JPH09266798A - トロンビン活性の測定法および凝集試薬 - Google Patents

トロンビン活性の測定法および凝集試薬

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JPH09266798A
JPH09266798A JP7730196A JP7730196A JPH09266798A JP H09266798 A JPH09266798 A JP H09266798A JP 7730196 A JP7730196 A JP 7730196A JP 7730196 A JP7730196 A JP 7730196A JP H09266798 A JPH09266798 A JP H09266798A
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JP
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fibrinogen
thrombin activity
thrombin
solution
amount
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JP7730196A
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English (en)
Inventor
Noriko Matsuda
徳子 松田
Masato Okada
昌人 岡田
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Tokuyama Corp
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Tokuyama Corp
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来行われていたトロンビン活性測定法の測
定範囲の考慮や煩雑な操作、他の生体成分の影響を考慮
することなく、簡便かつ短時間にトロンビン活性測定を
行うこと。 【解決手段】 フィブリノーゲンを担持した不溶性担体
に被検体を作用させ、凝集量を測定することにより、被
検体中のトロンビン活性を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は被検体中のトロンビ
ン活性を簡便かつ正確に測定するための方法およびこれ
に使用する凝集試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】トロンビン活性の測定は、被検体が血液
由来である場合、血液凝固第II因子の定量に用いられる
方法である。血液凝固第II因子(プロトロンビン)は、
活性化第X因子により活性化されトロンビンとなる。ト
ロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに転化する反
応を触媒する作用を持ち、血液凝固の最終段階に関与す
る重要な因子である。凝固系の因子のなかでもっとも多
量に血液中に存在し、肝臓で合成されるビタミンK依存
性因子の一つである。
【0003】血液凝固第II因子の先天性欠乏症、分子異
常症はきわめて少ないが、ビタミンK欠乏症ではトロン
ビン活性が著しく低下する。また、肝傷害、播種性血管
内凝固症候群(DIC)でもプロトロンビン量は減少す
る。
【0004】従来上記血液凝固第II因子の定量法には、
血液凝固第II因子をトロンビンに転化してトロンビン活
性を測定する凝固時間法や合成基質法、また、血液凝固
第II因子のタンパク量を測定する免疫学的方法がある。
【0005】凝固時間法では、被検体に血液凝固第II因
子欠乏血漿を加えて血液凝固第II因子以外の全ての因子
を補正した後凝固開始剤を加え、凝固時間、即ちトロン
ビンによるフィブリン転化にかかる時間を測定すること
により血液凝固第II因子の正常血漿に対する相対量を求
める。
【0006】合成基質法によるトロンビン活性の測定方
法では、血液凝固第II因子をトロンビンに転化した後、
トロンビンのプロテアーゼ作用に対して特異性の高い発
色性合成基質を用いて希釈被検体のトロンビン活性を測
定する。
【0007】免疫学的方法では抗血液凝固第II因子抗体
を用いて血液凝固第II因子のタンパク量を測定する。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】上記のように血液凝固
第II因子量の測定法は数多くあるが、それぞれ問題点が
ある。
【0009】凝固法は一般的に用いられている方法であ
