von Haemophilus Influenzae Typ b ist.
  8. 8) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Pferde-Spezies der Esel (Burro) ist.
  9. 9) Flüssiges Reagens, das die Fähigkeit zur Agglutination hat, wenn es mit Flüssigkeiten, die Antigene enthalten, in Berührung gebracht wird, gekennzeichnet durch einen Träger, der mit tierischem Antiserum gegen die Antigene umhüllt und in einem verträglichen physiologischen Puffersystem und Nicht-Immunserum der gleichen Tier-Spezies, die das Antiserum bildete, suspendiert ist. ι
  10. 10) Flüssiges Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich- | net, daß das Antigen ein Polysaccharid ist. j
  11. 11) Flüssiges Reagens nach Anspruch 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum ganzes Equinus-Antiserum ist.;
  12. 12) Flüssiges Reagens nach Anspruch 9 bis 11, dadurch ge- j
    kennzeichnet, daß das Equinus-Antiserum die Makroglobu-
    linfraktion von Equinus-Antiserum ist. ,
  13. 13) Direkter Agglutinationstest zum Nachweis von Antigenen in Körperflüssigkeiten, in denen die Anwesenheit dieser ■ Antigene vermutet wird, dadurch gekennzeichnet, daß [ man eine Probe der Körperflüssigkeit aus der aus Serum oder Plasma bestehenden Gruppe mit dem flüssigen Reagens j nach Anspruch 9 bis 12 und einem Puffersystem zusammen- ; führt, das ein Polyunion, das den Effekt von wärmelabi- ;
    030064/0878
    ORIGINAL INSPECTED
    -A-
    len Bestandteilen der Probe zu vermindern vermag, und ein Reduktionsmittel, das Antiglobulin-Antikörper in der Probe zu reduzieren vermag, enthält, das Gemisch inkubiert und anschließend den Grad der Agglutination visuell bestimmt.
  14. 14) Test nach Anspruch 13; dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation während einer Zeit von 45 Minuten oder länger durchführt.
  15. 15) Direkter Agglutinationstest nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyanion aus der aus
    j Natriumpolyanetholsulfonat, Dextransulfat, Carrageeenin
    i und Heparin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
    {
  16. 16) Direkter Agglutinationstest nach Anspruch 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Reduktionsmittel ', 2-Mercaptoäthanol, Dithiothreit, Glutathion und/oder ; Cystein verwendet,
    J
  17. 17) Direkter Agglutinationstest zum Nachweis von Antigenen j in Körperflüssigkeiten aus der aus Serum und Plasma
    bestehenden Gruppe, in denen die Anwesenheit der Antigene1 j vermutet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die ! Körperflüssigkeit erhitzt und die wärmebehandelte Körper-I
    ι ι flüssigkeit mit einem Reduktionsmittel, das den Anti- |
    I globulin-Antikörper in der Körperflüssigkeit zu redu-
    i zieren vermag, und dem flüssigen Reagens gemäß Anspruch 9
    ! bis 12 zusammenführt, das Gemisch inkubiert und an- j
    ι schließend den Grad der Agglutination visuell bestimmt, j
  18. 18) Agglutinationstest nach Anspruch 17, dadurch gekenn- ; ι zeichnet, daß man als Reduktionsmittel 2-Mercaptoäthanol,1 ! · Dithiothreit, Glutathion und/oder Cystein verwendet.
  19. 19) Direkter Agglutinationstest nach Anspruch 17 oder 18, j dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation während j einer Zeit von 45 Minuten oder länger durchführt. j
    030064/0678
    9RIG/NAL INSPECTED
  20. 20) Direkter Agglutinationstest zum Nachweis von Antigenen in cerebrospinalen Flüssigkeiten, in denen die Anwesenheit der Antigene vermutet wird, dadurch gekennzeichnet,, daß man die Körperflüssigkeit mit dem flüssigen Reagens nach Anspruch 9 bis 12 inkubiert und anschließend den Grad der Agglutination visuell bestimmt.
  21. 21) Direkter Agglutinationstest nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation während einer Zeit von 45 Minuten oder länger durchführt.
  22. 22) Direkter Agglutinationstest zum Nachweis von Antigenen in Urinproben, dadurch gekennzeichnet, daß man eine filtrierte Urinprobe mit dem flüssigen Reagens nach Anspruch 9 bis 12 zusammengibt, das Gemisch inkubiert und anschließend den Grad der Agglutination bestimmt.
  23. 23) Direkter Agglutinationstest nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Urinprobe durch ein 0,45 umFilter filtriert.
  24. 24) Direkter Agglutinationstest nach Anspruch 22 und 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die Urinprobe vor der Inkubation erhitzt.
  25. 25) Direkter Agglutinationstest nach Anspruch 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation während einer Zeit von 45 Minuten oder länger durchführt.
    !
    0300B4/0B76
    OPlGlMAl, INSPECTED
DE19803022681 1979-06-19 1980-06-18 Verfahren zur herstellung eines reagens, das agglutination bewirkt und direkter agglutinationstest fuer koerperfluessigkeiten Granted DE3022681A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/050,269 US4310508A (en) 1979-06-19 1979-06-19 Diagnostic test and reagent therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3022681A1 true DE3022681A1 (de) 1981-01-22
DE3022681C2 DE3022681C2 (de) 1992-07-30

