FI68468C - Direkt agglutineringstest foer paovisning av antigener i kroppsvaetskor - Google Patents

Description

UlMyTl IB1 .... KOULUTUSJUUKAISU 68468 TOHjB ί ) <Ί1'utlAggningsskrift C .... Patentti nyilnnetty 10 09 1985 Patent oeddelat ' (51) Kv.ik.*/Int.a.« G 01 N 33/5^5 FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansöknfng 8θΐ8/0 (22) Hakemispäivä — Ansöknlngsdag 11.06.80 (F») (23) AlkupSivä — Giltlghetsdag 11.06.80 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentllg 20.12.80

Patentti-ja rekisterihallitus /44) Nähtäväksi panon ja kuul.julkalsun pvm. — 31 qc gr

Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad J

(32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begird prioritet 19*06.79 USA(US) O50269 Toteennäytetty-Styrkt (71)(72) George R. Siber, 37 Corey Road, Brookline, Massachusetts 021^6, (JSÄ(US) (7*0 Leitzinger Oy (5^) Suora agglutinaatiokoe antigeenin havaitsemiseksi kehon nesteissä -

Direkt agglutineringstest för pävisning av antigener i kroppsvätskor

Oheisen keksinnön kohteena on suora agglutinaatiokoe antigeenin havaitsemiseksi kehon nesteissä, joiden epäillään sisältävän näitä antigeenejä.

Mikrobioantigeenien havaitsemiseksi kehon nesteissä voidaan käyttää yhä suurempien infektiomäärien nopeaan diagnosoimiseen. Oleellinen ongelma on kuitenkin, että tällä hetkellä käytettävissä olevat menetelmät eivät ole riittävän herkkiä (immunodiffuusio, CIE) eikä niitä voida siten käyttää indikoimaan antigeenien läsnäoloa oleellisessa osassa infektoituneita potilaita tai ne vaativat myös liikaa aikaa nopean diagnosoinnin kannalta (RlA, ELISA). Eräissä tapauksissa antigeeni/vasta-ainekompleksi muodostuu hitaasti ja/tai muodostuneet hiukkaset ovat myös liian pieniä, jotta ne voitaisiin varmuudella havaita. Havaittavuutta on parannettu käyttämällä agglutinaatio-testejä, joissa käytetään hiukkasia kantoaineena, jonka pinnalle antigeeni tai vasta-ainemolekyyli on adsorboitunut tai sitoutunut.

Tällaiset agglutinaatiotestit voidaan suorittaa epäsuorilla mene- 68468 telmillä, jolloin kliininen näyte sekoitetaan vasta-aineiden kanssa määrätyssä laimennuksessa ja sopivan inkubointijakson jälkeen voidaan seokseen lisätä indikaattorisysteemiä, joka muodostuu hiukkas-maiseen kantoaineeseen sidotun antigeenin kompleksista. Jos kliinisessä näytteessä on antigeeniä, vasta-aine ei ole käytettävissä reaktioon antigeeni/kantoaine-kompleksin kanssa eikä mitään aggluti-naatiota tapahdu, joten agglutinaation puuttuminen on positiivinen testi antigeenille. Jos kliinisessä näytteessä ei ole antigeeniä, vasta-aine sen sijaan reagoi antigeenin ja kantoaineen kompleksin kanssa ja indikaationäytteessä tapahtuu agglutinaatiota. Teoria, johon tällaiset agglutinaatiotesti perustuvat, on alalla yleisesti tunnettu ja sitä on valaistu lähemmin USA-patenttijulkaisuissa 3.171.783, 3.775.536, 3.873.683, 3.879.262, 4.003.988 ja 4.045.384.

Jo kauan on oltu siinä käsityksessä, että infektiotautien suhteen ainoa todella merkityksellinen diagnostinen menetelmä on infektoi-vaan aineeseen liittyvien antigeenien aikainen ja nopea havaitseminen, jolloin välitön tehokas hoito on mahdollinen.

Oheisen keksinnön mukaisen agglutinaatiokokeen tuntomerkit on esitetty patenttivaatimuksissa.

Oheisen keksinnön mukaisesti on kehitetty erittäin herkkä aggluti-naatiotesti, jolla voidaan havaita kehon nesteistä pienissä konsent-raatioissa antigeenejä, kuten erilaatuisista mikro-organismeista, mukaanlukien bakteerit, prototsooat ja sienet, peräisin olevia proteiineja ja polysakkarideja. Jäljempänä on kuvattu oheisen keksinnön mukainen testi, jolla rutiinimaisesti voidaan osoittaa niinkin vähän kuin 0,2 nanogrammaa per millilitra kapseliperäisiä polysakkarideja, jotka liittyvät patogeenisiin bakteereihin. Tämä tarkoittaa, että herkkyys on 25 - 250 kertaa suurempi kuin yleisesti käytettyjen vastavirta-immunoelektroforeesimenetelmien (CIE) herkkyys ja että herkkyys on vähintään yhtä hyvä kuin radioimmunoanalyysissä (RIA). Koska CIE on nopea, tämä menetelmä vaatii lisäksi koulutettua labo-ratoriohekilökuntaa ja jokseenkin kalliita reagensseja ja laitteita ja menetelmän herkkyys on rajallinen vastaten 10 - 50 nanogrammaa per millilitra useimmilla bakteeriperäisillä polysakkarideilla.

3 68468

Koska kehon nesteissä antigeenin konsentraatiot ovat usein alhaisempia, potilailla, joilla on viljelyllä todettuja bakteeri-infektioita, saadaan usein vääriä negatiivisia CIE-tuloksia. RIA on toisaalta 10 - 100 kertaa herkempi kuin CIE, mutta se on hyvin aikaa vievä ja kallis.

