CN101680905A - 蛋白质分析 - Google Patents

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Abstract

描述了用于在存在纤维蛋白原的情况下测量凝血酶活性的方法或在存在凝血酶的情况下测量纤维蛋白原功能的方法。

Description

蛋白质分析
发明领域
描述了用于在存在纤维蛋白原的情况下测量凝血酶活性的方法或在存在凝血酶的情况下测量纤维蛋白原功能的方法。
发明背景：
纤维蛋白原和凝血酶是参与血管损伤后止血的关键蛋白，并且对于血凝块的形成非常重要。纤维蛋白原和凝血酶可以以粉末形式或以非水性悬浮液混合，而不会引起典型的凝块反应，从而阻止纤维蛋白凝块的形成，直到蛋白在水性介质或其它在其中蛋白是可溶的液体环境中形成水化合物。这些呈粉末形式的蛋白的混合物具有各种潜在的生物医学应用，包括局部止血、组织修复、药物递送等。此外，可以将这些蛋白的混合物以粉末形式装载至载体或基质或其它医学装置中，以形成可以例如用作止血装置的产品。
凝血酶的凝块活性通常通过将溶液中的凝血酶与溶液中已知的纤维蛋白原量混合来测量。在合适的条件下，在两种蛋白混合后凝块形成的速率取决于凝血酶的活性。将具有未知量凝血酶的样本的凝块形成的速率与凝血酶参照或凝血酶标准品的凝块形成的速率相比较以确定样本的活性。
凝血酶的活性是任何凝血酶/纤维蛋白原产品的重要属性，并且将决定其官能度。尽管游离凝血酶的测量是简单的，但当凝血酶和纤维蛋白原在未反应的混合物中时测量凝血酶的活性是具有挑战性的，因为其测量一般需要将蛋白质混合物进行水合及溶解，而溶解的凝血酶和纤维蛋白原之间的纤维蛋白凝块形成在水合后即马上开始。此外，由于已知凝血酶与立即形成的纤维蛋白凝块特异性地结合并相互作用，凝血酶变得结合在纤维蛋白凝块上且不再是游离地可溶解于水合溶液中并且使得无法用于随后的凝血酶测量。因此，通过水合和凝块形成的任何凝血酶/纤维蛋白原产品凝血酶活性的任何结果测量都仅仅是部分的，因此是不精确的。
此外，当蛋白质在未反应的混合物中被装载至载体、基质或医学装置中时，需要将蛋白质从基质中移出来以精确地测量凝血酶活性，例如，如果载体、基质或医学装置由于物理化学或光学干扰测量检测系统而对蛋白质活性或功能测量产生不利影响的话。为了克服来自载体、基质或医学装置的干扰，蛋白质的移出或提取需要在不将混合物暴露于水性条件的情况下进行，水性条件会导致妨碍随后测量的凝块的形成。
纤维蛋白原最常通过最初由Clauss描述的方法测量，其基于凝块形成的速率测量纤维蛋白原的官能度。在典型的Clauss分析中，将未知量的可溶解的纤维蛋白原与过量凝血酶混合。这样的纤维蛋白原和凝血酶比例使得纤维蛋白原成为限制速率的反应物，并且凝块形成速率是纤维蛋白原浓度的函数。快的凝固时间是高纤维蛋白原浓度的指标。反之，更长的凝固时间是低浓度的功能纤维蛋白原的指标。功能纤维蛋白原的量可以通过将样本的凝固时间与用来建立标准曲线的标准品系列的凝固时间相比较而量化。样本中纤维蛋白原的浓度可以基于衍生自标准品凝固时间的方程式以数学方式计算而确定。
尽管溶液例如人类血浆中的纤维蛋白原的测量可以通过已建立的方法进行，然而当纤维蛋白原与凝血酶一起存在时评估纤维蛋白原的官能度则是一个难题。混合物的水合将导致凝血酶介导的纤维蛋白原至不可溶纤维蛋白凝块的转变。一旦产生纤维蛋白，任何随后的纤维蛋白原的测量不再是可能的，因为导致纤维形成的纤维蛋白肽从纤维蛋白原的释放实质上是不可逆的。
因此，仍然有这样的需求，即在存在纤维素原的情况下精确测量凝血酶活性以及在存在凝血酶的情况下测量纤维蛋白原的官能度。
附图详述：
图1显示了失活溶液中pH对恢复凝血酶活性的影响。
发明简述：
本文描述了用于确定第一反应组分和第二反应组分的混合物中第一反应组分或第二反应组分的活性或官能度的方法，其包括步骤：(a)可逆地抑制第一反应组分以产生具有失活的第一反应组分和第二反应组分的混合物；(b)当评估第一反应组分活性时，往混合物中加入过量的第二反应组分，或当评估第二反应组分的活性时，加入过量的第一反应组分；(c)可逆地活化第一反应组分；(d)允许第一反应组分与混合物中的第二反应组分和过量的第二反应组分反应，或允许第一反应组分与混合物中的第二反应组分和过量的第一反应组分反应；以及(e)确定最初存在于干混合物中的第一或第二反应组分的活性或官能度。