Family

ID=21964303

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19803022681 Granted DE3022681A1 (de) 1979-06-19 1980-06-18 Verfahren zur herstellung eines reagens, das agglutination bewirkt und direkter agglutinationstest fuer koerperfluessigkeiten

Country Status (16)

Country Link
US (1) US4310508A (de)
JP (1) JPS5631648A (de)
AU (1) AU538062B2 (de)
BE (1) BE883905A (de)
CA (1) CA1138331A (de)
CH (1) CH646524A5 (de)
DE (1) DE3022681A1 (de)
DK (1) DK166234C (de)
FI (1) FI68468C (de)
FR (1) FR2459480B1 (de)
GB (1) GB2052059B (de)
IT (1) IT1129088B (de)
NL (1) NL191323C (de)
NO (1) NO153910C (de)
SE (1) SE448577B (de)
ZA (1) ZA803473B (de)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3206729A1 (de) * 1982-02-25 1983-09-01 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Immunologisches agglutinationsverfahren
US4403042A (en) * 1982-08-19 1983-09-06 Miles Laboratories, Inc. Detection of cell membrane antigens and corresponding antibodies
JPS5992353A (ja) * 1982-11-19 1984-05-28 Shinotesuto Kenkyusho:Kk 不溶性担体粒子を用いる凝集反応測定方法
JPS60256057A (ja) * 1984-06-01 1985-12-17 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 免疫学的測定法
JPS63106561A (ja) * 1986-05-31 1988-05-11 Toshiba Corp 免疫分析試薬
DE3715333A1 (de) * 1987-05-08 1988-11-24 Behringwerke Ag Verfahren zur quantitativen bestimmung von serumproteinen in koerperfluessigkeiten und mittel zur durchfuehrung des verfahrens
US4921809A (en) * 1987-09-29 1990-05-01 Findley Adhesives, Inc. Polymer coated solid matrices and use in immunoassays
DE68907996T2 (de) * 1988-05-11 1994-01-05 Abbott Lab Verfahren zur Erhöhung der Spezifizität in kompetitiven Immuntests.
JPH0354466A (ja) * 1989-07-21 1991-03-08 Sekisui Chem Co Ltd 免疫学的測定試薬及び測定方法
JPH0354465A (ja) * 1989-07-21 1991-03-08 Sekisui Chem Co Ltd 免疫学的測定用希釈液
US5817525A (en) * 1995-05-19 1998-10-06 Chiron Diagnostics Corporation Stable protein solutions for diagnostics and method of making and using the same
US6927071B2 (en) * 2001-12-07 2005-08-09 Beckman Coulter, Inc. Method for reducing non-specific aggregation of latex microparticles in the presence of serum or plasma
US20060190188A1 (en) * 2005-01-25 2006-08-24 Nauta Jozef J Methods and systems for determining lot consistency
CA2552596A1 (en) * 2005-08-09 2007-02-09 Solvay Pharmaceuticals B.V. Methods and systems for determining mid-value titers

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3600494A (en) * 1967-11-06 1971-08-17 Fujizokiseiyaku Kk Serological test for syphilis
DE2134928A1 (de) * 1970-07-17 1972-01-27 Wellcome Found Biologisches Reagens

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1078939A (en) * 1964-08-12 1967-08-09 Pfizer & Co C Diagnostic reagent
US3873683A (en) * 1968-12-10 1975-03-25 Princeton Lab Inc Pregnancy test composition and method
GB1340180A (en) * 1969-12-18 1973-12-12 Kowa Co Process for the preparation of diagnostic agents for primary hepatoma
US3992517A (en) * 1975-02-19 1976-11-16 Pfizer Inc. Detection of hepatitis B surface antigen by latex agglutination
DE2546166A1 (de) * 1975-10-15 1977-04-28 Behringwerke Ag Gegerbte thrombozyten
GB2005275B (en) * 1977-09-19 1982-03-10 Hoffmann La Roche Immunological reagent
JPS5552945U (de) * 1978-10-05 1980-04-09