Ennen oheista keksintöä oli hiukkasagglutinaatiotestien yleinen käyttö rajoitettua, vaikkakin ne olivat erittäin yksinkertaisia ja halpoja, johtuen mm. näiden testien alhaisesta herkkyydestä antigeenin alhaisille konsentraatioille ja huonosta spesifisyydestä, joka ilmeni epäspesifisen agglutinaation esiintymisenä, erityisesti seeruminäytteillä. Soveltamalla oheisen keksinnön mukaista menetelmää, jota kuvataan jäljempänä, päästään herkkyyden suuruusluokkaan 0,2 ng/ml ja epäspesifisen agglutinaation esiintymistaajuus ihmisseerumilla pienenee 2 %:iin tai pienempään. Antiseerumin huolellinen valinta ja valmistaminen on lisäksi antanut testin, jolle on tunnusomaista tasainen herkkyys, hyvä stabiilisuus ja spesifisyys.

Keksinnön tavoitteena on siten tuoda esiin herkkä hiukkasagglutinaa-tiotesti, jolla havaitaan mikrobiantigeeneja kehon nesteissä niinkin alhaisissa konsentraatioissa kuin 0,2 ng/ml kehonestettä.

Keksinnön tavoitteena on myös tuoda esiin hiukkasagglutinaatiotesti, jolle on tunnusomaista, että epäspesifinen agglutinaatio ihmisseerumilla on 2 % tai vähemmän.

Keksinnön erityisenä tavoitteena on tuoda esiin entistä parempi hiuk-kasagglutinaatioanalyysimenetelmä, jolla voidaan nopeasti havaita polyribofosfaatti (PRP), kapseliperäinen polysakkaridi Haemophilus Influenzae tyypistä b.

Rajoitettu herkkyys on oleellinen ongelma mikrobiaalisen antigeeni-detektion aikaisemmin tunnetuissa menetelmissä. Tämän seurauksena bakteeriperäisiä antigeenejä ei voida osoittaa kaikilla potilailla, joilla on todistettuja infektioita. Testit ovat esimerkiksi osoittaneet, että 7 - 22 % potilaista, joilla on H.i.b. meningitis, 38 % potilaista, joilla on H.i.b. epiglottitis, 20 - 39 % potilaista, joilla on bakteerien aiheuttama pneumokokki-keuhkotulehdus, ja 50 -90 % potilaista, joilla on ei-bakteerien aiheuttama pneumokokki-keuhkotulehdus ei esiinny osoitettavasti antigeeniä seerumissa tai 4 68468 selkäydinnesteessä testattaessa saatavissa olevilla analyysimenetelmillä, jotka perustuvat vastavirta-immunoelektroforeesiin tai hiukkasagglutinaatioon. Radioimmunoanalyysimenetelmä, jolla voidaan osoittaa 0,5 ng/ml tai alle, mahdollistaa kuitenkin H.i.b. meningitis potilaiden kaikkien tapausten diagnostoinnin, kun he saapuvat lääkärille. Tesitulokset osoittavat myös, että 37 %:lla potilaista antigeenin konsentraatio oli pienempi kuin 10 ng/ml ja siten pienempi kuin useimpien vastavirta-immunoelektroforeesiin perustuvien käytettävissä olevien menetelmien herkkyysraja.

Oheisen keksinnön mukaisesti on kehitetty hiukkasagglutinaationana-lyvsiin perustuva analyysimenetelmä, jonka herkkyys on verrattavissa radioimmunoanalyysiin. Oheisen keksinnön mukaisella analyysimenetelmällä saavutettu suuri herkkyys perustuu muunnoksiin, joita on tehty aikaisemmin tunnettuihin hiukkasagglutinaatiomenetelmiin, nimittäin spesifisen H.i.b. antiseerumin valitsemiseen, antiseerumin globulii-nijakeen käyttämiseen, herkistävän hiukkasen pesemiseen ja hiukkas-agglut.inaatiotestin inkubointiajän pidentämiseen tavallisesta 5 minuutista noin 45 minuuttiin tai enemmän.

Oheen liitetty kuva esittää analyysiherkkyyden ja inkubointiajän välisen yhteyden.

a. Herkkyys

Antiseerumin valinta vaikuttaa selvästi analyysin herkkyyteen. Kuusi kolmessa eläinlajissa valmistettua antiseerumia tuottaa hiukkasia, joiden herkkyydet vaihtelevat 0,2 nanogrammasta yli 1000 nanogrammaan PRP per millilitra. Sekä spesifisen vasta-aineen funktionaalinen laatu että sen konsentraatio ovat tärkeitä. Antiseerumilla, joka antaa kaikkein herkimpiä hiukkasia, ei ole korkeinta vasta-ainekonsentraa-tiota määritettäessä radioantigeenisidonta-analyysillä.

Nämä kuusi antiseerumia Haemphilus Influenzae tyyppiä b vastaan valmistettiin neljässä kaniinissa, aasissa ja hevosessa immunisoin-titavalla, jota H.E. Alexander et ai ovat kuvanneet julkaisussa Journal of Immunology 54: 207 - 211, 1946.