发明详述：
如在上面讨论的那样，为了确定凝血酶和纤维蛋白原的未反应混合物(例如以粉末形式或非水性悬浮液，诸如乙醇悬浮液的形式)中凝血酶的活性，需要使蛋白质再水合化并且对于凝血酶和纤维蛋白原来说需要溶解于水化介质中，以得到凝血酶活性的精确测量。然而，一旦混合物与水化介质接触，任何溶解的凝血酶和纤维蛋白原将反应而形成即刻的凝块，并且任何可利用的凝血酶将结合至凝块并不再游离地供其测量利用。
在一个实施方案中，暂时抑制性的溶液或可逆地抑制未反应混合物中凝血酶活性，从而避免纤维蛋白凝块的形成，直到凝血酶和纤维蛋白原完全溶解。通过抑制凝血酶活性，避免了即刻的凝块形成并且凝血酶可以游离地溶解于水性水合介质中并保持供测量利用。
例如可以通过调节凝血酶的碱性环境来达到对凝血酶活性的暂时或可逆的抑制。例如，这可以通过在抑制性的溶液或失活溶液，即具有约8.5至11.5、优选约9.5至10.5、以及更优选约10的pH范围的碱性溶液中重构或水合未反应的凝血酶和纤维蛋白原以形成第一溶液来完成。表1显示了pH对恢复的凝血酶活性的影响。当失活溶液的碱性是pH 10时，观察到最大的经恢复的凝血酶活性。在9.5至10.5的pH范围内，达到了最大恢复的凝血酶活性的至少80％。在低于9.5和大于10.5的pH水平时，最大恢复的凝血酶活性随着pH水平更偏离10而降低。在9.25的pH水平或更低时，在水合过程中观察到了凝块形成的证据并且可以解释在接近中性条件的更低pH值时观测到降低的最大恢复凝血酶活性。在酸性条件下，例如pH 4或5时，最大恢复的凝血酶活性显著地低于在碱性条件下所观察到的，这可能是凝血酶不可逆失活的指示。
抑制性的溶液或失活溶液可以是碱性溶液或缓冲的碱性溶液，包括但不限于碳酸盐、TRIS碱、硼酸盐、甘氨酸、磷酸盐、甲胺、2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)或3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)溶液。
一旦凝血酶和纤维蛋白原完全地溶解于抑制性的溶液或失活的溶液中，可将第一溶液或其部分与含有已知量纤维蛋白原(优选具有过量纤维蛋白原)的第二溶液混合以形成第三溶液，同时使pH保持在约8.5至11.5、优选约9.5至10.5、以及更优选约10。由于利用了过量的纤维蛋白原，因此混合物中凝血酶的量是纤维蛋白凝块形成的限制速率的反应物，从而确保凝血酶的活性与凝块形成速率强相关。如果纤维蛋白原不是过量的，凝固速率会取决于凝血酶和纤维蛋白原两者。
此后，例如可以通过将第三溶液的pH调节至其中凝血酶活性不再受到抑制的范围，即约6.0至小于8.5、优选约7.0至小于8.5、以及更优选约7.5来逆转凝血酶活性。或者，可将具有溶解蛋白或其部分的失活溶液即第一溶液与在第二溶液中的已知量的纤维蛋白原、优选过量的纤维蛋白原混合，以形成第三溶液，由此同时逆转凝血酶活性的抑制。第二溶液的实例包括但不限于TRIS-HCl、咪唑、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、磷酸盐、巴比妥、4-吗啉基丙磺酸(MOPS)、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、柠檬酸盐或碳酸盐的缓冲溶液。
第二溶液的体积和缓冲能力应该是当加入到第一溶液时足以得到具有约6.0至小于8.5、优选从7.0至小于8.5、以及更优选约7.5的pH的第三溶液的。例如，当第二溶液的摩尔浓度是约25mM至500mM TRIS-HCl缓冲液以及优选约100mM至150mM TRIS-HCl缓冲液时，例如，第一和第二溶液的体积比典型地是约1∶1至1∶20、以及优选在约1∶4至1∶10的范围。
可以应用具有机械端点检测系统的凝结物分析仪诸如Diagnostica StagoST4凝结物分析仪来检测凝块的形成，或检测由于纤维蛋白凝块形成而致的混浊度变化的装置来确定凝血酶活性。在失活溶液中的溶解蛋白可以在这些装置之一中与第二溶液混合，并且测量凝固的时间，然后将其与已知凝血酶活性的凝固时间相关联。