るが、凝固時間を測定するため、使用試薬により、また
ロットにより測定値が異なる等の凝固時間法特有の問題
点が存在する。また、市販の凝固因子欠乏血漿が高価で
あるという問題点がある。
【0010】発色基質法は遊離するp−ニトロアニリン
の検出波長が405nmであるため、被検体中の他の成
分、特にビリルビン系色素の影響を大きく受けてしまう
という欠点を有し、また、測定範囲が狭く、検体を希釈
しなければならないという問題を持つ。また、合成基質
がトロンビン以外のプロテアーゼによっても切断されて
しまう危険性を持ち、さらに、合成基質が高価であると
いう問題点もある。
【0011】免疫学的方法では、トロンビン活性を持た
ない異常分子も正常分子として測定されるため、血液凝
固第II因子量と活性トロンビン量とが大きく食い違うこ
とがある。
【0012】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、簡便で正
確な測定結果が得られる測定範囲の広いトロンビン活性
の測定法を鋭意研究した結果、フィブリノーゲンを担持
した不溶性担体とトロンビンを含む被検体を作用させ、
両者による凝集度の変化量を測定することによりトロン
ビン活性を決定することができることを見いだして、本
発明を完成させるに至った。
【0013】即ち、本発明は、フィブリノーゲンを担持
した不溶性担体に被検体を作用させ、該担体の凝集量を
測定することによりトロンビン活性を決定することを特
徴とするトロンビン活性測定法である。
【0014】他の発明は、フィブリノーゲンを担持した
不溶性担体を含むことを特徴とする凝集試薬である。
【0015】本発明で用いられるフィブリノーゲンは、
特に限定されずヒト、動物由来または遺伝子組換えによ
るもの等が用いられるが、被検体中のトロンビンが作用
可能であることが必要であり、被検体がヒト由来のもの
である場合はヒト由来のフィブリノーゲンであることが
望ましい。
【0016】本発明で用いられる不溶性担体は、フィブ
リノーゲンを担持でき、担持後の担体がトロンビンの作
用により凝集するものであれば公知の担体が特に制限さ
れずに使用できる。
【0017】このような担体を例示すれば、有機高分子
粒子、無機物質粒子、生物由来粒子等が挙げられる。有
機高分子粒子としては、不溶性アガロース、セルロー
ス、不溶性デキストラン、ラテックス粒子が例示でき
る。無機物質粒子としてはシリカ、シリカ−アルミナ、
アルミナあるいはそれらにシランカップリング処理を施
し官能基を導入した粒子等が挙げられる。生物由来粒子
としてはヒトO型赤血球、ヒツジ赤血球等が挙げられ
る。好適に使用できる担体を例示すれば、ポリスチレ
ン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリ
シジル(メタ)アクリレート共重合体、スチレン−スチ
レンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アク
リル酸重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合
体等のラテックス粒子である。これらの粒子の粒径は特
に限定されるものではないが、測定機器によって0.0
5〜0.50μmのものを適宜選べばよい。担体の使用
量は測定機器によって適宜決定すればよいが、一般に測
定溶液中に0.0001〜10重量%となる量用いるの
が望ましく、懸濁液の状態で使用するのが好ましい。
【0018】本発明でいう被検体とは、測定対象である
トロンビンを含む血液、血清、血漿、唾液、尿、便、培
養物、培養液、もしくは細胞内液等の液体またはそれら
の抽出液を言う。なお、被検体が血液、血清、血漿の場
合は被検体中にプロトロンビンとトロンビンが混在して
いる可能性がある。被検体中のプロトロンビン量測定が
目的の場合は、被検体にトロンボプラスチン液を加え、
プロトロンビンをトロンビンに転化させた後、トロンビ
ン活性測定を行う。
【0019】本発明でいう凝集とは、フィブリノーゲン
担持不溶性担体同士が反応により結合した状態をいう。
凝集量は肉眼的にまたは光学的に測定が可能である。肉
眼的に凝集量を測定する方法は、スライド上で各濃度の
被検体の凝集反応を行い、凝集像の変化を肉眼であるい
は機械的に画像処理を行うことで検出する方法である。
溶液中の担持担体の凝集を光学的に検出する方法は、散
乱光強度、吸光度または透過光強度等の光学密度量を測
定する光学機器で測定を行う。光学機器での凝集量測定
は、用いる不溶性担体の粒径あるいは濃度により選択し
た好適な波長で、凝集反応開始時と終了時の2回の光学
