JPH0354465A - 免疫学的測定用希釈液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫反応により生じた凝集の程度を検出する
免疫学的測定方法に用いられる希釈液に関し、特に、ｖ
Ｉｉ量物質の測定に好適に用いられる免疫学的測定用希
釈液に関する． 〔従来の技術〕 被測定試薬中の抗原と該抗原に対応する．抗体との免疫
反応により生じた凝集の程度を検出する種々の免疫学的
測定方法が開発されているが、免疫学的測定方法の精度
を向上するには、免疫反応の安定化及び特異性の向上等
が必要である。

免疫反応による凝集を測定するに際しては、被検体を希
釈する場合と、希釈しないで測定する場合があるが、前
者の場合、希釈液により凝集が損なわれてはならない．
従って、下記の先行技術に示すように、従来より、緩衝
液や牛血清アルブミンのような蛋白質含有溶液が希釈液
として用いられている． 特開昭５７−９７２３号には、その実施例５において、
リウマチ凝集反応（十＋＋）と判定された患者血清の希
釈に、０．１重量％の牛血清アルブξン含有生理食塩水
を検体希釈液として用いることにより、免疫反応の安定
化を図った免疫学的測定方法が開示されている． 他方、特開昭５８−２１１６５号には、血液凝固異常因
子の測定に際し、健常者の血漿の希釈に、０．２４Ｍグ
リシン緩衝液（ｐＨ＝９．６）を使用する旨が記載され
ている。

〔発明が解決しようとする課題〕

免疫学的測定方法において検体を希釈するに際しては、
−１’Ｇ的には、上記のような緩衝液や牛血清アルブミ
ン等が用いられていた。しかしながら、緩衝液のみで希
釈すると、微量物質の測定に際しては、希釈時に用いる
容器の壁面に測定物質が吸着し、正確な測定を行い難か
った。また、上記のように牛血清アルブミンのような蛋
白質を含む希釈液を用いたとしても、使用する抗体と牛
血清アルブξンとの非特異的相互作用や、咳抗体に対し
て抗原と牛血゛清アルブミンとの交差反応が考えられる
場合には特異性が充分でなく、正確な測定を行い難いこ
ともあった。

よって、本発明の目的は、試料中の抗原の測定に際し、
該抗原に対応する抗体との免疫反応により生じた凝集程
度を検出する測定方法に用いられる希釈液であって、容
器壁面への測定物質の吸着、該抗体との非特異的相互作
用及び交差反応等を効果的に回避し得る希釈液を提供す
ることにある．〔課題を解決するための手段及び作用〕
本願発明者らは、免疫反応により生じた凝集の程度を検
出することにより抗原を測定する免疫学的測定方法用の
希釈液につき鋭意検討した結果、希釈液に、抗体作成時
に用いた被免疫動物種の血清アルブミンを含有させれば
、該抗体との非特異的相互作用及び交差反応を回避する
ことができ、かつ微量物質の場合であっても希釈時の容
器の壁面への測定物質の吸着を効果的に防止し得ること
を見出し、本発明を威すに至った． すなわち、本発明は、被測定試料中の抗原と、該抗原に
対応する抗体との免疫反応により生じた凝集の程度を検
出することにより抗原を測定する方法において用いられ
る希釈液であって、抗体作或時に用いた被免疫ｖＪ物種
の血清アルブミンが含有されていることを特徴とするも
のである。