Ilmaus "hiukkaset" tarkoittaa oheisessa yhteydessä hiukkasia, jotka ovat inerttejä ja neutraaleja muita komponentteja kohtaan ja jotka voivat irreversiibelillä tavalla adsorboida antiseerumia. Tällaiset hiukkaset voivat olla helmiä, jotka on tehty lasista, polybutadiee-nista, polystyreenistä, polybutadieeni-styreenistä jne., keskimäärä!- 5 68468 sen hiukkaskoon ollessa noin 0,15 - noin 0,9 mikronia. Parhaiten herkistetään seuraavalla tavalla edellä mainitulla antiseerumilla polystyreenilateksihiukkasia, joilla on yhtenäinen halkaisija noin 0,8 μ, suspensiona, jbka sisältää 10 paino/tilavuus-% tislattua vettä:

Kaikki antiseerumit, jotka on saatu aasista ja kaniinista, laimennettiin kukin 1/500 ja hevosantiseerumi laimennettiin 1/200 standardisoituun glysiinipuskuroituun suolaliuokseen (0,1 M glysiini, 0,9 % natriumkloridi, pH 8,2). Vasta-aineet adsorboitiin lateksi-hiukkasten päälle lisäämällä yksi osa 10-prosenttista lateksisus-pensiotä 80 osaan laimennettua antiseerumia ja inkuboimalla huoneen lämpötilassa 1 tunti. Vapaa antiseerumi dekantoitiin sen jälkeen, kun oli sentrifugoitu 10 minuuttia 12.000 G:ssä. Latekstipelletit saspendoitiin glysiinipuskuroituun suolaliuokseen, jossa oli pieni määrä proteiinia, nimittäin 0,1 % ihmisperäistä seerumialbumiinia tai eri tapauksissa 0,1 % seerumia aasista, kaniinista tai hevosesta niin, että saatiin 0,125-prosenttinen lateksisuspensio, joka sentri-fugoitiin uudelleen ja suspendoitiin glysiinipuskuroituun suolaliuokseen. PRP-antigeenin standardisoitujen liuosten laimennusaineena käytettiin vasikansikiöseerumia, jossa radioimmunoanalyysin perusteella ei ollut lainkaan anti-PRP-vasta-ainetta.

Agglutinaatio suoritettiin lisäämällä antigeeniä sisältävää nestettä 0,05 ml eriä 0,01 ml:aan herkistettyä lateksiliuosta keraamisilla renkailla varustetulla serologisella levyllä. Levyä pyöritettiin (180 kierrosta minuutissa) kosteuskammiossa huoneen lämpötilassa ja 45 minuutin kuluttua tutkittiin agglutinaation suhteen. Aggluti-naatiolle annettiin arvo 4+, kun agglutinaatioseos oli kirkastunut ja havaittiin karkeita lateksihiukkaskokkaröita, 3+, kun seos pysyi harsomaisena, mutta havaittiin karkeita kokkareita, 2+, kun seos pysyi harsomaisena, mutta rakeisuutta voitiin helposti havaita, ja .f 1 , kun seos pysyi harsomaisena, mutta rakeisuutta voitiin havaita vain minimaalisesti. Agglutinoitumista, joka on yhtä suuri kuin 2+ tai enemmän, pidetään positiivisena. Seuraavassa taulukossa 1 on annettu vertailevat herkkyydet.

6

Taulukko 1 6 8 4 6 8

Herkkyys LPA-analyysissä kuudella antiseerumilla Hemophilus Influenzae tyypin b suhteen 1 12 Seerumi Anti-PRP-vasta-aine Anti-PRP-vasta-aine Herkkyys kokoseerumissa (ug Ab adosrboituneena la- LPA:lle (ng proteiini/ml teksihiukkasiin (ug PRP/ml) ______Ab proteiini/ml (LP) _

Aasi 11.200 3,40 0,2

Kaniini 1 96.000 7,84 1,0 2 68.000 7,20 1,0 3 45.000 6,56 5,0 4 10.300 1,95 10,0

Havonen 3.100 1,84 1000 1 Määritetty radioantigeenisidonta-analyysillä 2

Se alhaisin PRP-5 konsentraatio vasikansikiöseerumissa, joka antaa agglutinaatioksi 2+ tai enemmän.

Taulukko 1 osoittaa selvästi, että antiseerumin, jota käytetään lateksihiukkasten herkistämiseen, laatu on kriittinen lateksihiukkas-agglutinaatiotestin herkkyydelle PRP-antigeenin havaitsemisen suhteen. Taulukon 1 tuloksista käy selvästi ilmi, että herkkyyttä ei voida ennakoida pelkästään antiseerumin PRP-konsentraation perusteella, joka on määritetty radioantigeenisidonta-analyysillä. Aasin anti-seerumi, joka sisälsi vain 12 % niin paljon vaSta-ainetta kuin paras kaniinin antiseerumi, antoi viisi kertaa suuremman herkkyyden lateksihiukkasten muodostumiselle. Tätä herkkyyksien eroa ei voi selittää sillä, että lateksihiukkaset päällystyvät tehokkaammin aasin vasta-aineilla, koska kaniinin antiseerumilla päällystetyt lateksihiukkaset sisälsivät 2,3 kertaa enemmän absorbenttivasta-ainetta. Aasin ja kaniinin antiseerumin agglutinoitumisaktiivisuus lampaasta saaduille punaisille verisoluille, jotka oli päällystetty PRP:llä, oli yhtä suuri huolimatta PRP-sitovan aktiivisuuden paljon suuremmasta konsentraa* tiosta kaniinin antiseerumissa.

Assosiöitumisnopeuksien määrittäminen osoittaa, että aasin vasta-aineet yhtyvät paljon nopeammin PFvP-antigeenin kanssa kuin kaniinin vasta-aineet. Assositoitumisen puoliintumisaika on 20 minuuttia aasin vasta-aineelle ja yli 60 minuuttia kaniinin vasta-aineille.

7 68468

Syytä tähän assositoiumisnopeuksien eroon ei tunneta.

