JP5539332B2 - タンパク質アッセイ - Google Patents
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Description
本方法は、フィブリノゲン存在下におけるトロンビン活性の測定、または、トロンビン存在下のフィブリノゲンの機能性の測定について説明する。
フィブリノゲンおよびトロンビンは、血管損傷後の止血を達成することに関与する重要なタンパク質であり、凝血形成に必須である。フィブリノゲンおよびトロンビンは、粉末状で、または、非水性懸濁液中で、一般的な凝固反応を開始することなく、組み合わせうる。したがって、水性媒体中で、または、タンパク質が可溶である他の液体環境で、タンパク質が水和されるまでフィブリン塊の形成が妨げられる。粉末状のこれらのタンパク質の混合物は、様々な潜在的な生体医学的応用を有する。生体医学的応用には、局所用止血、組織修復、薬剤送達等が含まれる。加えて、キャリアもしくは基質、または、他の医療機器上に、例えば、止血装置として用いられてもよい産物を形成するために、これらのタンパク質の混合物が粉末状で装填されてもよい。
本願では、第1反応成分および第2反応成分の混和物における、第1反応成分または第2反応成分いずれかの活性または機能性を決定するための方法であって、
(a)第1反応成分の反応性を可逆的に抑制(reversibly inhibiting the first reactive component)して、不活性な第1反応成分および第2反応成分を有する混合物を生成するステップと、
(b)混合物に、第1反応成分の活性を評価する場合、過剰な第2反応成分を添加するか、第2反応成分の活性を評価する場合、過剰な第1反応成分を添加するステップと、
(c)第1反応成分を可逆的に活性化するステップと、
(d)第1反応成分を、混合物中の第2反応成分および過剰な第2反応成分と反応させるか、または、第1反応成分を、混合物中の第2反応成分および過剰な第1反応成分と反応させるステップと、
(e)乾燥混合物中に元々存在する第1反応成分または第2反応成分の活性または機能性を決定するステップと、
を含む方法を説明する。
以上に論じたように、トロンビンとフィブリノゲンの未反応混和物(例えば、粉末状、または、エタノール懸濁液のような非水性懸濁液)のトロンビン活性を決定するために、タンパク質を再水和する必要があるし、トロンビンとフィブリノゲンについては、トロンビン活性の正確な測定を得るために、水和媒体中で可溶化する必要がある。しかしながら、一度混和物が水和媒体と接触すると、任意の可溶化トロンビンおよびフィブリノゲンはすぐに凝血塊を形成するように反応するだろうし、任意の利用可能なトロンビンは、その凝血塊と結合するだろうし、測定のために自由に利用できないだろう。
(1)第1反応成分および第2反応成分の未反応混和物における、前記第1反応成分または前記第2反応成分のいずれかの、活性または機能性を決定するための方法において、
(a)前記第1反応成分の反応性を可逆的に抑制して、不活性な第1反応成分および前記第2反応成分を有する混合物を生成するステップと、
(b)前記混合物に、前記第1反応成分の活性を評価する場合、既知量の前記第2反応成分を添加するか、または、前記第2反応成分の活性を評価する場合、既知量の前記第1反応成分を添加するステップと、
(c)前記第1反応成分を可逆的に活性化するステップと、
(d)前記第1反応成分を、前記混和物中に元々存在する前記第2反応成分、および、前記既知量の前記第2反応成分と反応させるか、または、前記第1反応成分を、前記混和物中に元々存在する前記第2反応成分、および、前記既知量の前記第1反応成分と反応させるステップと、
(e)前記混和物中に元々存在する第1反応成分または第2反応成分の、活性または機能性を決定するステップと、
を含む、方法。
(2)実施態様1に記載の方法において、
前記第1反応成分がトロンビンであり、前記第2反応成分がフィブリノゲンである、方法。
(3)実施態様2に記載の方法において、
前記トロンビンが、組換え体であるか、または、動物もしくはヒト材料に由来し、前記フィブリノゲンが、組換え体であるか、または、動物もしくはヒト材料に由来する、方法。
(4)実施態様2に記載の方法において、
ステップ(b)および(c)が同時に実施される、方法。
(5)実施態様4に記載の方法において、
前記混和物が粉末状であり、
前記第1反応成分の反応性を可逆的に抑制する前記ステップが、8.5〜11.5の範囲のpHを有する反応抑制性溶液すなわち第1溶液中に、前記第1反応成分および前記第2反応成分の前記混和物をのばすことを含む、方法。
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液が、9.5〜10.5のpHを有する、方法。
(7)実施態様6に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液が、約10のpHを有する、方法。
