JPH09266798A - トロンビン活性の測定法および凝集試薬 - Google Patents
トロンビン活性の測定法および凝集試薬Info
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- JPH09266798A JPH09266798A JP7730196A JP7730196A JPH09266798A JP H09266798 A JPH09266798 A JP H09266798A JP 7730196 A JP7730196 A JP 7730196A JP 7730196 A JP7730196 A JP 7730196A JP H09266798 A JPH09266798 A JP H09266798A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来行われていたトロンビン活性測定法の測
定範囲の考慮や煩雑な操作、他の生体成分の影響を考慮
することなく、簡便かつ短時間にトロンビン活性測定を
行うこと。 【解決手段】 フィブリノーゲンを担持した不溶性担体
に被検体を作用させ、凝集量を測定することにより、被
検体中のトロンビン活性を測定する。
定範囲の考慮や煩雑な操作、他の生体成分の影響を考慮
することなく、簡便かつ短時間にトロンビン活性測定を
行うこと。 【解決手段】 フィブリノーゲンを担持した不溶性担体
に被検体を作用させ、凝集量を測定することにより、被
検体中のトロンビン活性を測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は被検体中のトロンビ
ン活性を簡便かつ正確に測定するための方法およびこれ
に使用する凝集試薬に関する。
ン活性を簡便かつ正確に測定するための方法およびこれ
に使用する凝集試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】トロンビン活性の測定は、被検体が血液
由来である場合、血液凝固第II因子の定量に用いられる
方法である。血液凝固第II因子（プロトロンビン）は、
活性化第Ｘ因子により活性化されトロンビンとなる。ト
ロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに転化する反
応を触媒する作用を持ち、血液凝固の最終段階に関与す
る重要な因子である。凝固系の因子のなかでもっとも多
量に血液中に存在し、肝臓で合成されるビタミンＫ依存
性因子の一つである。
由来である場合、血液凝固第II因子の定量に用いられる
方法である。血液凝固第II因子（プロトロンビン）は、
活性化第Ｘ因子により活性化されトロンビンとなる。ト
ロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに転化する反
応を触媒する作用を持ち、血液凝固の最終段階に関与す
る重要な因子である。凝固系の因子のなかでもっとも多
量に血液中に存在し、肝臓で合成されるビタミンＫ依存
性因子の一つである。
【０００３】血液凝固第II因子の先天性欠乏症、分子異
常症はきわめて少ないが、ビタミンＫ欠乏症ではトロン
ビン活性が著しく低下する。また、肝傷害、播種性血管
内凝固症候群（ＤＩＣ）でもプロトロンビン量は減少す
る。
常症はきわめて少ないが、ビタミンＫ欠乏症ではトロン
ビン活性が著しく低下する。また、肝傷害、播種性血管
内凝固症候群（ＤＩＣ）でもプロトロンビン量は減少す
る。
【０００４】従来上記血液凝固第II因子の定量法には、
血液凝固第II因子をトロンビンに転化してトロンビン活
性を測定する凝固時間法や合成基質法、また、血液凝固
第II因子のタンパク量を測定する免疫学的方法がある。
血液凝固第II因子をトロンビンに転化してトロンビン活
性を測定する凝固時間法や合成基質法、また、血液凝固
第II因子のタンパク量を測定する免疫学的方法がある。
【０００５】凝固時間法では、被検体に血液凝固第II因
子欠乏血漿を加えて血液凝固第II因子以外の全ての因子
を補正した後凝固開始剤を加え、凝固時間、即ちトロン
ビンによるフィブリン転化にかかる時間を測定すること
により血液凝固第II因子の正常血漿に対する相対量を求
める。
子欠乏血漿を加えて血液凝固第II因子以外の全ての因子
を補正した後凝固開始剤を加え、凝固時間、即ちトロン
ビンによるフィブリン転化にかかる時間を測定すること
により血液凝固第II因子の正常血漿に対する相対量を求
める。
【０００６】合成基質法によるトロンビン活性の測定方