Antigeeni/vasta-aine-kompleksin dissosioitumisnopeus antigeenin ylimäärän läsnäollessa kuvaa vasta-aineen sitoutumisvoimakkuutta eli affiniteettia. Kaniinin vasta-aineet dissosioituvat hitaammin polyriboosifosfaatista kuin aasin vasta-aineet ja niillä on, siten suurempi affiniteetti antigeeniä kohtaan. Tämä tulos tukee sitä hypoteesia, että antigeenin ja vasta-aineen yhtymisnopeus on merkittävämpi agglutinaatiomenetelmässä kuin antigeenin ja vasta-aineen reaktion voimakkuus.

b. Makroglobuliinljakeen käyttö LP:n päällystämiseen

Eri eläinten antiseerumien-bakteeriperäisten polysakkaridien molekyy-liseulakromatografia on osoittanut, että pääosa antipolysakkaridi-vasta-aineista hevoseläimissä (aasi, hevonen) on makroglobuliiniluo-kassa, joka vapautuu eläimen paksusuolen tyhjötilassa. Sitä vastoin suurin osa kaniinin vasta-aineista on luokassa lgG, joka vapautuu myöhemmin. Kuten taulukosta 2 käy ilmi, voidaan hevoseläimistä saatujen suhteellisen heikkojen antiseerumien herkkyyttä parantaa merkittävästi käyttämällä lateksihiukkasten herkistämiseen makro-globuliinijakeita aasin tai hevosen antiseerumista konsentraatiossa 50 pg proteiinia/ml. Parhaiten antiseerumien herkkyys ei enää parane tällä modifiöinnilla, vaikkakin agglutinaatioreätion selvyys on yleensä parempi kuin tyhjällä volyymijakeella. lgG-jakeen käyttö kaniinin seerumissa ei enää vastaavalla tavalla paranna herkkyyttä tai agglutinaation selvyyttä.

Taulukko 2

Latekstihiukkasten, jotka on päällystetty kokoseerumilla tai hevoseläinten antiseerumin makroglobuliinijakeilla, herkkyyksien vertailu bakteeriperäisisä polysakkarideja vastaan.

8 68468

Eläin Antiseerumin kohde LP:n, joka päällys- LP:n, joka pääl- tetty kokoseerumilla lystettv raakro- (laimennus 1/500), globuliinijakeel- herkyysx la (50 pg pro- teiinia/ml), _ ____ ______ herkkyys_

Aasi-F H. influenzae , „ , . , _ _ , , tyyppi b 1 ng/ml/ 0,2ng/ml

Aasi-132 H. influenzae 0,2 ng/ml 0,2 ng/ml tyyppi b

Aasi-W.J. H. influenzae 2 ng/ml 0,5 ng/ml tyyppi b

Aasi-Y Neisseria 1 ng/ml 0,2 ng/ml

meningitidis ryhmä Y

Hevonen-49 N. meningitidis 0,5 ng/ml 0,2 ng/ml

ryhmä A

Hevonen-46 N. meningitidis >10.000 ng/ml 2 ng/ml

ryhmä B

xjj5e antigeenin alhaisin konsentraatio, joka antaa agglutinaatioksi 2+ tai enemmän.

c. Päällystetyn LP:n pesu

Aasin antiseerumin herkkyyden parantamiseksi edelleen verrattiin vasta-aineella päällystettyjä lateksihiukkasia, jotka oli päällystetty aasin antiseerumin eri laimennuksilla.glysiinipuskuroidussa suolaliuoksessa, pesemättömänä ja l,v 2 ja 3 pesukerran jälkeen glysiini-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 1/1000 osaa vasikansikiö-seerumia. Tulokset on annettu taulukossa 3.

Taulukko 3

Antiseerumin laimennuksen ja lateksihiukkasten pesiin vaikutus herkkyyteen lateksihiukkasagglutinaatiotestissä polyriboosi-fosfaatilla.

9 68468

Lateksihiukkasten PRP :n pienin todettu konsentraatio herkistämiseen _ (ng/ml)_______ käytetty aasin an- pesemätön Pesty Pesty Pesty tiseerumin laimen- 2 nus ___ xl x 2 x 3 1/10 200 >1000 >1000 >1000 1/100 50 0,5 0,5 0,5 1/500 2 0,2 0,2 0,2 1/1000 0,5 0,2 0,2 0,2 1/2000 0,2 0,2 0,2 0,5 1/5000 >1000 >1000 >1000 >1000 x 2+-agglutinaatiota tai enemmän pidetään positiivisena tuloksena.

Kuten taulukossa 3 annetuista tuloksista käy ilmi, ovat antiseerumin alhaiset laimennukset epäherkkiä. Laimennuksilla 1/500 ja sen yli saavutetaan maksimaalinen herkkyys edellyttäen, että latekstihiukkaset on pesty. Pesemättömillä lateksihiukkasllla päästään maksimaaliseen herkkyyteen vain kapealla laimennusvälillä. Kaksi pesukertaa antoi maksimaalisen herkkyyden, kun taas kolme pesukertaa voi johtaa pienempään herkkyyteen.

Pesukokeesta saatuja herkistettyjä lateksihiukkasia säilytettiin 4°C:ssa ja testattiin uudelleen 12 ja 24 kuukauden kuluttua. Lateksi-hiukkaset, jotka oli herkistetty aasin antiseerumilla ja jotka oli laimennettu 1/500 ja 1/1000 sekä pesty kaksi kertaa, säilyttivät alkuperäiset herkkyytensä, kun taas pesemättömät lateksihiukkaset olivat 2-4 kertaa vähemmän herkkiä 24 kuukauden kuluttua.

d. Inkubointiajan pituus

Piirustusten kuviossa 1 on esitetty analyysiherkkyyden ja inkubointiajan Alinen yhteys. Suuret antigeenikonsentraatiot agglutinoivat lateksihiukkaset 5 minuutissa. Herkkyys kasvoi nopeasti ensimmäisen 45 - 60 minuutin aikana ja sen jälkeen hitaasti ja saavutti 10 tunnissa maksimiarvon 0,05 nanogrammaa/ml kaikkein herkimmissä valmisteissa. Keksinnön mukainen hevoseläinseerumi oli herkempi kuin kaniinin seerumi kaikilla inkubaatioajoilla. Vertailukokeita suoritettaessa sekoitettiin 50 mikrolitraa koeliuosta ja 10 mikrolitraa päällystettyjä lateksihiukkasia jäljempänä kuvatulla tavalla serologisen levyn päälle ja pyöritettiin 180 kierrosta per minuutti huoneen lämpötilassa. Levyt päällystettiin ja kosteus säilytettiin kuumalla vedellä kyllästetyillä 10 68468 sienillä. Sen jälkeen levyistä tehtiin huomiot annettuina ajankohtina.