另一种可以测量凝血酶活性的方法是应用凝血酶的发色或发荧光的蛋白底物。在这一方法中，将溶解的凝血酶与过量的发色或发荧光的底物混合。凝血酶将切割底物，从而释放可在分光光度计或荧光光度计中监测的发色团或荧光团。发色或发荧光的底物的实例分别包括β-Ala-Gly-Arg-p-硝基苯胺双醋酸酯和Z-Gly-Pro-Arg-AMC[Z＝苄氧羰基、AMC＝7-氨基-4-甲基香豆素。可将释放发色团或荧光团的速率与凝血酶的活性相关联。
在另一个实施方案中，可以通过调节凝血酶的碱性环境抑制凝血酶活性来测量未反应混合物中纤维蛋白原的官能度。例如，这可以通过在抑制性的溶液或失活溶液，即具有约8.5至11.5、优选约9.5至10.5、以及更优选约10的pH范围的碱性溶液中重构或水化凝血酶和纤维蛋白原的混合物以形成第一溶液来完成。抑制性的溶液或失活溶液可以是碱性溶液或缓冲碱性溶液，包括但不限于碳酸盐、TRIS(3(羟甲基)氨基甲烷)碱、硼酸盐、甘氨酸、磷酸盐、甲胺、2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)或3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)溶液。此外或任选地，可将凝血酶抑制剂，诸如比伐卢定(Angiomax)加入到抑制性的溶液或失活溶液或第一溶液中以达到最大的凝血酶活性抑制，从而允许大多数纤维蛋白原溶解，以用于随后的测试。凝血酶抑制剂的其它实例包括：抗凝血酶、肝素、低分子量肝素、低分子量肝素类似物、阿戈托班、美拉加群、依非加群、伊诺加群、达比加群、水蛭素(hirudan)及水蛭素(hirudan)衍生物，诸如重组的水蛭素和地西卢定。
一旦凝血酶的活性受到抑制，纤维蛋白原的活性可以通过如下确定：将第一溶液或其部分与具有已知量凝血酶、优选过量的凝血酶的第二溶液混合，以形成第三溶液，同时使pH保持在约8.5至11.5、优选约9.5至10.5、以及更优选约10。利用了过量的凝血酶，因此混合物中纤维蛋白原的量是纤维蛋白凝块形成的限制速率的反应物，从而确保纤维蛋白原的浓度与凝块形成速率强相关。如果凝血酶不是过量的，则凝固速率会取决于凝血酶和纤维蛋白原两者。
此后，例如可以通过将第三溶液的pH调节至其中凝血酶活性不再受到抑制的范围，即约6.0至小于8.5、优选约7.0至小于8.5、以及更优选约7.5而逆转凝血酶活性。或者，可将具有溶解蛋白的失活溶液或其部分即第一溶液与具有已知量凝血酶、优选过量的凝血酶的第二溶液混合，以形成第三溶液，由此同时逆转凝血酶活性的抑制。第二溶液的实例包括但不限于pH约为7.5的TRIS-HCl、咪唑、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、磷酸盐、巴比妥、4-吗啉基丙磺酸(MOPS)、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、柠檬酸盐或碳酸盐的缓冲溶液。
可以应用具有机械端点检测系统的凝结物分析仪诸如Diagnostica StagoST4凝结物分析仪来检测凝块形成，或检测由于纤维蛋白凝块形成而致的混浊度变化的装置来确定纤维蛋白原的官能度。在失活溶液中的溶解蛋白可以在这些装置之一中与第二溶液混合，并且测量凝固的时间，然后将其与已知纤维蛋白原官能度的凝固时间相关联。
或者，可以通过应用凝血酶抑制剂诸如比伐卢定(Angiomax)抑制凝血酶活性而确定纤维蛋白原的官能度。任选地，可以结合使用凝血酶的抑制剂来调节凝血酶的碱性环境。凝血酶抑制剂的其它实例包括：抗凝血酶、肝素、低分子量肝素、低分子量肝素类似物、阿戈托班、美拉加群、依非加群、伊诺加群、达比加群、水蛭素(hirudan)及水蛭素(hirudan)衍生物，诸如重组的水蛭素和地西卢定。一旦凝血酶的活性受到抑制，可以通过能够作用于纤维蛋白原形成凝块但不受到凝血酶抑制剂影响的类凝血酶来确定纤维蛋白原的官能度。类凝血酶的实例包括但不限于巴曲酶(得自南美响尾蛇大具窍蝮蛇(Bothrops atrox)的毒液)和安克洛酶(得自红口蝮蛇的毒液)。
当蛋白质是以未反应混合物形式被加载至载体、基质或医学装置时，例如混合物可以呈粉末形式，其中蛋白质是干燥的或经干燥的，可以通过用非水性液体提取蛋白来完成水合及溶解之前的蛋白的移出，所述非水性液体包括但不限于全氟化的碳氢化合物，诸如HFE-7000、HFE7001、HFE7003、HFE-7300和PF-5060(可从Minnesota的3M商购得到)，以及可以利用蛋白质不会溶解于其中的任何其它载体液体，诸如乙醇、乙醚或其它有机液体。一旦用非水性溶剂提取了蛋白质，就可以如上面描述的那样测量凝血酶的活性或纤维蛋白原的官能度。
或者，当蛋白质被装载至载体、基质或医学装置时，可以不用移出蛋白质而如上面所描述的那样测量凝血酶的活性或纤维蛋白原的官能度。例如，可通过将在其上具有蛋白质的载体、基质或医学装置直接置于抑制性的溶液或失活溶液中而将蛋白质水合化，所述溶液可以用于作为如上面所描述那样测量凝血酶活性或纤维蛋白原功能的样本。

Claims (33)

1.用于确定在第一反应组分和第二反应组分的未反应混合物中第一反应组分或第二反应组分的活性或官能度的方法，其包括以下步骤：
(a)可逆地抑制第一反应组分以产生具有失活的第一反应组分和第二反应组分的混合物；
(b)当评估第一反应组分的活性时，往混合物中加入已知量的第二反应组分，或当评估第二反应组分的活性时，加入已知量的第一反应组分；
(c)可逆地活化第一反应组分；
(d)允许第一反应组分与最初存在于混合物中的第二反应组分和已知量的第二反应组分反应，或允许第一反应组分与最初存在于混合物中的第二反应组分和已知量的第一反应组分反应；以及
(e)确定最初存在于混合物中的第一或第二反应组分的活性或官能度。
2.权利要求1的方法，其中第一反应组分是凝血酶并且第二反应组分是纤维蛋白原。
3.权利要求2的方法，其中凝血酶是重组体或从动物或人类得到，并且纤维蛋白原是重组体或从动物或人类得到。
4.权利要求2的方法，其中同时进行步骤(b)和(c)。
5.权利要求4的方法，其中所述混合物呈粉末形式，并且可逆抑制第一反应组分的步骤包括在具有8.5至11.5的pH范围的抑制性的溶液或第一溶液中重构第一反应组分和第二反应组分的混合物。
6.权利要求5的方法，其中所述抑制性的溶液或第一溶液具有9.5至10的pH。
7.权利要求6的方法，其中所述抑制性的溶液或第一溶液具有约10的pH。
8.权利要求5的方法，其中所述抑制性的溶液或第一溶液包含选自碳酸盐、TRIS(3(羟甲基)氨基甲烷)碱、硼酸盐、甘氨酸、磷酸盐、甲胺、2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)或3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)中的至少一种组分的碱性溶液。
9.权利要求8的方法，其中已知量的第二反应组分在第二溶液中，所述第二溶液能够使具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约6.0至小于8.5。
10.权利要求9的方法，其中已知量的第二反应组分在第二溶液中，所述第二溶液能够使具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约7.0至小于8.5。
11.权利要求10的方法，其中已知量的第二反应组分在第二溶液中，所述第二溶液能够使具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约7.5。
12.权利要求9的方法，其中能够降低抑制性的溶液或第一溶液pH的第二溶液是选自TRIS-HCl、咪唑、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)、磷酸盐、巴比妥、4-吗啉基丙磺酸(MOPS)、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、柠檬酸盐或碳酸盐中的至少一种组分的溶液。
13.权利要求12的方法，其中能够降低抑制性的溶液或第一溶液pH的第二溶液包含25mM至500mM的TRIS-HCl缓冲液。
14.权利要求13的方法，其中能够降低抑制性的溶液或第一溶液pH的第二溶液包含100mM至150mM的TRIS-HCl缓冲液。
15.权利要求9的方法，其中在步骤(b)中将已知过量的第二反应组分加入到具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液中。
16.权利要求2的方法，其中步骤(b)包括将具有已知量的第二反应组分的第二溶液加入到具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液中，以形成具有8.5至11.5的pH范围的第三溶液。
17.权利要求16的方法，其中可逆地活化第一反应组分的步骤(c)包括将第三溶液的pH调节至约6.0至8.5。
18.权利要求9的方法，其中通过动力学凝固分析确定最初存在于混合物中的第一或第二反应组分的活性或官能度，所述动力学凝固分析测量凝结时间，该凝结时间与第一或第二活性组分的已知活性或官能度相关联。
19.权利要求18的方法，其中将第一或第二活性组分的活性或官能度转换为活性单位或官能团数量。
20.权利要求9的方法，其中应用比浊法、散射测浑法、粘度法和机械端点分析方法确定最初存在于混合物中的第一或第二反应组分的活性或官能度。
21.权利要求2的方法，其中第一反应组分和第二反应组分的混合物以粉末形式位于基质上，并且通过将具有失活的第一反应组分和第二反应组分混合物的基质置于具有已知量第二反应组分的第二溶液中来实施步骤(b)。
22.权利要求2的方法，其中第一反应组分和第二反应组分的混合物是非水性的悬浮液。
23.权利要求22的方法，其中所述非水性的悬浮液包含醇、凝血酶和纤维蛋白原。
24.权利要求23的方法，其中所述醇是乙醇。
25.用于确定凝血酶和纤维蛋白原的未反应混合物中纤维蛋白原的官能度的方法，其包括以下步骤：
(a)通过在具有8.5至11.5的pH范围的抑制性的溶液或第一溶液中重构凝血酶和纤维蛋白原的混合物来抑制凝血酶而产生具有失活的凝血酶和纤维蛋白原的混合物；
(b)往混合物中加入含有已知量凝血酶的第二溶液，所述第二溶液能够使具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约6.0至小于8.5；
(c)允许所述凝血酶与所述纤维蛋白原反应；以及
(d)确定最初存在于混合物中的纤维蛋白原的官能度。
26.权利要求25的方法，其中抑制第一反应组分的步骤还包括添加凝血酶抑制剂。
27.权利要求26的方法，其中所述的凝血酶抑制剂选自：抗凝血酶、肝素、低分子量的肝素、低分子量的肝素类似物、磺达肝素、阿戈托班、美拉加群、依非加群、伊诺加群、达比加群、比伐卢定、水蛭素及水蛭素衍生物例如重组水蛭素和地西卢定。
28.用于确定凝血酶和纤维蛋白原的未反应混合物中纤维蛋白原官能度的方法，其包括以下步骤：
(a)通过在具有8.5至11.5的pH范围的抑制性的溶液或第一溶液中重构凝血酶和纤维蛋白原的混合物来抑制凝血酶而产生具有失活的凝血酶和纤维蛋白原的混合物；
(b)往混合物中加入已知量的类凝血酶，以及任选地将具有失活的第一反应组分和第二反应组分的抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约6.0至小于8.5；
(c)允许类凝血酶与纤维蛋白原反应；以及
(d)确定最初存在于混合物中的纤维蛋白原的官能度。
29.权利要求28的方法，其中抑制第一反应组分的步骤还包括添加凝血酶抑制剂。
30.权利要求28的方法，其中所述凝血酶抑制剂选自：抗凝血酶、肝素、低分子量的肝素、低分子量的肝素类似物、磺达肝素、阿戈托班、美拉加群、依非加群、伊诺加群、达比加群、比伐卢定、水蛭素及水蛭素衍生物例如重组水蛭素和地西卢定。
31.权利要求28的方法，其中所述类凝血酶是巴曲酶或安克洛酶。
32.用于确定凝血酶和纤维蛋白原的未反应混合物中凝血酶活性的方法，其包括以下步骤：
(a)通过在具有8.5至11.5的pH范围内的抑制性的溶液或第一溶液中重构凝血酶和纤维蛋白原的混合物来可逆地抑制凝血酶而产生具有失活凝血酶和纤维蛋白原的混合物；
(b)加入能够使所述抑制性的溶液或第一溶液的pH降低至约6.0至小于8.5的第二溶液；
(c)允许类纤维蛋白原与凝血酶反应；以及
(d)评估凝块的形成。
33.用于确定凝血酶和纤维蛋白原的未反应混合物中凝血酶活性的方法，其包括以下步骤：
(a)可逆地抑制凝血酶而产生具有失活的凝血酶和纤维蛋白原的混合物；
(b)往混合物中加入已知量的发色或发荧光的凝血酶底物；
(c)可逆地活化凝血酶；
(d)允许凝血酶与所述发色或发荧光的凝血酶底物反应；
(e)确定最初存在于混合物中的凝血酶的活性。
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