法では、血液凝固第II因子をトロンビンに転化した後、
トロンビンのプロテアーゼ作用に対して特異性の高い発
色性合成基質を用いて希釈被検体のトロンビン活性を測
定する。
法では、血液凝固第II因子をトロンビンに転化した後、
トロンビンのプロテアーゼ作用に対して特異性の高い発
色性合成基質を用いて希釈被検体のトロンビン活性を測
定する。
【０００７】免疫学的方法では抗血液凝固第II因子抗体
を用いて血液凝固第II因子のタンパク量を測定する。
を用いて血液凝固第II因子のタンパク量を測定する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上記のように血液凝固
第II因子量の測定法は数多くあるが、それぞれ問題点が
ある。
第II因子量の測定法は数多くあるが、それぞれ問題点が
ある。
【０００９】凝固法は一般的に用いられている方法であ
るが、凝固時間を測定するため、使用試薬により、また
ロットにより測定値が異なる等の凝固時間法特有の問題
点が存在する。また、市販の凝固因子欠乏血漿が高価で
あるという問題点がある。
るが、凝固時間を測定するため、使用試薬により、また
ロットにより測定値が異なる等の凝固時間法特有の問題
点が存在する。また、市販の凝固因子欠乏血漿が高価で
あるという問題点がある。
【００１０】発色基質法は遊離するｐ−ニトロアニリン
の検出波長が４０５nmであるため、被検体中の他の成
分、特にビリルビン系色素の影響を大きく受けてしまう
という欠点を有し、また、測定範囲が狭く、検体を希釈
しなければならないという問題を持つ。また、合成基質
がトロンビン以外のプロテアーゼによっても切断されて
しまう危険性を持ち、さらに、合成基質が高価であると
いう問題点もある。
の検出波長が４０５nmであるため、被検体中の他の成
分、特にビリルビン系色素の影響を大きく受けてしまう
という欠点を有し、また、測定範囲が狭く、検体を希釈
しなければならないという問題を持つ。また、合成基質
がトロンビン以外のプロテアーゼによっても切断されて
しまう危険性を持ち、さらに、合成基質が高価であると
いう問題点もある。
【００１１】免疫学的方法では、トロンビン活性を持た
ない異常分子も正常分子として測定されるため、血液凝
固第II因子量と活性トロンビン量とが大きく食い違うこ
とがある。
ない異常分子も正常分子として測定されるため、血液凝
固第II因子量と活性トロンビン量とが大きく食い違うこ
とがある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、簡便で正
確な測定結果が得られる測定範囲の広いトロンビン活性
の測定法を鋭意研究した結果、フィブリノーゲンを担持
した不溶性担体とトロンビンを含む被検体を作用させ、
両者による凝集度の変化量を測定することによりトロン
ビン活性を決定することができることを見いだして、本
発明を完成させるに至った。
確な測定結果が得られる測定範囲の広いトロンビン活性
の測定法を鋭意研究した結果、フィブリノーゲンを担持
した不溶性担体とトロンビンを含む被検体を作用させ、
両者による凝集度の変化量を測定することによりトロン
ビン活性を決定することができることを見いだして、本
発明を完成させるに至った。
【００１３】即ち、本発明は、フィブリノーゲンを担持
した不溶性担体に被検体を作用させ、該担体の凝集量を
測定することによりトロンビン活性を決定することを特
徴とするトロンビン活性測定法である。
した不溶性担体に被検体を作用させ、該担体の凝集量を
測定することによりトロンビン活性を決定することを特
徴とするトロンビン活性測定法である。
【００１４】他の発明は、フィブリノーゲンを担持した
不溶性担体を含むことを特徴とする凝集試薬である。
不溶性担体を含むことを特徴とする凝集試薬である。
【００１５】本発明で用いられるフィブリノーゲンは、
特に限定されずヒト、動物由来または遺伝子組換えによ
るもの等が用いられるが、被検体中のトロンビンが作用
可能であることが必要であり、被検体がヒト由来のもの
である場合はヒト由来のフィブリノーゲンであることが
望ましい。
特に限定されずヒト、動物由来または遺伝子組換えによ
るもの等が用いられるが、被検体中のトロンビンが作用
可能であることが必要であり、被検体がヒト由来のもの
である場合はヒト由来のフィブリノーゲンであることが
望ましい。
【００１６】本発明で用いられる不溶性担体は、フィブ
リノーゲンを担持でき、担持後の担体がトロンビンの作
用により凝集するものであれば公知の担体が特に制限さ