Inkubointiajan pidentäminen 5 minuutista 45 minuuttiin tai sen yli lisää herkkyyttä 10 - 20-kertaisesti. Käytännön kliinisiä päämääriä varten valittiin inkubointiajaksi 45 minuuttia, jolloin luenta suoritettiin normaalisti 5-15 minuutin välein, kun käytettiin hevos-eläinantiseerumi11a päällystettyjä lateksihiukkasia. Tällaisten la-teksihiukkasten herkkyys oli 0,2 nanogrammaa antigeeniä per ml nestettä. Odotettavissa oli, että hiukkasagglutinaatioanalyysin herkkyyden kasvu lisäisi myös epäspesifisen agglutinaation esiintymistä, ja seerumi-näytteen kyseessä ollen nämä lateksihiukkaset agglutinoivat 69 % sairaalassa hoidettujen lasten seerumista. Tämä oleellinen haitta on aikaisemmin rajoittanut tämän analyysimenetelmän laajempaa käyttöä. Tekijät, jotka ovat vaikuttaneet gammaglobuliineilla päällystettyjen latfekiihiukkasten agglutinaatioon, ovat lämpölabiilit seerumikompo-nentit (luultavasti komplementit) ja lämpöstabiilit antiglobuliinit, joita voidaan tavallisesti löytää pieniä määriä ihmisen seerumissa, erityisesti potilailla, joilla on kroonisia tulehdussairauksia.

Epäspesifinen agglutinaatio todettiin kontrollihiukkasten, jotka oli herkistetty epäimmuunin eläimen kokoseerumilla, agglutinaatiosta.

Kun käytetään makroglobuliinilla päällystettyjä lateksihiukkasia, kontrollilateksihiukkasOt on päällystetty epäimmuuniseerumin makro-glohuliinijakeella.

Oheisen keksinnön mukaisesti pienenee epäspesifisen agglutinaation esiintymistaajuus ihmisseerumilla 2 %:iin tai alle lisäämällä (i) herkistettyihin lateksihiukkasiin epäimmuunin eläimen seerumia; (ii) lisäämällä suoraan inkubointiseokseen seerumipuskuria, joka sisältää polyanionia ja/tai pelkistävää ainetta, ja/tai (iii) inakti-voimalla seerumi lämmön avulla.

Epäspesifisen agglutinaation esiintyminen määritettiin seerumilla, joka oli saatu lapsista ja täysikasvuisista, jotka olivat sairaalapotilaita ja joilla ei Ollut H.i.b.-sairautta. Kaikki seerumit testattiin lateksihiukkasilla, jotka oli herkistetty aasin antiseerumilla (anti-PRP LP,) , ja lateksihiukkasilla, jotka oli herkistetty epäimmuu-nilla aasin seerumilla (kontrolli-LP).

11 68468

Esikokeissa testattiin seerumi, joka sisälsi lämpöstabiileja agglu-tiineja, lisäämällä 10 mikrolitraa pelkistintä, kuten 1,4-ditio-treitolia (DTT) tai 2-merkaptoetanolia (ME) inkubointiseokseen inku-boinnin alussa. Optimikonsentraätiot olivat 0,018 M DTT:llä ja 0,35 M ME:llä (loppukonsentraatiot inkubointiseoksessa olivat 0,0026 M DTT:llä ja 0,05 M ME:llä).

Seuraavaan taulukkoon 4 on koottu tulokset, jotka on saatu 104 pediatrisella seerumilla, joita ennen testausta oli säilytetty vähintään 24 tuntia 4°C:ssa.

Taulukko 4

Epäspesifisen agglutinaation esiintyminen säilytetyissä seerumeissa^", jotka oli saatu sairaalahoidossa olevista lapsista, jotka eivät sairastaneen Haemophilus influenzae tyyppiä b.

Agglutinaatio anti- PRP LP: 11a negatiivinen positiivinen negatiivinen positiivinen

Agglutinaatio kontrolli-LP:11a negatiivinen positiivinen positiivinen negatiivinen

Seerumia ei käsitelty (n= 104) 32 (31 %) 65 (63 %X 3 (3 %) 4 (4 %)

Seerumiin inak-tivointi lämmöllä (n = 104) 49 (47 %) 47 (45 %) 1 (1 %) 7 (7 %)

LP:en lisätty normaalia aasinsee-rumia (2,5 %X

(n = 104) 72 (69 %) 23 (22 %) 7 (7 %) 2 (2 %)

Seerumin inäkti-vointi lämmöllä ja LP:en lisätty normaalia aasinseerumia (2,5 %) (n = 104) 75 (72 %) 23 (22 %) 5 (5 %) 1 (1 %) LP:en lisätty normaalia aasinseerumia (2,5 %) ja seerumiin

lisätty DTt (n = 53)3 52 (98 %) 1 (2 %) O O

^ Säilytetty ennen testausta vähintään 24 tuntia 4°C:ssa.

2

Ditiotreitoli, loppukonsentraatio 0,0026 M inkubointiseoksessa.

I04:sta näytteestä vain 53 sisälsi tähän testiin riittävän määrän seerumia.