(8)実施態様5に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液が、炭酸塩、トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)塩基、ホウ酸塩、グリシン、リン酸塩、メチルアミン、2−(シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(CHES)、3−(シクロヘキシルアミノ)−1−プロパンスルホン酸(CAPS)、または、3−(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸(CAPSO)から成る群から選択される少なくとも1つの成分のアルカリ性溶液を含む、方法。
(9)実施態様8に記載の方法において、
前記既知量の前記第2反応成分が、前記不活性な第1反応成分および前記第2反応成分を有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを約6.0〜8.5未満に下げることのできる第2溶液中にある、方法。
(10)実施態様9に記載の方法において、
前記既知量の前記第2反応成分が、前記不活性な第1反応成分および前記第2反応成分を有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを約7.0〜8.5未満に下げることのできる第2溶液中にある、方法。
前記既知量の前記第2反応成分が、前記不活性な第1反応成分および前記第2反応成分を有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを約7.5まで下げることのできる第2溶液中にある、方法。
(12)実施態様9に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを下げることのできる前記第2溶液が、トリス塩酸、イミダゾール、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸(HEPES)、リン酸塩、バルビタール、4−モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、1,4−ピペラジンジエタンスルホン酸(PIPES)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、クエン酸塩、または、炭酸塩から成る群から選択される少なくとも1つの成分の溶液である、方法。
(13)実施態様12に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを下げることのできる前記第2溶液が、25mM〜500mMトリス塩酸緩衝液を含む、方法。
(14)実施態様13に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを下げることのできる前記第2溶液が、100mM〜150mMトリス塩酸緩衝液を含む、方法。
(15)実施態様9に記載の方法において、
ステップ(b)において、前記既知の過剰量の前記第2反応成分が、不活性な第1反応成分および前記第2反応成分を有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液に添加される、方法。
ステップ(b)が、8.5〜11.5の範囲のpHを有する第3溶液を形成するように、既知量の前記第2反応成分を有する第2溶液を、前記不活性な第1反応成分および前記第2反応成分を有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液に添加することを含む、方法。
(17)実施態様16に記載の方法において、
前記第1反応成分を可逆的に活性化するステップ(c)が、前記第3溶液のpHを約6.0〜8.5に調整することを含む、方法。
(18)実施態様9に記載の方法において、
前記混和物中に元々存在する前記第1反応成分または前記第2反応成分の、活性または機能性が、凝固時間を測定する動的凝固分析(kinetic clotting assay)によって決定され、
前記凝固時間が、前記第1活性成分または第2活性成分の、既知の活性または機能性と相関する、方法。
(19)実施態様18に記載の方法において、
前記第1活性成分または第2活性成分の活性または機能性が、活性単位または機能性数量に変換される、方法。
(20)実施態様9に記載の方法において、
前記混和物中に元々存在する前記第1反応成分または第2反応成分の、活性または機能性が、濁度測定(turbidimetry)、比濁法(nephelometry)、粘度測定(viscometry)、または、機械的終点分析法を用いて決定される、方法。
前記第1反応成分および前記第2反応成分の前記混和物が、粉末状で、基質上にあり、
ステップ(b)が、前記不活性な第1反応成分および前記第2反応成分の前記混和物を有する前記基質を、既知量の前記第2反応成分を有する第2溶液中に入れることによって、実行される、方法。
(22)実施態様2に記載の方法において、
前記第1反応成分および前記第2反応成分の前記混和物が、非水性懸濁液である、方法。
(23)実施態様22に記載の方法において、
前記非水性懸濁液が、アルコールと、トロンビンと、フィブリノゲンとを含む、方法。
(24)実施態様23に記載の方法において、
前記アルコールが、エタノールである、方法。
(25)トロンビンおよびフィブリノゲンの未反応混和物中における、フィブリノゲンの機能性を決定するための方法において、