れずに使用できる。
リノーゲンを担持でき、担持後の担体がトロンビンの作
用により凝集するものであれば公知の担体が特に制限さ
れずに使用できる。
【００１７】このような担体を例示すれば、有機高分子
粒子、無機物質粒子、生物由来粒子等が挙げられる。有
機高分子粒子としては、不溶性アガロース、セルロー
ス、不溶性デキストラン、ラテックス粒子が例示でき
る。無機物質粒子としてはシリカ、シリカ−アルミナ、
アルミナあるいはそれらにシランカップリング処理を施
し官能基を導入した粒子等が挙げられる。生物由来粒子
としてはヒトＯ型赤血球、ヒツジ赤血球等が挙げられ
る。好適に使用できる担体を例示すれば、ポリスチレ
ン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリ
シジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチ
レンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アク
リル酸重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合
体等のラテックス粒子である。これらの粒子の粒径は特
に限定されるものではないが、測定機器によって０．０
５〜０．５０μｍのものを適宜選べばよい。担体の使用
量は測定機器によって適宜決定すればよいが、一般に測
定溶液中に０．０００１〜１０重量％となる量用いるの
が望ましく、懸濁液の状態で使用するのが好ましい。
粒子、無機物質粒子、生物由来粒子等が挙げられる。有
機高分子粒子としては、不溶性アガロース、セルロー
ス、不溶性デキストラン、ラテックス粒子が例示でき
る。無機物質粒子としてはシリカ、シリカ−アルミナ、
アルミナあるいはそれらにシランカップリング処理を施
し官能基を導入した粒子等が挙げられる。生物由来粒子
としてはヒトＯ型赤血球、ヒツジ赤血球等が挙げられ
る。好適に使用できる担体を例示すれば、ポリスチレ
ン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリ
シジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチ
レンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アク
リル酸重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合
体等のラテックス粒子である。これらの粒子の粒径は特
に限定されるものではないが、測定機器によって０．０
５〜０．５０μｍのものを適宜選べばよい。担体の使用
量は測定機器によって適宜決定すればよいが、一般に測
定溶液中に０．０００１〜１０重量％となる量用いるの
が望ましく、懸濁液の状態で使用するのが好ましい。
【００１８】本発明でいう被検体とは、測定対象である
トロンビンを含む血液、血清、血漿、唾液、尿、便、培
養物、培養液、もしくは細胞内液等の液体またはそれら
の抽出液を言う。なお、被検体が血液、血清、血漿の場
合は被検体中にプロトロンビンとトロンビンが混在して
いる可能性がある。被検体中のプロトロンビン量測定が
目的の場合は、被検体にトロンボプラスチン液を加え、
プロトロンビンをトロンビンに転化させた後、トロンビ
ン活性測定を行う。
トロンビンを含む血液、血清、血漿、唾液、尿、便、培
養物、培養液、もしくは細胞内液等の液体またはそれら
の抽出液を言う。なお、被検体が血液、血清、血漿の場
合は被検体中にプロトロンビンとトロンビンが混在して
いる可能性がある。被検体中のプロトロンビン量測定が
目的の場合は、被検体にトロンボプラスチン液を加え、
プロトロンビンをトロンビンに転化させた後、トロンビ
ン活性測定を行う。
【００１９】本発明でいう凝集とは、フィブリノーゲン
担持不溶性担体同士が反応により結合した状態をいう。
凝集量は肉眼的にまたは光学的に測定が可能である。肉
眼的に凝集量を測定する方法は、スライド上で各濃度の
被検体の凝集反応を行い、凝集像の変化を肉眼であるい
は機械的に画像処理を行うことで検出する方法である。
溶液中の担持担体の凝集を光学的に検出する方法は、散
乱光強度、吸光度または透過光強度等の光学密度量を測
定する光学機器で測定を行う。光学機器での凝集量測定
は、用いる不溶性担体の粒径あるいは濃度により選択し
た好適な波長で、凝集反応開始時と終了時の２回の光学
密度量の差を測定する方法と、単位時間当たりの光学密
度量の増加もしくは減少の変化量を測定する方法により
行う。また、これらの方法を併用することも可能であ
る。単位時間当たりの光学密度変化量の測定は高い定量
性を有するため、凝集量の測定に好適に用いられる。
担持不溶性担体同士が反応により結合した状態をいう。
凝集量は肉眼的にまたは光学的に測定が可能である。肉
眼的に凝集量を測定する方法は、スライド上で各濃度の
被検体の凝集反応を行い、凝集像の変化を肉眼であるい
は機械的に画像処理を行うことで検出する方法である。
溶液中の担持担体の凝集を光学的に検出する方法は、散
乱光強度、吸光度または透過光強度等の光学密度量を測
定する光学機器で測定を行う。光学機器での凝集量測定
は、用いる不溶性担体の粒径あるいは濃度により選択し
た好適な波長で、凝集反応開始時と終了時の２回の光学
密度量の差を測定する方法と、単位時間当たりの光学密
度量の増加もしくは減少の変化量を測定する方法により
行う。また、これらの方法を併用することも可能であ
る。単位時間当たりの光学密度変化量の測定は高い定量
性を有するため、凝集量の測定に好適に用いられる。
【００２０】フィブリノーゲンを不溶性担体に担持させ
る方法としては、物理的吸着法と化学的結合法が従来知
られているが、担持操作の簡便な物理的吸着法が好適に
選択される。担時操作は通常フィブリノーゲン溶液と不
溶性担体溶液を混合して行われる。
る方法としては、物理的吸着法と化学的結合法が従来知
られているが、担持操作の簡便な物理的吸着法が好適に
選択される。担時操作は通常フィブリノーゲン溶液と不
溶性担体溶液を混合して行われる。
【００２１】フィブリノーゲンの不溶性担体への担持
は、通常緩衝液等の媒体中で不溶性担体１ｇ当り０．１
〜１００ｍｇのフィブリノーゲンを用いて担持操作を行
なう。
は、通常緩衝液等の媒体中で不溶性担体１ｇ当り０．１
〜１００ｍｇのフィブリノーゲンを用いて担持操作を行
なう。
【００２２】担時操作は特に限定されないが、通常ｐＨ
４〜８の緩衝液中で行う。担時操作は通常１〜６０℃の
範囲で行うが、２０〜４０℃が好適である。担時操作時
間は１０分〜４８時間が好適であり、担時操作中溶液は
静置、振盪あるいは攪拌する。
４〜８の緩衝液中で行う。担時操作は通常１〜６０℃の
範囲で行うが、２０〜４０℃が好適である。担時操作時
間は１０分〜４８時間が好適であり、担時操作中溶液は
静置、振盪あるいは攪拌する。
【００２３】担時操作後遠心分離等の分離操作により担
持粒子を取り出し試薬原料とするのが好ましい。
持粒子を取り出し試薬原料とするのが好ましい。
【００２４】フィブリノーゲン担持粒子はこのまま、あ
るいは安定化操作を施した後、試薬として用いることが
できる。安定化操作とは代表的には、アルブミンやカゼ
イン等の蛋白や界面活性化剤でさらに前記の担持操作を
行う操作をいう。
るいは安定化操作を施した後、試薬として用いることが
できる。安定化操作とは代表的には、アルブミンやカゼ
イン等の蛋白や界面活性化剤でさらに前記の担持操作を
行う操作をいう。
【００２５】フィブリノーゲン担持担体と被検体を反応
させ、フィブリノーゲン担持担体の凝集を行わせる条件
としては、従来から知られているトロンビンの作用条件
から適宜選択して採用すればよいが、トロンビンの至適
ｐＨ、至適温度の付近で行い、トロンビンの活性が最大
に発現される条件が望ましい。
させ、フィブリノーゲン担持担体の凝集を行わせる条件
としては、従来から知られているトロンビンの作用条件
から適宜選択して採用すればよいが、トロンビンの至適
ｐＨ、至適温度の付近で行い、トロンビンの活性が最大
に発現される条件が望ましい。
【００２６】トロンビン活性測定に用いる前記フィブリ
ノーゲン担持担体の使用量は、被検体の種類により適宜
選択できるが、代表的には測定溶液中に０．０００１〜
１０重量％の濃度となる量がよい。
ノーゲン担持担体の使用量は、被検体の種類により適宜
選択できるが、代表的には測定溶液中に０．０００１〜
１０重量％の濃度となる量がよい。
【００２７】測定反応液量は、通常０．１〜１０ｍｌの
範囲で行われる。ｐＨ条件としては、通常４．０〜１
０．５が採用されるが、好ましくは６．５〜８．０の範
囲が好適であり、これらの範囲のｐＨを維持するために
通常緩衝液を用いる。該緩衝液の種類は特に限定され
ず、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液
等の公知の緩衝液が用いられる。この緩衝液の濃度は特
に限定されないが、例えば１〜５００ｍＭの範囲が好適
である。温度条件としては、１５〜６０℃の範囲が一般
的であるが、３０〜４０℃の範囲が好適である。
範囲で行われる。ｐＨ条件としては、通常４．０〜１
０．５が採用されるが、好ましくは６．５〜８．０の範
囲が好適であり、これらの範囲のｐＨを維持するために
通常緩衝液を用いる。該緩衝液の種類は特に限定され
ず、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液
等の公知の緩衝液が用いられる。この緩衝液の濃度は特
に限定されないが、例えば１〜５００ｍＭの範囲が好適
である。温度条件としては、１５〜６０℃の範囲が一般
的であるが、３０〜４０℃の範囲が好適である。
【００２８】本発明におけるトロンビン活性の測定は、
被検体、フィブリノーゲン担持担体の２成分が同時に存
在してはじめて反応が進行し可能となる。従って、通常
はこの２つの成分の内１成分を含んだ溶液を調製し、設
定した条件に達した後、残りの１成分を加えることで反
応を開始させ定量に供する手段が採用される。最後に加
える成分は限定されないが、被検体を最後に加えるのが
一般的である。
被検体、フィブリノーゲン担持担体の２成分が同時に存
在してはじめて反応が進行し可能となる。従って、通常
はこの２つの成分の内１成分を含んだ溶液を調製し、設
定した条件に達した後、残りの１成分を加えることで反
応を開始させ定量に供する手段が採用される。最後に加
える成分は限定されないが、被検体を最後に加えるのが
一般的である。
【００２９】トロンビン活性の測定に必要な時間は、反
応条件、測定対象となるトロンビン濃度等によって異な
り、一概に限定できないが、好ましくは設定された条件
において、その光学密度変化量を確認できるに充分な時
間であることが望ましい。そのような反応時間としては
１分〜５時間の範囲が通常採用されるが、１分〜３０分
の範囲が好適である。
応条件、測定対象となるトロンビン濃度等によって異な
り、一概に限定できないが、好ましくは設定された条件
において、その光学密度変化量を確認できるに充分な時
間であることが望ましい。そのような反応時間としては
１分〜５時間の範囲が通常採用されるが、１分〜３０分
の範囲が好適である。
【００３０】本発明では、既知活性のトロンビン溶液と
被検体を各々フィブリノーゲン担持担体と反応させ、生
じた凝集の度合を光学的に観察し比較することで被検体
中のトロンビン活性が測定され得る。具体的には、まず
既知活性のトロンビン標準溶液を複数測定し、得られた
光学密度変化量とトロンビン活性の関係から検量線を作
成する。次に被検体を測定しその光学密度変化量から検
量線を利用してトロンビン活性を求める。
被検体を各々フィブリノーゲン担持担体と反応させ、生
じた凝集の度合を光学的に観察し比較することで被検体
中のトロンビン活性が測定され得る。具体的には、まず
既知活性のトロンビン標準溶液を複数測定し、得られた
光学密度変化量とトロンビン活性の関係から検量線を作
成する。次に被検体を測定しその光学密度変化量から検
量線を利用してトロンビン活性を求める。
【００３１】担持担体の凝集の度合を光学的に検出する
方法においては、測定は散乱光強度、吸光度または透過
光強度を測定する光学機器で行う。測定波長は３００〜
２４００ｎｍの範囲から適切な波長が選択される。定量
方法については公知の方法に従い、用いる不溶性担体の
粒径あるいは濃度の選択、反応時間の設定により、散乱
光強度、吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を
測定することにより行う。また、これらの方法を併用す
ることも可能である。
方法においては、測定は散乱光強度、吸光度または透過
光強度を測定する光学機器で行う。測定波長は３００〜
２４００ｎｍの範囲から適切な波長が選択される。定量
方法については公知の方法に従い、用いる不溶性担体の
粒径あるいは濃度の選択、反応時間の設定により、散乱
光強度、吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を
測定することにより行う。また、これらの方法を併用す
ることも可能である。
【００３２】本発明によるフィブリノーゲン担持担体を
含む試薬では、トロンビン活性そのものの測定以外に、
被検体が血漿あるいは血清である場合、血液凝固因子欠
乏血漿と組み合わせることにより、該血液凝固因子の相
対量を測定することが可能である。また、既知量のトロ
ンビンを存在させることにより被検体中のトロンビン阻
害物質の定量を行うことも可能である。
含む試薬では、トロンビン活性そのものの測定以外に、
被検体が血漿あるいは血清である場合、血液凝固因子欠
乏血漿と組み合わせることにより、該血液凝固因子の相
対量を測定することが可能である。また、既知量のトロ
ンビンを存在させることにより被検体中のトロンビン阻
害物質の定量を行うことも可能である。
【００３３】
【発明の効果】本発明によるトロンビンの活性測定法
は、従来行われていた凝固法や合成基質法の煩雑な操作
や高価な試薬、他の生体成分の影響を考慮することな
く、簡便にトロンビンの活性測定を行うことができる。
また、測定範囲が広いため、検体の希釈操作を行うこと
なく汎用の生化学自動分析装置を用いて測定することが
可能なため、従来の測定法に比較して、格段に多数の検
体を測定することができる。従って、日常の作業として
トロンビンの活性測定が簡便かつ短時間に、しかも精度
良く実施出来るようになった。
は、従来行われていた凝固法や合成基質法の煩雑な操作
や高価な試薬、他の生体成分の影響を考慮することな
く、簡便にトロンビンの活性測定を行うことができる。
また、測定範囲が広いため、検体の希釈操作を行うこと
なく汎用の生化学自動分析装置を用いて測定することが
可能なため、従来の測定法に比較して、格段に多数の検
体を測定することができる。従って、日常の作業として
トロンビンの活性測定が簡便かつ短時間に、しかも精度
良く実施出来るようになった。
【００３４】
【実施例】以下実施例を上げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定される
ものではない。
が、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定される
ものではない。
【００３５】実施例１ （１）フィブリノーゲン担持ラテックス懸濁液の調製 平均粒子径０．２３μｍのスチレン−グリシジルメタア
クリレート共重合体粒子をｐＨ８．２の０．０５Ｍホウ
酸ホウ砂緩衝液（以下ＢＢと略す）で希釈してラテック
ス濃度が１％（ｗ／ｖ）の懸濁液を５ｍｌ調製した。次
いでフィブリノーゲン（Kabi Vitrum 社製 Grade L）を
ＢＢで希釈した溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｌ加
え、混合した。２５℃で１時間振とうした後、ウシ血清
アルブミン（Sigma 社製 Fraction Ｖ）をＢＢにて１％
（ｗ／ｖ）に調製した液を５ｍｌ添加し、さらに４時間
振とうした。次ぎに遠心分離により得られた沈殿（フィ
ブリノーゲン担持ラテックス）に２０ｍｌの０．１Ｍ塩
化ナトリウムを含むｐＨ７．５の０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液を加えてフィブリノーゲン担持ラテックス液を調製
した。
クリレート共重合体粒子をｐＨ８．２の０．０５Ｍホウ
酸ホウ砂緩衝液（以下ＢＢと略す）で希釈してラテック
ス濃度が１％（ｗ／ｖ）の懸濁液を５ｍｌ調製した。次
いでフィブリノーゲン（Kabi Vitrum 社製 Grade L）を
ＢＢで希釈した溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｌ加
え、混合した。２５℃で１時間振とうした後、ウシ血清
アルブミン（Sigma 社製 Fraction Ｖ）をＢＢにて１％
（ｗ／ｖ）に調製した液を５ｍｌ添加し、さらに４時間
振とうした。次ぎに遠心分離により得られた沈殿（フィ
ブリノーゲン担持ラテックス）に２０ｍｌの０．１Ｍ塩
化ナトリウムを含むｐＨ７．５の０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液を加えてフィブリノーゲン担持ラテックス液を調製
した。
【００３６】（２）トロンビン標準液の調製 ヒト血漿トロンビン（コスモバイオ社製）を０．１Ｍ塩
化ナトリウムを含むｐＨ７．５の０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液に溶解、希釈して０、１０、５０、１００、２０
０、４００Ｕ／ｍｌの標準液を調製した。
化ナトリウムを含むｐＨ７．５の０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液に溶解、希釈して０、１０、５０、１００、２０
０、４００Ｕ／ｍｌの標準液を調製した。
【００３７】（３）測定法 （１）のフィブリノーゲン担持ラテックス液０．２５ｍ