3 12 68468 69 % näistä näytteistä aiheutti epäspesifisen agglutinaation anti- PRPrllä ja kaikki, 4 % lukuunottamatta, indentifioitiin kontrolli-LP:llä.

Inaktivointi lämmöllä (60°C, 15 minuuttia) pienensi vain vähäisessä määrin epäspesifisistä agglutinaatiota 53 %:iin ja epäimmuunin aasin-seerumin lisäys sekä anti-PRP:en että kontrolli-LP:en pienensi epäspesifisen agglutinaation 31 %:iin; pelkistysaineen, so. ditiotreito-lin, 10 mikrolitran lisäys pienensi epäspesifisten reaktioiden esiintymisen 2 %:Iin. Tulokset, jotka oli saatu aikuisista henkilöistä otetuilla 52 säilytetyllä seerumilla, olivat saman tapaiset. Lateksi-hiukkasiin lisättiin vain yhtä seerumia, joka aiheutti epäspesifisen agglutinaation (positiivinen anti-PRP-LP:llä ja kontrolli-LP:llä) lisättäessä 2,5 % normaalia aasinseerumia, ja inkubointiseokseen lisättiin DTT.

Sen määritt&biseksi, aiheuttavatko tuoreet seerumit enemmän epäspesifisen agglutinaation esiintymistä, otettiin 100 seerumia aikuisista ja vietiin välittömästi jäille ja analysoitiin samana päivänä. Jokainen seerumi testattiin käyttämällä pelkistintä (ME) ja ilman sitä ja inakti-voimalla lämmön avulla (60°C, 5 minuuttia) tai ilman inaktivointia. Agglutinaatio testattiin anti-PRP-LP:llä ja kontrolli-LP:llä, jotka kumpikin sisälsivät 2,5 % normaalia aasinseerumia ja jotka vastasivat toisiaan kaikissa tapauksissa. Agglutinaatiokuvio on koottu taulukkoon 5.

Taulukko 5

Epäspesifinen agglutinaatio tuoreilla seerumeilla 100 aikuisesta, jotka eivät sairastaneet Haemophilus influenzae tyyppiä b^.

13

Koe Ei inaktivoin- Inaktivoin- Seerumien 6 8 4 6 8 tia ti lämmöllä määrä _ No ME ME2 No ME ME2 _ Tulkinta_ 1. (-) (-) (-) (-) 43 Ei antiglobuliineja

Eli komplementteja 2. (+) (-) (+) (-) 28 Vain antigloubliineja 3. (+) (+) (-) (-) 4 Vain komplementti 4. (-) (+) (-) (-) 14 Vain komplementti ("reaktivoitu" ME:llä) 5. (+) (+) (+) (-) 10 Antiglobuliineja ja komplementti 6. (-) (-) (-) (+) 1

Niiden seerumien määärä, jotka ai-häyttivat epäspesifisen agg-lutinaa-i tion 42 38 38 1 1 Kaikki analyysit suoritettiin anti-PRP ja kontrolli-LP sisältävällä 2,5-prosenttisella normaalilla aasinseerumilla. Anti-PRP:llä ja kontrol li-LP: llä saavutetu tulokset vastasivat täysin toisiaan.

2 2-merkaptoetanoli, loppukonsentraatio 0,05 M inkubointiseoksessa.

42 % käsittelemättömistä seerumeista (ei lämpöä, ei pelkistintä) aiheutti epäspesifisen agglutinaation. Kun lisättiin pelkistintä (ME) 28 näistä seerumeista tuli negatiivisiksi ( koe 2), joka osoittaa antiglobuliine ja olevan mukana. 14 seerumia, jotka alkuaan olivat olleet negatiivisia, tulivat positiivisiksi ( koe 4), joka osoittaa, että merkaptoetanoli aktivoi uudelleen lämpöstabiilin agglutiniinin. Pelkästään ME-nettoefekti oli pienentää epäspesifisen agglutinaation 38 %:iin. Samanlainen epäspesifisen agglutinaation esiintyminen saavutettiin vain inaktivoimalla lämmön avulla. Yhdistelmä, jossa nämä seerumit inaktivoitiin lämmöllä ja inkuböintiseokseen lisättiin pelkistintä, pienensi kuitenkin epäspesifisen agglutinaation suuruusluokkaan 2 % tai alle.

14 68468

Koska inaktivoiminen lämmön avulla on aikaa vaativaa, epäspesifisen agglutinaation eliminoimiseksi on kehitetty vaihtoehtoinen menetelmä, jossa käytetään lämpölabiilien seerumitekijöiden vaikutusta. Erilaatuiset polyanionit mukaanlukien natriumpolyetanolisulfaatti (SPS), dekstraanisulfaatti, karrageeni ja hepariini estävät globuliinipääl-lystettyjen lateksihiukkasten epäspesifisen agglutinaation lämpöla-biilien seerumifaktoreiden vaikutuksesta.

100 täysikasvuisista henkilöistä saatua tuoretta seerumia testattiin seerumipuskurilla, joka sisälsi sekä ME (kuten edellä) että SPS 0,05 % konsentraatiossa. Vain yksi näistä 100 seerumista antoi epäspesifisen agglutinaation anti-PRP- ja kontrolli-LP:llä. Epäspesifinen agglutinaatio tällä seerumilla eliminoitui kuumentamalla. Seerumipuskuri, joka sisältää sekä pelkistintä että polyanionia, lisätään parhaiten stabiloidun herkistetyn lateksihiukkasen ja seeruminäytteen inkubointiseokseen.

Tällainen seerumispuskuri valmistettiin seuraavalla tavalla: 14-moolinen 2-merkaptoetanoli (stadardisoitu tävsivahvuinen liuos) liuotetaan 1/40 glysiinipuskuroituun suolaliuokseen (GBS) (0,1 M glysiini, 0,9 % natriumkloridi, pH 8,2). Polyetanolisulfonaatin 5-prosenttinen vesiliuos laimennetaan 1/100 samaan GBS-liuokseen.