密度量の差を測定する方法と、単位時間当たりの光学密
度量の増加もしくは減少の変化量を測定する方法により
行う。また、これらの方法を併用することも可能であ
る。単位時間当たりの光学密度変化量の測定は高い定量
性を有するため、凝集量の測定に好適に用いられる。
【0020】フィブリノーゲンを不溶性担体に担持させ
る方法としては、物理的吸着法と化学的結合法が従来知
られているが、担持操作の簡便な物理的吸着法が好適に
選択される。担時操作は通常フィブリノーゲン溶液と不
溶性担体溶液を混合して行われる。
【0021】フィブリノーゲンの不溶性担体への担持
は、通常緩衝液等の媒体中で不溶性担体1g当り0.1
〜100mgのフィブリノーゲンを用いて担持操作を行
なう。
【0022】担時操作は特に限定されないが、通常pH
4〜8の緩衝液中で行う。担時操作は通常1〜60℃の
範囲で行うが、20〜40℃が好適である。担時操作時
間は10分〜48時間が好適であり、担時操作中溶液は
静置、振盪あるいは攪拌する。
【0023】担時操作後遠心分離等の分離操作により担
持粒子を取り出し試薬原料とするのが好ましい。
【0024】フィブリノーゲン担持粒子はこのまま、あ
るいは安定化操作を施した後、試薬として用いることが
できる。安定化操作とは代表的には、アルブミンやカゼ
イン等の蛋白や界面活性化剤でさらに前記の担持操作を
行う操作をいう。
【0025】フィブリノーゲン担持担体と被検体を反応
させ、フィブリノーゲン担持担体の凝集を行わせる条件
としては、従来から知られているトロンビンの作用条件
から適宜選択して採用すればよいが、トロンビンの至適
pH、至適温度の付近で行い、トロンビンの活性が最大
に発現される条件が望ましい。
【0026】トロンビン活性測定に用いる前記フィブリ
ノーゲン担持担体の使用量は、被検体の種類により適宜
選択できるが、代表的には測定溶液中に0.0001〜
10重量%の濃度となる量がよい。
【0027】測定反応液量は、通常0.1〜10mlの
範囲で行われる。pH条件としては、通常4.0〜1
0.5が採用されるが、好ましくは6.5〜8.0の範
囲が好適であり、これらの範囲のpHを維持するために
通常緩衝液を用いる。該緩衝液の種類は特に限定され
ず、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液
等の公知の緩衝液が用いられる。この緩衝液の濃度は特
に限定されないが、例えば1〜500mMの範囲が好適
である。温度条件としては、15〜60℃の範囲が一般
的であるが、30〜40℃の範囲が好適である。
【0028】本発明におけるトロンビン活性の測定は、
被検体、フィブリノーゲン担持担体の2成分が同時に存
在してはじめて反応が進行し可能となる。従って、通常
はこの2つの成分の内1成分を含んだ溶液を調製し、設
定した条件に達した後、残りの1成分を加えることで反
応を開始させ定量に供する手段が採用される。最後に加
える成分は限定されないが、被検体を最後に加えるのが
一般的である。
【0029】トロンビン活性の測定に必要な時間は、反
応条件、測定対象となるトロンビン濃度等によって異な
り、一概に限定できないが、好ましくは設定された条件
において、その光学密度変化量を確認できるに充分な時
間であることが望ましい。そのような反応時間としては
1分〜5時間の範囲が通常採用されるが、1分〜30分
の範囲が好適である。
【0030】本発明では、既知活性のトロンビン溶液と
被検体を各々フィブリノーゲン担持担体と反応させ、生
じた凝集の度合を光学的に観察し比較することで被検体
中のトロンビン活性が測定され得る。具体的には、まず
既知活性のトロンビン標準溶液を複数測定し、得られた
光学密度変化量とトロンビン活性の関係から検量線を作
成する。次に被検体を測定しその光学密度変化量から検
量線を利用してトロンビン活性を求める。
【0031】担持担体の凝集の度合を光学的に検出する
方法においては、測定は散乱光強度、吸光度または透過
光強度を測定する光学機器で行う。測定波長は300〜
2400nmの範囲から適切な波長が選択される。定量
方法については公知の方法に従い、用いる不溶性担体の
粒径あるいは濃度の選択、反応時間の設定により、散乱
光強度、吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を
測定することにより行う。また、これらの方法を併用す
ることも可能である。
【0032】本発明によるフィブリノーゲン担持担体を
含む試薬では、トロンビン活性そのものの測定以外に、
被検体が血漿あるいは血清である場合、血液凝固因子欠
乏血漿と組み合わせることにより、該血液凝固因子の相
対量を測定することが可能である。また、既知量のトロ
ンビンを存在させることにより被検体中のトロンビン阻
害物質の定量を行うことも可能である。
【0033】
【発明の効果】本発明によるトロンビンの活性測定法
は、従来行われていた凝固法や合成基質法の煩雑な操作
や高価な試薬、他の生体成分の影響を考慮することな
く、簡便にトロンビンの活性測定を行うことができる。
また、測定範囲が広いため、検体の希釈操作を行うこと
なく汎用の生化学自動分析装置を用いて測定することが
可能なため、従来の測定法に比較して、格段に多数の検
体を測定することができる。従って、日常の作業として
トロンビンの活性測定が簡便かつ短時間に、しかも精度
良く実施出来るようになった。
【0034】
【実施例】以下実施例を上げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定される
ものではない。
【0035】実施例1 (1)フィブリノーゲン担持ラテックス懸濁液の調製 平均粒子径0.23μmのスチレン−グリシジルメタア
クリレート共重合体粒子をpH8.2の0.05Mホウ
酸ホウ砂緩衝液(以下BBと略す)で希釈してラテック
ス濃度が1%(w/v)の懸濁液を5ml調製した。次
いでフィブリノーゲン(Kabi Vitrum 社製 Grade L)を
BBで希釈した溶液(0.4mg/ml)を5ml加
え、混合した。25℃で1時間振とうした後、ウシ血清
アルブミン(Sigma 社製 Fraction V)をBBにて1%
(w/v)に調製した液を5ml添加し、さらに4時間
振とうした。次ぎに遠心分離により得られた沈殿(フィ
ブリノーゲン担持ラテックス)に20mlの0.1M塩
化ナトリウムを含むpH7.5の0.1Mトリス塩酸緩
衝液を加えてフィブリノーゲン担持ラテックス液を調製
した。
【0036】(2)トロンビン標準液の調製 ヒト血漿トロンビン(コスモバイオ社製)を0.1M塩
化ナトリウムを含むpH7.5の0.1Mトリス塩酸緩
衝液に溶解、希釈して0、10、50、100、20
0、400U/mlの標準液を調製した。
【0037】(3)測定法 (1)のフィブリノーゲン担持ラテックス液0.25m
lに0.1M塩化ナトリウムを含むpH7.5の0.1
Mトリス塩酸緩衝液0.55mlを加えた液に、被検体
0.2mlを添加攪拌し、30秒後から5分後までの波
長660nmにおける吸光度変化量を測定した。
【0038】(4)活性算出法 (3)の測定法で各トロンビン標準液及び生理食塩水
(ブランク)の吸光度変化量を測定して表1の測定値を
得た。
【0039】
【表1】
【0040】この測定値より図1の検量線を作成した。
得られた検量線より、本測定法は広い範囲のトロンビン
活性を測定可能であることがわかる。
【0041】次いで未知の被検体1〜4を測定して吸光
度変化量測定値を得、前記検量線を用いてトロンビン活
性を算出した結果を表3に示す。 比較例1 トロンビン活性測定用発色基質(第一化学薬品社製 テ
ストチーム発色基質S−2238)を用い、説明書に従
って吸光度を測定し、表2の測定値を得た。この測定値
より図2の検量線を作成した。
【0042】
【表2】
【0043】次いで未知の被検体1〜4を測定して吸光
度変化量測定値を得、それぞれ前記検量線を用いてトロ
ンビン活性を算出した結果を表3に示す。
【0044】本発明の方法と比較例の方法で測定したト
ロンビン活性値の算出値を図3に示す。図3に示す通
り、本発明の方法と比較例の方法には相関性があった。
【0045】
【表3】
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明に従って作成したトロンビン活性の検
量線の図である。
【図2】 比較例に従って作成したトロンビン活性の検
量線の図である。
【図3】 本発明に従って測定したトロンビン活性と比
較例で測定したトロンビン活性の相関図である。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 フィブリノーゲンを担持した不溶性担体
    に被検体を作用させ、該担体の凝集量を測定することに
    よりトロンビン活性を決定することを特徴とするトロン
    ビン活性の測定法。
  2. 【請求項2】 フィブリノーゲンを担持した不溶性担体
    からなることを特徴とする凝集試薬。
JP7730196A 1996-03-29 1996-03-29 トロンビン活性の測定法および凝集試薬 Pending JPH09266798A (ja)

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