ｌに０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．５の０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液０．５５ｍｌを加えた液に、被検体
０．２ｍｌを添加攪拌し、３０秒後から５分後までの波
長６６０ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。
ｌに０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．５の０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液０．５５ｍｌを加えた液に、被検体
０．２ｍｌを添加攪拌し、３０秒後から５分後までの波
長６６０ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。
【００３８】（４）活性算出法 （３）の測定法で各トロンビン標準液及び生理食塩水
（ブランク）の吸光度変化量を測定して表１の測定値を
得た。
（ブランク）の吸光度変化量を測定して表１の測定値を
得た。
【００３９】
【表１】
【００４０】この測定値より図１の検量線を作成した。
得られた検量線より、本測定法は広い範囲のトロンビン
活性を測定可能であることがわかる。
得られた検量線より、本測定法は広い範囲のトロンビン
活性を測定可能であることがわかる。
【００４１】次いで未知の被検体１〜４を測定して吸光
度変化量測定値を得、前記検量線を用いてトロンビン活
性を算出した結果を表３に示す。 比較例１ トロンビン活性測定用発色基質（第一化学薬品社製 テ
ストチーム発色基質Ｓ−２２３８）を用い、説明書に従
って吸光度を測定し、表２の測定値を得た。この測定値
より図２の検量線を作成した。
度変化量測定値を得、前記検量線を用いてトロンビン活
性を算出した結果を表３に示す。 比較例１ トロンビン活性測定用発色基質（第一化学薬品社製 テ
ストチーム発色基質Ｓ−２２３８）を用い、説明書に従
って吸光度を測定し、表２の測定値を得た。この測定値
より図２の検量線を作成した。
【００４２】
【表２】
【００４３】次いで未知の被検体１〜４を測定して吸光
度変化量測定値を得、それぞれ前記検量線を用いてトロ
ンビン活性を算出した結果を表３に示す。
度変化量測定値を得、それぞれ前記検量線を用いてトロ
ンビン活性を算出した結果を表３に示す。
【００４４】本発明の方法と比較例の方法で測定したト
ロンビン活性値の算出値を図３に示す。図３に示す通
り、本発明の方法と比較例の方法には相関性があった。
ロンビン活性値の算出値を図３に示す。図３に示す通
り、本発明の方法と比較例の方法には相関性があった。
【００４５】
【表３】
【図１】 本発明に従って作成したトロンビン活性の検
量線の図である。
量線の図である。
【図２】 比較例に従って作成したトロンビン活性の検
量線の図である。
量線の図である。
【図３】 本発明に従って測定したトロンビン活性と比
較例で測定したトロンビン活性の相関図である。
較例で測定したトロンビン活性の相関図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 フィブリノーゲンを担持した不溶性担体
に被検体を作用させ、該担体の凝集量を測定することに
よりトロンビン活性を決定することを特徴とするトロン
ビン活性の測定法。 - 【請求項２】 フィブリノーゲンを担持した不溶性担体
からなることを特徴とする凝集試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7730196A JPH09266798A (ja) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | トロンビン活性の測定法および凝集試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7730196A JPH09266798A (ja) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | トロンビン活性の測定法および凝集試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09266798A true JPH09266798A (ja) | 1997-10-14 |
Family
ID=13630089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7730196A Pending JPH09266798A (ja) | 1996-03-29 | 1996-03-29 | トロンビン活性の測定法および凝集試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09266798A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1329723A2 (en) * | 2002-01-16 | 2003-07-23 | Lifescan, Inc. | Control compositions and methods of use for coagulation tests |
| CN101680905A (zh) * | 2008-05-22 | 2010-03-24 | 伊西康公司 | 蛋白质分析 |
| US10114032B2 (en) | 2013-05-23 | 2018-10-30 | Nippon Telegraph And Telephone Corporation | Blood coagulation test method |
| JP2023502568A (ja) * | 2019-10-17 | 2023-01-25 | ノヴァ バイオメディカル コーポレイション | 凝血アッセイ装置およびその方法 |
-
1996
- 1996-03-29 JP JP7730196A patent/JPH09266798A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1329723A2 (en) * | 2002-01-16 | 2003-07-23 | Lifescan, Inc. | Control compositions and methods of use for coagulation tests |
| EP1329723A3 (en) * | 2002-01-16 | 2003-12-17 | Lifescan, Inc. | Control compositions and methods of use for coagulation tests |
| US6746872B2 (en) | 2002-01-16 | 2004-06-08 | Lifescan, Inc. | Control compositions and methods of use for coagulation tests |
| CN101680905A (zh) * | 2008-05-22 | 2010-03-24 | 伊西康公司 | 蛋白质分析 |
| JP2011523461A (ja) * | 2008-05-22 | 2011-08-11 | エシコン・インコーポレイテッド | タンパク質アッセイ |
| US9213035B2 (en) | 2008-05-22 | 2015-12-15 | Ethicon, Inc. | Protein assay |
| US9896716B2 (en) | 2008-05-22 | 2018-02-20 | Ethicon, Inc. | Protein assay |
| US10114032B2 (en) | 2013-05-23 | 2018-10-30 | Nippon Telegraph And Telephone Corporation | Blood coagulation test method |
| JP2023502568A (ja) * | 2019-10-17 | 2023-01-25 | ノヴァ バイオメディカル コーポレイション | 凝血アッセイ装置およびその方法 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050214 |
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| A521 | Written amendment |
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|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050502 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050905 |