本発明の希釈液は、測定対象物質である抗原の標準希釈
液、または測定検体を希釈するための希釈液の少なくと
も一方に用いられ得るものである．被測定試料と、被測
定試料中の抗原に対応する抗体とを混合すると、免疫反
応により凝集が引起こされる。この凝集の程度を検出す
る方法としては、凝集の有無を肉眼で判定する方法、及
び反応液に光を照射し散乱光あるいは透過光を測定する
方法がある。肉眼で判定する方法は、一ｉに不溶性担体
に担持された抗体と、測定試料中の抗原との凝集状態を
肉眼で判定し、抗原の有無の判定または半定量的測定と
して用いられている．他方、光学的測定方法は、測定試
料中σ抗原の定量に用いられている． 上記何れの測定方法においても、被検検体を希釈せずに
測定する場合と、ガラスまたはプラスチック等の容器に
移し代えて希釈する場合がある．しかし、希釈を行う場
合には、測定対象物質が微量の場合容器に吸着すること
があり、正確な定量が不可能となる．そこで、一般的に
は、塩濃度を上昇させた緩衝液や牛血清アルブミンのよ
うな蛋白質を含む溶液を、希釈液として用いることが多
かった． しかしながら、希釈液戒分と抗体との間に非特異的相互
作用がある場合や、使用抗体に対して他の勅物種の戒分
が測定対象物質と交差反応を起こすことがある場合には
、正確な定量が不可能となる。例えば測定対象物がヒト
アルブミン等の場合には、牛血清アルブミンを用いるこ
とは、上記の非特異的相互作用や交差反応の面から、必
ずしも適当ではない． そこで、本発明では、被免疫動物由来の血清戒分である
血清アルブミンを希釈液に含有させることにより、上記
の非特異的相互作用と交差反応を回避し、かつ容器への
吸着を防止することが可能とされている．この作用を更
に説明すると、被免疫動物種の血清アルブミンは、この
免疫学的測定に使用される抗体とは、該抗体が産出され
た後に特別の変性を受けていない限りは、非特異的相互
作用を生じ難く、また該抗体が該血清アルブミンを認識
することもない．何故なら、該抗体は、該血清アルブミ
ンの存在下で産出されたものだからである． 本発明の希釈液は、抗体作威時に用いた被免疫動物種の
血清アルブミンが、例えば水、生理食塩水または緩衝液
のような液体媒体に溶解されたものである。緩衝液とし
ては、特には限定されない．例えば、リン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、グリシン緩衝液またはアンモニア緩衝液等
が使用される。

希釈液中の該血清アルブミンの含有量は、該希釈液の使
用態様によって異なるので特に限定はされないが、−Ｃ
に、０．０１〜６．０重量％程度の濃度とされるのが好
ましい． また、この希釈液は、検体等を予め希釈してから測定す
る場合に用いられる他に、例えば日立７０５０型全自動
分析装置等を使用して測定する場合などのように、測定
装置内で免疫反応の直前に検体を希釈する場合、または
、免疫反応終了後に反応系に加えて反応系の濁度を調整
する場合にも使用され得るものである． 本発明の希釈液を用いる免疫学的測定方法を利用する測
定対象物質としては、ヒトアルブミンのような蛋白質、
ポリペブチド、ステロイド、多糖類、脂質、またはハプ
テン等の種々のものを例示することができる。これらの
うち、ヒトアルブミンの測定において、本発明の利点が
特に発揮される。これは、被免疫動物種と異なる動物種
の血清アルブミンを使用すると、交差反応が特に生じ易
いが、本発明ではこれが回避されるからである．また、
測定対象物質（抗原）として、尿中の微量或分が特に適
している。これは尿中には蛋白質の含有量が少ないので
、希釈時に蛋白質の濃い溶液で希釈した方が、測定対象
物質がより安定となるからである．尿中の微量威分とし
ては、ヒトアルブミン、β．一マイクログロプリン等が
例示され白質が用いられる． 本発明を利用する測定系としては、抗体を不溶性担体に
担持させたものであってもよく、あるいはこのような不
溶性担体に担持させずに凝集させる方法、例えば、免疫
比濁法なとであってもよい。

不溶性担体としては、無ａ物賞粉末、有機高分子粉末、
微生物、血球または細胞膜片等を例示することができる
。

具体的には、無機物質粉末としては、シリカ、アルミナ
、または金、チタン、鉄もしくはニッケル等の金属片が
挙げられる．有機高分子粉末としては、ラテノクス、不
溶性アガロース、セルロース、または不溶性デキストラ
ン等が例示され、好ましくは、ラテノクスが用いられる
．ラテックスは、通常、ラテノクス懸濁液の状態で用い
られる．ラテンクスとしては、ボリスチレン、スチレン
ースチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリルＭｌｉ合
体、アクリル酸重合体、アクリ口ニトリルブタジエン共
重合体及び塩化ビニルーアクリル酸エステル共重合体等
を例示することができる．上記不溶性担体の平均粒径は
、測定対象物質の検出濃度あるいは測定機器により適宜
選択されるものであるが、０．０５〜１．　　０μｍ程
度のものが用いられる． 不溶性担体の免疫凝集の程度を肉眼で判定する場合には
、通常、試料と、抗体を吸着させた不溶性担体を含む溶
液とを判定仮上で混合し、１〜５分間揺り動かした後、
凝集の有無を判定する。また、測定試料中に含まれる抗
原を半定量する場合には、試料を適当な緩衝液を含む希
釈液で希釈した後測定する場合もある。さらに、この希
釈液として本発明のものを用いるに際し、ポリエチレン
グリコールやデキストラン等の増感剤を含有させで使用
してもよい． 不溶性担体の凝集の程度を光学的に検出する方法では、
通常、測定試料を適当な緩衝剤を含む希釈液で希釈した
後、抗体を担持させた不溶性担体を含む溶液と混合する
．この希釈液として本発明のものを用いるに際し、希釈
液中にポリエチレングリコールやデキストラン等の増感
剤を含有させてもよい．測定は、散乱光強度、吸光度ま
たは粒子数を測定する光学機器を用いて行う．測定波長
としては、３００〜２４００ｎｍを使用することができ
る． 測光方法については、公知の方法を用いることができ、
使用する不溶性１旦体の粒径・濃度、または反応時間を
適宜選択することにより、散乱光強度または吸光度の増
加若しくは減少を測定することができる．より短時間で
測定したい場合には、凝集反応速度及び吸光度の絶対値
を用いて定量することもできる．さらに、反応時間につ
いても適宜選択し得る． 免疫反応の際にｐＨは５〜１０、特に６〜８が好ましい
．また、緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液
、グリシン緩衝液またはアンモニア緩衝液等が用いられ
る．反応温度は０〜５０゜Ｃ、特に２０〜４０゜Ｃが好
ましい。

〔発明の効果〕

本発明の免疫学的測定用希釈液には、抗体作成時に用い
た被免疫動物種の血清アルブくンが含有されているので
、従来法のように他の動物種由来の血清アルブミン等を
用いた場合のような非特異的相互作用や交差反応の発生
を確実に回避することができ、従って免疫学的測定方法
における反応の特異性を効果的に高めることができ、測
定対象物質を高精度に検出あるいは測定することが可能
となる． さらに、尿中のように共存蛋白質の少ない検体中の微量
物質を測定する場合には、希釈時の容器壁面への微量物
質の吸着を抑制することができる。

従って、このような検体中の＠量物質測定の場合であっ
ても、免疫学的測定方法の測定精度を効果的に高め得る
． 〔実施例の説明〕 失翫銑土 抗ヒトアルプξン抗体（ウサギ由来）をｌｍｇ／ｍｌの
ＩｇＧ濃度で含有するＯ．ＩＭグリシン緩衝液（ｐＨ＝
９．０）１　０ｍｆに、平均粒径が０．１９μｍのラテ
ックス（積水化学工業株式会社製、固形分１０％）ｌｍ
ｌを加え、３７゜Ｃの温度で６０分間撹拌し、次に、４
゜Ｃの温度で６０分間遠心分離（１８０００ｒｐｍ）す
る．遠心後、上清を捨てた沈澱物に１．２重景％のウサ
ギ血清アルブミンを含有する０．１Ｍグリシン緩衝液（
ｐＨ９．０）８　０ｍｆｆｉを加え、ラテックスを悲濁
させ、ラテックス試薬を作成した． 正常ヒト尿に、５、ＩＯ、５０及び１００μｇ／　ｍ　
Ｉ！．となるようにヒトアルブミンを添加したものを検
体とした．各検体を、希釈液としてウサギ血清アルブミ
ンを１重景％含有する５０ｍＭリン酸緩衝液を用意し、
ガラス試験管を用いて１０倍に希釈した．希釈検体１０
μ２と、上記ラテックス試薬１２００ｕｆｆｉとを混合
し、光路長５ｍのガラスセルを用いて５７０ｎｍの波長
で５分間の吸光度変化を測定した． 比較斑土 実施例１と同様にしてラテックス試薬を作成した．比較
例１ａの希釈液として、生理食塩水をｌ重量％含有する
５０ｍＭリン酸緩衝液を用意し、比較例１ｂの希釈液１
ｂとして牛血清アルブミンを１重量％含有する５０ｍＭ
’Ｊン酸緩衝液を用意し、各検体を比較例１ａまたは１
ｂの希釈液により、ガラス試験管を用いて１０倍に希釈
した．希釈検体１０μｌと上記ラテックス試薬１２００
μ２とを混合し、光路長５閣のガラスセルを用いて５７
０ｎｍの波長で５分間の吸光度変化を求めた．実施例１
及び比較例１ａ，ｌｂにおける５７０ｎｍにおける吸光
度の変化を下記の第１表示す。