Seerumispuskuri voi sisältää muita pelkistimiä, kuten ditiotreitolia, glutationia, kysteiiniä ja vastaavia 2-merkaptoetanolin asemesta.

Sitä paitsi voidaan käyttää muita polyanioneja, kuten dekstraanisul-faattia, hepariinia ja karrageenia ja vastaavia, mikäli ne eivät häiritse antigeeni-vasta-aine-reaktiota.

Seuraavassa taulukossa 6 on esitetty reagenssien optimikonsentraatiot seerumispuskurissa. Pelkistimen tai polyanionin suuret konsentraatiot pienensivät analyysin herkkyyttä ja alhaisemmat konsentraatiot eivät voineet eliminoida epäspesifistä agglutinaatiota kaikissa seerumeissa.

15

Taulukko 6 6 8 4 6 8

Reagenssien optimikonsentraatiot "seerumispuskurissa".

DTT 2-ME SPS

(loppukonsentraatlo analyysiseoksessa)

Herkkyys pienentynyt 12,8 mM 400 mM 0,07 %

Herkkyys hyvä + epäspesifinen agglutinaatio eliminoitunut 2,6 mM 50 mM 0,007 %

Epäspesifinen agglutinaatio ei eliminoitunut 0,65 mM 10 mM 0,0007 % DTT - ditiotreitoli 2-ME - 2-merkaptoetanoli SPS - natriumpolyanetosulfonaatti

Epäiiranuunisen eläinseerumin efektiivinen konsentraatio lateksisuspen-siossa tutkittiin uudelleen testisysteemissä käyttämällä edellä kuvattua seerumipuskuria.

Epäimmuunin eläinseerumin konsentraatiot alle 0,25 % hiukkassuspen-siossa (alle 0,035 % lopullisessa analyysiseoksessa) johtivat satunnaiseen epäspesifiseen agglutinaatioon huolimatta seerumipus-kurin käytöstä.

Epimmuunin eläinseerumin konsentraatiot noin 25 %:iin asti lateksi-suspensiossa (3,5 % lopullisessa analyysiseoksessa) pienentävät tehokkaasti epäspesifisen agglutinaation esiintymistä, mutta korkein konsentraatio, so. 25 %, pienensi kuitenkin kaksinkertaisesti analyysin herkkyyttä.polvribofosfaatin suhteen.

Epäspesifinen agglutinaatio muissa kehon nesteissä

Useimmat virtsanäytteet antavat epäspesifisen agglutinaation anti-PRP- ja kontrolli-LP:llä. Tämä voidaan eliminoida joko kuumentamalla (100°C 5 minuuttia) virtsaa tai suodattamalla virtsa. Suositellussa suoritusmuodossa käytetään suodatinta, jonka hubkoskoko on 0,45 mikronia.

Selkäydinnestenäyte aiheuttaa hyvin harvoin epäspesifisen agglutinaation, joka kuitenkin voidaan poistaa kuumentamalla (100°C, 5 mi- 16 68468 nuuttia) . PRP-antjigeeni on stabiili edellä mainitussa kuumentamisessa ja suodatuksessa.

Seuraavat spesifiset esimerkit valaisevat keksintöä sen suositellussa suoritusmuodossa.

a. Latekslhiukkasten päällystäminen

Anti-PRP-lateksihiukkasten valmistamiseksi laimennetaan aasin erottamaton antiseerumi H. influenzae tyyppi b suhteen 1/500 glvsiinipus-kuroituun suolaliuokseen (GBS) ja kuumennettiin 56°C:een 30 minuutissa. Osa lateksisuspensiosta (10-prosenttinen suspensio, jonka hiukkasten halkaisija 0,18 μ, tislatussa vedessä) lisätään 80 osaan laimennettua antiseerumia niin, että lateksihiukkasten loppukonsentraa-tio on 0,125 %. Seosta inkuboidaan tunti huoneen lämpötilassa, sentri-fugoidaan 10 minuuttia 12.000 G:ssä ja päälineste heitetään pois. Tabletti"suspendoidaan uudelleen yhtä suureen tilavuuteen GBS, joka sisältää 0,1 % epäimmuunia aasinseerumia, sentrifugoidaan uudelleen kuten edellä ja suspendoidaan tämän jälkeen uudelleen yhtä suureen tilavuuteen GBS, joka sisältää 2,5 % epäimmuunia aasinseerumia. Kontrollilateksihiukkaset valmistettiin samoin kuin edellä lukuunottamatta, että lateksihiukkasten päällystämiseen käytetään alussa epäimmuunia aasinseerumia, joka on laimennettu 1/500 GBS:ään. Epä-immuunisen aasinseerumin, jota tällöin käytetään, tulisi olla seerumia, joka on otettu ennen immunisointia samasta eläimestä, joka oli immunisoitu.

Kun on tarkoitus käyttää makroglobuliinijaetta, kromatografoidaan kokonainen esi^immunoitu ja immuuni aasinseerumi geelisuodatuspyl-väässä, joka sisältää ".Sephacryl G-200" geeliä, ja yhdistetään ja-keet, jotka eluoituvat pylvään tyhjötilavuudessa. Yhteenkerätyt tilavuusjakeet laimennetaan proteiinikonsentraatioon 50 yg proteiinia per ml GBSrssä ja käytetään sen jälkeen edellä kuvatussa menetelmässä laimennetun kokonaisen antiseerumin asemesta.

b. Seerumipuskurin valmistus 14-moolinen 2-merkaptoetanoli (stadardisoitu täysvahvuinen liuos) laimennetaan 1/40 fiBS:ään. Lisätään natriumpolyanetolisulfonaattia niin, että loppukonsentraatio on 0,05 %.

17 c. Analyysimenetelmä 68468

Keksinnön mukainen analyysimenetelmä suoritetaan seuraavalla tavalla: 50 mikrolitraa positiivista kontrolliseerumia, negatiivista kontrol-liseerumia ja jokaista testattavaa seerumia, selkäydinnestettä ja virtsanäytettä lisätään kuivan serologisen levyn kumpaankin koloon seuraavan kaavion mukaisesti. Positiivinen kontrolliseerumi sisältää 2 ng PRP antigeenia/ml. Negatiivinen kontrolliseerumi sisältää antiglobuliineja, jotka agglutinoivat sekä anti-PRP-LP:n että kontrollii-LP:n, jos SB:tä ei lisätä, ja toimivat siten SB:n aktiivisuuden kontrollina. Virtsanäyte esisuodatetaan 0,45 mikronin suodattimena.

Positiivinen Negatiivinen Testi- Testi- Testi- kontrolli- kontrolli- seerumi CSF virtsa seerumi seerumi

Kivi A:Λantir-PPP-LP (sB^ (sb) (sb) (^) (^)

Rivi B: kontrolli-LP ^Sb) (sb) (sb) o o SB = lisää seerumipuskuria

Lisää 10 mikrolitraa seerumipuskuria jokaiseen koloon, joka sisältää positiivista kontrolliseerumia, negatiivista kontrolliseerumia tai seeruminäytettä.

Lateksisuspensiot sekoitetaan varovasti vaahdottamatta ja 10 mikro-litraa anti-PRP-lateksihiukkasia lisätään jokaisen parin (rivi A) toiseen koloon ja reagenssit sekoitetaan huolellisesti.

10 mikrolitraa kontrollilateksihiukkasia lisätään kunkin parin toiseen koloon ja reagenssit sekoitetaan huolellisesti.

Levy asetetaan serologiseen ravisteluläitteeseen ja pyöritetään noin 45 minuuttia. Kammiota on kostutettava kuumassa vedessä liotetuilla sienillä niin, että kokeen aikana on nähtävissä kondensoitumista.

Levy poistetaan kammiosta, tiivistynyt vesi kuivataan ja agglutinaa-tio tutkitaan kallistamalla levyä edestakaisin vinosti lankeavassa valossa mustaa taustaa vasten seuraavan kaavion mukaisesti: 18 4+ suuria kokkareita - kirkas tausta 6 8468 3+ suuria kokkareita - häntumainen tausta 2+ pieniä kokkareita 1+ hienoja rakeita 0 huntumainen

Reaktiot 3+ ja 4+ on helppo erottaa kontrolleista, kun levyä tarkastellaan käsivarren etäisyydeltä. Reaktiot 2+ vaativat huolellisemman tutkimisen.

Tulosten tulkinta.

Hemophilus-LP Kontrolli-LP Tulkinta (+) (-) Positiivinen H. influenzae tyyppi b- antigeenille (-) (-) Negatiivinen H. influenzae tyyppi ta an tigeeni lie (+) (+) Epäspesifinen agglutinaatio H. influenzae tyyppi b-antigeertiä voi mahdollisesti olla mukana

Arvioinnin 2+ mukainen positiivinen agglutinaatio tulee antaa merkinnällä "heikosti positiivinen".

Oheisessa yhteydessä annetut lämpökäsittelyn ja inkuboinnin ajat ja lämpötilat ovat optimaalisia, jolloin on kuitenkin ymmärrettävä, että samat tulokset voidaan saada korkeammissa lämpötiloissa ja lyhyempinä aikoina tai kääntäen alhaisemmissa lämpötiloissa pidemmillä ajoilla. Edellisessä selityksessä on myös annettu reagenssit, mediumit ja menetelmät, joita on käytetty oheisen keksinnön toiminnan toteamiseen. Ammattimiehelle o n kuitenkin täysin ilmeistä, että menetelmien, aikojen, tilavuuksien ja materiaalityyppien, mediumien ja laitteiden suhteen voidaan tehdä muutoksia poikkeamatta keksinnön alueelta, joka lähemmin on määritelty patenttivaatimuksissa.

Claims (3)

19 68468

1. Suora agglutinaatiokoe antigeenin havaitsemiseksi kehon nesteissä, joiden epäillään sisältävän näitä antigeenejä, tunnettu siitä, että yhdistetään kehonesteen, joka on seerumi tai plasma, näyte juoksevan reagenssin, joka agglutinoituu joutuessaan kosketukseen antigeenejä sisältävien nesteiden kanssa, joka reagenssi käsittää kantajan, joka on päällystetty mainitun antigeenin eläinantiseerumilla lietettynä fysiologisesti sopivaan puskurijärjestelmään sekä epäimmuunia eläinseerumia samasta antiseerumin muodostavasta eläinlajista, joka antiseerumi on täydellinen hevoseläinantiseerumi, erityisesti sen makroglobuliinijae, puskurijärjestelmän, joka sisältää näytteen lämpölabiileihin ainesosiin kohdistuvaa vaikutusta lieventävää polyanionia, joka on natriumpolyanetolisulfonaatti, dekstraanisulfonaatti, karrageeni, hepariini tai vastaavat, ja näytteen antiglobuliinivasta-aineiden pelkistysainetta, joka on 2-merkaptoetanoli, ditiotreitoli, glutationi, kysteiini tai vastaavat, inkuboidaan seos ja tämän jälkeen määritetään visuaalisesti agglutinoitumisaste.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen agglutinaatiokoe, tunnettu siitä, että kehoneste lämmitetään.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen agglutinaatiokoe, tunnettu siitä, että inkubointiin käytetty aika on vähintään 45 minuuttia.