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3600494A (en) * 1967-11-06 1971-08-17 Fujizokiseiyaku Kk Serological test for syphilis
DE2134928A1 (de) * 1970-07-17 1972-01-27 Wellcome Found Biologisches Reagens

Also Published As

Publication number Publication date
AU5940280A (en) 1981-01-08
FI68468C (fi) 1985-09-10
DK166234B (da) 1993-03-22
GB2052059A (en) 1981-01-21
DK166234C (da) 1993-08-16
NO153910B (no) 1986-03-03
AU538062B2 (en) 1984-07-26
NL191323B (nl) 1994-12-16
NO153910C (no) 1986-06-11
SE8004542L (sv) 1980-12-20
FI68468B (fi) 1985-05-31
BE883905A (fr) 1980-12-19
IT8067909A0 (it) 1980-06-11
DK258080A (da) 1980-12-20
FR2459480B1 (fr) 1985-01-11
DE3022681C2 (de) 1992-07-30
ZA803473B (en) 1981-09-30
GB2052059B (en) 1983-11-30
JPH0256633B2 (de) 1990-11-30
NL191323C (nl) 1995-05-16
SE448577B (sv) 1987-03-02
NL8003542A (nl) 1980-12-23
CH646524A5 (fr) 1984-11-30
JPS5631648A (en) 1981-03-31
US4310508A (en) 1982-01-12
FR2459480A1 (fr) 1981-01-09
CA1138331A (en) 1982-12-28
IT1129088B (it) 1986-06-04
NO801830L (no) 1980-12-22
FI801870A (fi) 1980-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2902676C2 (de) Verfahren zur Analyse eines von RF oder C1q verschiedenen Antigens im Serum mittels eines Immunoassays
DE2522087C2 (de) Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen von Ak:Ag-Komplexen in einer biologischen Fluidprobe
DE69328273T2 (de) Verfahren zur Messung von glykosiliertem Hämoglobin
DE3136579C2 (de)
DE3872500T2 (de) Verwendung eines mit biotin verknuepften immobilisierten rezeptors in einer testvorrichtung, einem testsatz und einer methode zur bestimmung eines liganden.
DE69332138T2 (de) Bestimmung von glykosyliertem hämoglobin durch dämpfung der fluoreszenz
DE1517934A1 (de) Mit Molekularsieb ueberzogenes Adsorbens aus kleinen Teilchen und Verfahren mit dessen Anwendung
DE69718094T2 (de) Verfahren und Kit zur Messung von Hämoglobin A1c
EP0407904B1 (de) Verfahren zur Bestimmung eines Analyten
DE2633877A1 (de) Verfahren zur immunpruefung auf antigene in fester phase
DE3022681A1 (de) Verfahren zur herstellung eines reagens, das agglutination bewirkt und direkter agglutinationstest fuer koerperfluessigkeiten
DD202178A5 (de) Verfahren und reagens zur untersuchung von antigen-antikoerper-reaktionen
DE2322562C2 (de) Verfahren zur Bestimmung von Antigenen in einer Probe
EP0001223A2 (de) Mit einer Polyhydroxyverbindung beschichteten Latex, Verfahren zur Herstellung dieses Latex, immunologisches Reagenz enthaltend diesen Latex, Verfahren zur Herstellung dieses Reagenzes, Verwendung dieses Reagenzes, Bestimmungsverfahren unter Verwendung dieses Reagenzes und Reagenziengarnitur enthaltend dieses Reagenz.
DE1598898A1 (de) Reagenz und Verfahren zur Bestimmung des Rheumatoidfaktors
DE3883729T2 (de) Immunobestimmung mit Nichtmetallmarkierungen.
CH646997A5 (de) Verfahren zur quantitativen bestimmung von creatinkinase-mb-isoenzym.
DE3105555C2 (de)
DE2850950C3 (de) Verwendung von nativem oder thermisch modifiziertem Cytochrom c als Stabilisator für ein immunochemisches Meßreagens, immunochemisches Meßreagens sowie Pufferlösung zur Probenverdünnung bei immunchemischen Meßverfahren
DE2754350A1 (de) Verfahren zur bestimmung von antikoerpern, antigenen oder komplexen aus antikoerpern und antigenen in fluessigkeiten
DE69229960T2 (de) Agglutierungsassays und kolloide farbstoffe verwendende testsätze
CH645727A5 (de) Praeparat zur bestimmung von menschlichem beta-2-mikroglobulin, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung.
DD158954A5 (de) Verfahren und reagenz zum nachweis von fibrinmonomer
DE68926479T2 (de) Testverfahren für antigene oder antikörper
DE2725594C2 (de) Verfahren zur Bestimmung der Konzentration freier Schilddrüsenhormone in Flüssigkeiten, insbesondere Blutseren

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee