JPS6360862B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、血漿及び他の生物学的液体のフイブ
リンモノマー（FS）を検出及び測定する方法に
関する。 血栓生成の早期診断は、診断学上著しい重要性
を有する。このためには、潜在的に進行しまだ外
見上明らかな臨床的病状を生じない凝固過程を識
別しなければならない。従来簡単な方法で、凝固
系の活動化生成物を早期段階に検出するために
は、敏感な方法又は臨床上有用な方法は存在しな
い。凝固過程の直接的指示薬の１つはFSであり、
これはトロンビンのフイブリノゲンに対する作用
によつて生じる。わずかな量のFSは血液中に存
在する過剰量のフイブリノゲンによつて安定にな
り、血管系中で沈着しないで溶解して得られる。
それ故診断法の課題は、溶解形で循環するわずか
な量のこのFSを過剰量のフイブリノゲンの存在
で検出及び測定することである。FSを、フイブ
リノゲンとは分子量によつても抗原の構造によつ
ても区別することができないので、常用の生化学
的検出法を使用することはできない。 FSを検出する次の方法は、既に公知である： (1) フイブリノゲンに比してFSの大きい沈殿傾
向を利用する沈殿法、例えばブレーン
（Breen）及びチユーリス（Tullis）によるエ
タノール試験〔Annals of Internal
Medicine、第69巻、第1197〜1206頁（1968
年）〕又はニービアロフスキー
（Niewiarowski）及びグレビイヒ
（Gurewich）によるプロタミン硫酸塩試験〔J.
Lab.Clin.Med.、第77巻、第665〜676頁）
（1971年）〕。フロツク化するフイブリン繊維を
十分に識別するためには、コロイド状の着色粒
子、例えばカーボン粒子を使用した（ドイツ公
開特許第2528381号明細書）。特有ではない沈殿
の危険と共に、これらの方法は鈍感でありかつ
定性的指示が得られるのに過ぎない欠点を有す
る。 (2) ゲル遮断クロマトグラフイー〔フレツチヤー
（Fletcher）及びアルクヤーエルシツク
（Alkjaersig）：Recent―Advancesin
Thrombosis、L.Poller Editor、ロンドン在、
1973年、Livingstone―Churchill版〕及びフイ
ブリンアガローゼでの親和力クロマトグラフイ
ー〔ヘーネ（Heene）及びマチアス
（Matthias）：Thromb.Research、第２巻、第
137〜154頁（1973年）〕。これらの方法は、フイ
ブリノゲンで高分子の錯体を形成するFSの性
質か又はFSの自己会合に基づく。これらの方
法は臨床上の常法とみなすことはできない。そ
れというのも該方法は実用的ではなく、かつ十
分に敏感でもないからである。 (3) 更にFSの自己会合に基づく方法は公知であ
る〔ラーゴ（Largo）、ヘーラ（Heller）及び
シユトラウプ（Straub）：Blood、第47巻、第
６号（1976年）〕。この方法では先づFSを負荷
した赤血球を調整し、次いでこれは検査すべき
試料中の溶解したFSの存在で凝集反応する。
この方法は、殊に不十分な感度のために同じよ
うに臨床的試験としては実施されない。 (4) 14―Ｃ―グリシンエステルの導入〔キスカー
（Kisker）及びラツシユ（Rush）：J.Clin.
Invest.、第50巻、第2235頁、1971年〕。フアク
ターを用いて、放射能の記号を付けた14―
Ｃ―グリシンエステルを特別にFS中に導入す
ることができる。この方法は敏感ではあるが、
余り実用的ではなく、放射能を取扱う際面倒な
方法及び費用のかかる装置を必要とする。 本発明の目的は、公知方法の欠点を除きかつま
た簡単で迅速に実施することができ、費用のかか
る装置を必要とせず、定性的、半定量的並びに定
量的測定に適当な前程の方法を得ることである。 ところで意外なことに、フイブリンモノマー
（FS）はフイブリノゲン及び他の血漿蛋白質と異
なり、疎水性ラテツクス粒子に対して大きい親和
力を示すことが判明した。 本発明による生物学的液体のフイブリンモノマ
ーを検出及び測定する方法は試料液体をラテツク
スと培養し、凝集反応を測定することからなる。 好ましくは本発明によれば、粒子又は点滴は凝
集測定装置で測定する場合には平均直径0.05〜
1.5μ、時に好ましくは0.5〜1.2μ、光度計で測定す
る場合には平均直径0.07〜0.1μを有する疎水性ラ
テツクスを使用する。しかしながら、この範囲以
外で存在する直径を有するラテツクス又は点滴も
適当である。このようにして、0.03〜10μのラツ
クス粒子を用いてもなお有用な結果が得られた。
この場合ラテツクスとは、本発明範囲内では天然
又は合成のゴム粒子、殊に水に分散した例えばス
チロール又はスチロール及びブタジエンからなる
重合体粒子又は共重合体粒子のエマルジヨン及び
その他の分散液である。本発明には、粒子又は点
滴は疎水性表面を有するのが重要である。 試料液体とラテツクスとの培養は、好ましくは
高温度で行なう。好ましくは温度30〜40℃であ
る。それというのもこの場合反応は最も迅速に進
行するからである。しかしながら、適当に延長し
た培養時間ではこれよりも低い温度か又は場合に
よりなお若干これよりも大きい温度を使用するこ
ともできる。温度37℃での予培養時間は、好まし
くは５〜15分間である。この範囲を下ると再現性
は問題であり、この範囲を越えると利点は得られ
ない。 反応は好ましくは緩衝溶液中で行ない、その場
合PH7.0〜9.0が特に適当であることが判明した。
好ましくはPH7.7〜8.7である。所望のPH範囲を調
節するためには、前記範囲内で作用する任意の緩
衝物質が適当である。好ましくはグリシン／食塩
―緩衝剤である。緩衝剤の濃度は好ましくは0.05
〜0.5Mである。 本発明方法の定性的実施は、好ましくは検査す
べき試料、例えば血漿を適当なラテツクス粒子水
懸濁液と培養するようにして行ない、その場合好
ましくは前記の温度及び時間の範囲を維持する。 続いて反応混合物を、慎重に振盪するか又は
個々の場に分けられていてもよく透明か又は十分
に観察するために暗色に色を施こされていてもよ
い試験プレート上に滴下し、試験プレートを円形
に動かす。検査液体中にFSが存在すると、粒子
の団塊化が生じ、これは肉眼で見ることができ
る。反応を十分に見得るためには粒子懸濁液を遠
心分離してもよく、その場合凝集反応粒子は非凝
集反応粒子よりも迅速かつまた容易に沈殿する。
好ましくは反応はミクロ滴定プレートで行なつて
もよく、これは読取りを速めるために付加的に遠
心分離することができる。 方法を半定量的に実施するためには、連続希釈
溶液を調製し、これを公知量のFSを含有する試
料と比較する。その場合好ましくはなお肉眼でみ
ることのできる凝集反応を生ぜしめる最高希釈段
階に反応の検出範囲を乗ずる。この検出範囲は、
公知FS含量を有する標準物を希釈によるのと同
じ方法で使用することにより測定することができ
る。定量的には方法は、凝集測定装置又は光度計
の使用で行なうことができる。 本発明方法によつて測定することのできるフイ
ブリンとは、いわゆる溶解性フイブリン、つまり
フイブリンモノマーが既に一緒になつたフイブリ
ンになつたが、表面になお真正のフイブリンモノ
マーを有するか又はいづれにせよフイブリンモノ
マーのように挙動するフイブリンの中間形であ
る。この溶解性フイブリンによつて同じようにし
て同じ凝集反応が得られ、それ故同じようにして
把握される。 ラテツクスは、好ましくは粒子含量0.1〜10％、
特に0.5〜５％を有する。ラテツクスと試料溶液
とは、容量割合約１：10〜10：１で混合する。１
％の懸濁液を使用する場合には、混合割合は好ま
しくは２：１〜１：２である。 本発明は、フイブリノゲンを直接に測定するた
めにも適当である。この場合には、試料のフイブ
リノゲン全部を、先づ公知方法でフイブリンモノ
マーに変換する。変換は、適当な酵素で行なう。
適当な酵素は例えばトロンビン又は蛇毒、例えば
バトロキソビン（Batroxobin）である。平行試
料で更にフイブリンモノマーの含量を確かめる場
合には、比較試料中の測定FS含量と酵素処理の
試料との間の差異からフイブリノゲン含量が得ら
れる。好ましくは本発明のこの実施形式では、フ
イブリノゲンのフイブリンモノマーへの変換はラ
テツクス粒子の存在で行なう。 次に実施例につき本発明を説明する。 例 １ (A) 健康な人からEDTA1mg／ml及びアプロチニ
ン0.1mg／mlの受器下に血液をとり、2000gで10
分間遠心分離する。血漿からの上澄み１mlを37
℃にし、トロンビン〔Ｔオポスタジン
（opostasin）、ロツシユ社〕0.05単位と混合す
る。0.2mlの整除量を取出し、予め準備したヘ
パリン〔リクエミン（Liquemin）、ロツシユ
社〕５単位及びヒルジン〔シグマ（Sigma）〕
0.2単位を含有する小管にピペツトでとる。整
除量の取出しの時点としては、次の時間を選ん
だ：トロンビンの添加直後、30秒、１分、２分
及び５分。このようにして、種々の量のFSを
含有する試料が得られ、これは他の検査に室温
で保存する。 (B) 試料の希釈溶液を、グリシン0.25モル及び
NaCl0.9％を含有し、1n―NaOHでPH8.2に調
節したグリシン／NaCl―緩衝剤で調製する。
平均粒径0.8μを有する10％の懸濁液の形のポリ
スチロールラテツクス〔セルバ（Serva）社、
ハイデルベルク在〕を、この緩衝剤で１：10に
希釈する。それぞれラテツクス0.05ml及び適当
な方法で予め希釈した血漿試料0.05mlを混合
し、37℃で10分間培養する。小管の内容を暗色
に着色したプラスチツクプレートの相互に別々
に分離した場に塗布し、プレートを慎重に２分
間回転し、続いてラテツクス粒子の団塊化を記
録する。血漿に対するトロンビンの作用時間が
増大するにつれて、団塊化の強度が大きくなる
ことが判明した。増大する希釈を使用すること
によつて、すべての試料になお明らかな凝集反
応が生じる希釈溶液を生ぜしめることができ
る。結果は第１表に記載されている。

【表】 緩衝剤又は血清で実施した対照物は凝集反応を
生じない。 例 ２ 例１によつて調製したFS含有試料を、グリシ
ン／NaClを含有する緩衝剤で希釈し、これに付
加的に牛の血清アルブミン１％を添加した。結果
は第２表に記載されている。

【表】 例 ３ マン（Mahn）その他：Thromb.Res.第14巻、
第651〜663頁（1979年）の処方によつて、FSを
尿素３モル、トリス50mモル、EDTA5mモル、
アプロチニン0.01％にとかした溶液（PH7.4）を
調製し、FSの含量を、0.1n−NaOHで希釈した
後に光学密度280nmで測定する。例１によつて得
られた血漿を、グリシン／NaCl（PH8.2）で１：
８に希釈する。増大量の尿素含有FS溶液を添加
することにより、FSの一定含量の試料を調製す
る；即ち０、５、10及び50μg／ml。この場合容
量の均衡はFSを含まない尿素溶液によつて行な
う。試料を例２に相応してラテツクス懸濁液と培
養し、それぞれなお凝集反応を生じる最後の希釈
段階を確かめる。２つの独立した測定からの結果
は、第３表に記載されている。

【表】 なお陽性の凝集反応をもたらす各々の範囲の希
釈から、FSの検出範囲を、各々FSの濃度に希釈
度を乗ずることにより計算することができる。平
均して、検出範囲約1.2μg／mlが得られる。 例 ４ 人間のクエン酸塩血漿含量500mg／dl及びフイ
ブリノゲン含量180mg／dlを有するフイブリノゲ
ン溶液を、牛の血清アルブミン１％を含有するグ
リシン／NaCl―緩衝剤（PH8.2）で１：100に希
釈する。これから出発して、更に連続希釈度１：
２、１：４その他をこの緩衝剤で調製し、これか
らそれぞれ0.1mlを小管にピペツトでとる。各々
の小管に、順次に0.9％のNaCl溶液で１：10に予
め希釈したバトロキソビン（Batroxobin）
〔Reptilase―Reagenz、ベーリンガー社、マン
ハイム在〕の溶液それぞれ0.1ml及び例１によつ
て調製したラテツクス0.1mlをピペツトでとり、
37℃で10分間培養する。続いて試験プレートに滴
下することによつて凝集反応力価を測定する。フ
イブリノゲン溶液には１：16、、血漿には１：８
が得られ、これは予希釈１：100を考慮すると、
１：1600又は１：800の希釈に相応する。これか
ら、フイブリノゲンの検出範囲約2.7μg／mlが計
算される。 例 ５ 例１によつて調製しトロンビンで５分間処理し
た血漿の牛の血清アルブミン含有グルシン／
NaCl―緩衝液での希釈溶液を、ラテツクス懸濁
液と37℃で種々の時間培養し、次いで凝集反応力
価を測定する。しかしながら、感度は培養時間10
分間後にもはや上らないことが判明する。 例 ６ 例３に相応して、尿素３モルにとかしたFS溶
液を調製する。グリシン／NaCl―緩衝剤（PH
8.2）にとかしたフイブリノゲン含量２mg／mlを
有するフイブリノゲン溶液を５×1mに分割し、
37℃にし、整除量に増大量のFS溶液を加えると、
10、20、30、40、及び50μg／mlの含量が生じる。 通常血小板の凝集を測定するのに使用する市場
が得られるレコーダーを有する凝集測定機〔ブラ
ウン／メルズンゲン（Braun／Melsungen）社
製〕に後から調節することのできる撹拌装置を備
える。 次の調製を行なう：フイルター546nm、37℃、
撹拌速度500r.p.m。グリシン／NaCl―緩衝剤１
mlを装入し、温度の適合度を37℃にする。これに
グリシン／NaCl―緩衝剤にとかした１％のラテ
ツクス懸濁液0.1mlを添加し、光度計で吸光度1.9
を調節する。前述のFS含有フイブリノゲン溶液
50μlを添加する。ラテツクス粒子の団塊化によつ
て溶液の澄明化が生じ、これはレコーダーによつ
て示される。実験を、順次にフイブリノゲン溶液
を含みFSの添加を有しないでFSのすべての濃度
で行なう。使用したフイブリノゲン溶液は、既に
一定含量のFSを含有することが判明した。それ
というのもFSの添加を有しなくても既に溷濁の
澄明化が立証されるからである。凝集測定機の吸
光度の最大減少はFSの濃度に対して課せられ、
その場合直線状の関係が得られ、この関係から増
大としての反応感度を読取ることができる。
FS14mE／μgが見出される。更にこの増大は、使
用したフイブリノゲン溶液中に既に含まれたFS
を測定するのに使用することができる：フイブリ
ノゲン含量51μg／ml（2.6％）が見出される。 例 ７ グベツト６個及びレコーダのクベツト交代自動
機を備えた市場で得られる光度計で次の調製を行
なう：フイルター405nm、37℃、セミミクロクベ
ツト。 クベツト６個にグリシン／NaCl―血清アルブ
ミン―緩衝剤（PH8.2）それぞれ１mlを充填し、
温度を37℃にする。クベツト１〜６中に、例１に
よつて調製したトロンビン処理の血漿試料それぞ
れ100μを入れ、混合する。次いで各々のバツ
チに、グリシン／NaCl―緩衝剤（PH8.2）で0.5％
に予め希釈したラテツクス懸濁液〔セルバ
（Serva）、平均粒径0.085μ）0.1mlを添加し、混合
し、同時にクベツト交代機並びにレコーダーを操
作する。バツチは、トロンビンでの処理時間に関
連して直線状の吸光度の増大を示し、これは第４
表に記載されている。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 生物学的液体のフイブリンモノマーを検出及
   び測定する方法において、試料液体を疎水性ラテ
   ツクスと培養し、凝集反応を測定することを特徴
   とするフイブリンモノマーを検出及び測定する方
   法。 ２ 平均粒径0.05〜1.5μを有する疎水性ラテツク
   スを使用する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 培養を、高温度で行なう特許請求の範囲第１
   項又は第２項記載の方法。 ４ 温度30〜40℃で５〜15分間培養する特許請求
   の範囲第３項記載の方法。 ５ 緩衝溶液中でPH7.0〜9.0で培養する特許請求
   の範囲第１項から第４項までのいずれか１項記載
   の方法。 ６ 定性的に実施するために、試料をラテツクス
   と培養した後に暗色の試験プレートに塗布し、凝
   集反応を確かめる特許請求の範囲第１項から第５
   項までのいずれか１項記載の方法。 ７ 定量的に実施するために、試料液体の連続希
   釈溶液を調製し、FSの公知含量の標準と比較す
   る特許請求の範囲第１項から第５項までのいづれ
   か１項記載の方法。 ８ 定量的に実施するために、光学的方法を用い
   て凝集反応によつて惹起した溷濁の変化を測定す
   る特許請求の範囲第１項から第５項までのいづれ
   か１項記載の方法。 ９ 試料液体中に存在するフイブリノゲンを、先
   づ公知方法でトロンビン又は蛇毒酵素でFSに変
   える特許請求の範囲第１項から第８項までのいず
   れか１項記載の方法。