第　　ｌ　　表 第１表において、表中の数値は、５７０ｎｍでの吸光度
変化ＸＩＯＯＯＯで示したもの。

第１表から明らかなように、生理食塩水からなる希釈液
（比較例１ａ）を用いた場合には、検体中のアルブミン
がガラス試験管に吸着されており、また牛血清アルブミ
ン含有リン酸緩衝液からなる希釈液（比較例１ｂ）では
、交差反応などにより検体中のアルブミン濃度が０の場
合でも凝集の生じていることがわかる．これに対して、
本発明による実施例１の検体希釈液を用いた場合には、
検体が損なわれたり、交差反応などを生じることのない
ことがわかる． 大腹附主 抗ヒトアルブミン抗体（ウサギ由来）のＩｇＣ濃度が１
　ｍ　ｇ／ｍ　ｌの０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２）１０ａｌｔに、平均粒径が０．２６μｍのラテノク
ス（積水化学工業株式会社製、固形分ｌＯ％）ｌｄを加
え、３７度で６０分間撹拌し、次に、４度で６０分間遠
心分離（１８０００ｒｐｍ）する．遠心後、上清を捨て
た沈澱物に１．２重量％のウサギ血清アルブミンを含有
する０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）ｌ（ｌｄを
加え、ラテックスを悲濁させてラテックス試薬を作威し
た． 正常ヒト尿に、５０、１００、５００、１０００及び５
０００μｇ／一となるように、ヒトアルブ壽ンを添加し
たものを検体とした．各検体をウサギ血清アルブミンを
１重量％含有する５０ｍＭリン酸ｙｋ衝液を希釈液とし
て使用し、ガラス試験管を用いて１０倍に希釈した．希
釈検体５０μｌと上記ラテンクス試薬５０μｌとを混合
し、３分間揺り動かした後、凝集の有無を肉眼で判定し
た．且（石生え 実施例２と同様にしてラテックス試薬を作威し、各検体
を生理食塩水（比較例２ａ）、または牛血清アルブミン
を１重量％含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（比較例２ｂ
）を希釈液として使用し、ガラス試験管を用いてｌＯ倍
に希釈した．各希釈検体５０μｌとラテックス試薬５０
ｌ！ｆｆｉとを混合し、３分間揺り動かした後のａ集の
有無を肉眼で判定した．実施例２及び比較例２ａ，２ｂ
における凝集反応の結果を下記の第２表に示す． 第２表 なお、第２表において（−） は、 ラテックスが 凝集していない状態を示し、 （＋） はラテックス が凝集した状態を示す。

第２表から明らかなように、比較例２ａ（生理食塩水に
よる希釈）では、検体中のアルブミンがガラス試験管に
吸着されており、他方、比較例２ｂ（牛血清アルブミン
含有リン酸緩衝演による希釈）では交差反応などにより
検体中のアルブミン濃度が０の場合であっても凝集を起
こしていることがわかる．これに対して、実施例２では
、検体の容器への吸着や交差反応などが生しることなく
正確に測定を行い得ることがわかる．

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）被測定試料中の抗原と、該抗原に対応する抗体と
   の免疫反応により生じた凝集の程度を検出することによ
   り試料中に含まれる抗原を測定する際に用いられる希釈
   液であって、前記抗体作成時に用いた被免疫動物種の血
   清アルブミンを含有することを特徴とする免疫学的測定
   用希釈液。
2. （２）前記測定対象抗原が尿中微量成分である請求項１
   に記載の免疫学的測定用希釈液。