(a)8.5〜11.5の範囲のpHを有する反応抑制性溶液すなわち第1溶液中に、前記トロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物をのばすことによって、前記トロンビンの反応性を抑制して、不活性なトロンビンおよびフィブリノゲンを有する混合物を生成するステップと、
(b)前記混合物に、前記不活性な第1反応成分および前記第2反応成分を有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを約6.0〜8.5未満に下げることのできる、第2溶液中に含まれる既知量のトロンビンを添加するステップと、
(c)前記トロンビンを、前記フィブリノゲンと反応させるステップと、
(d)前記混和物中に元々存在するフィブリノゲンの機能性を決定するステップと、
を含む、方法。
前記第1反応成分の反応性を抑制する前記ステップが、トロンビン阻害剤を添加することを更に含む、方法。
(27)実施態様26に記載の方法において、
前記トロンビン阻害剤が、アンチトロンビン、ヘパリン、低分子ヘパリン、低分子ヘパリン類似体、フォンダパリヌクス、アルガトロバン、メラガトラン、エフェガトラン、イノガトラン、ダビガトラン、ビバリルジン、ヒルダン、ならびに、レピルジンおよびデシルジンのようなヒルダン誘導体から成る群から選択される、方法。
(28)トロンビンおよびフィブリノゲンの未反応混和物中における、フィブリノゲンの機能性を決定する方法において、
(a)8.5〜11.5の範囲のpHを有する反応抑制性溶液すなわち第1溶液中に、前記トロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物をのばすことによって、前記トロンビンの反応性を抑制して、不活性なトロンビンおよびフィブリノゲンを有する混合物を生成するステップと、
(b)前記混合物に既知量のトロンビン様酵素を添加し、任意で、前記不活性な第1反応成分および前記第2反応成分を有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを約6.0〜8.5未満に下げるステップと、
(c)前記トロンビン様酵素を、前記フィブリノゲンと反応させるステップと、
(d)前記混和物中に元々存在するフィブリノゲンの機能性を決定するステップと、
を含む、方法。
(29)実施態様28に記載の方法において、
前記第1反応成分の反応性を抑制する前記ステップが、トロンビン阻害剤を添加することを更に含む、方法。
(30)実施態様28に記載の方法において、
前記トロンビン阻害剤が、アンチトロンビン、ヘパリン、低分子ヘパリン、低分子ヘパリン類似体、フォンダパリヌクス、アルガトロバン、メラガトラン、エフェガトラン、イノガトラン、ダビガトラン、ビバリルジン、ヒルダン、ならびに、レピルジンおよびデシルジンのようなヒルダン誘導体から成る群から選択される、方法。
前記トロンビン様酵素が、バトロキソビン、または、アンクロッドである、方法。
(32)トロンビンおよびフィブリノゲンの未反応混和物における、トロンビンの活性を決定するための方法において、
(a)8.5〜11.5の範囲のpHを有する反応抑制性溶液すなわち第1溶液中に、前記トロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物をのばすことによって、前記トロンビンの反応性を可逆的に抑制して、不活性なトロンビンおよびフィブリノゲンを有する混合物を生成するステップと、
(b)前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを、約6.0〜8.5未満に下げることができる第2溶液を添加するステップと、
(c)前記フィブリノゲンを、前記トロンビンと反応させるステップと、
(d)凝固塊形成を評価するステップと、
を含む、方法。
(33)トロンビンおよびフィブリノゲンの未反応混和物における、トロンビンの活性を決定するための方法において、
(a)前記トロンビンの反応性を可逆的に抑制して、不活性なトロンビンおよびフィブリノゲンを有する混合物を生成するステップと、
(b)前記混合物に、既知量の色素生産性または蛍光発生性のトロンビン基質を添加するステップと、
(c)前記トロンビンを可逆的に活性化するステップと、
(d)前記トロンビンを、前記色素生産性または蛍光発生性のトロンビン基質と反応させるステップと、
(e)前記混和物中に元々存在する前記トロンビンの活性を決定するステップと、
を含む、方法。
Claims (32)
- トロンビンおよびフィブリノゲンの未反応混和物における、トロンビンの活性またはフィブリノゲンの機能性を決定するための方法において、
(a)8.5〜11.5の範囲のpHを有する反応抑制性溶液すなわち第1溶液中に、前記トロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物を溶解することによって、前記トロンビンの反応性を可逆的に抑制して、不活性なトロンビンおよび前記フィブリノゲンを有する混合物を生成するステップと、
(b)前記トロンビンの活性を評価する場合、前記混合物に、既知量の前記フィブリノゲンを添加するか、または、前記フィブリノゲンの機能性を評価する場合、前記混合物に、既知量の前記トロンビンを添加するステップと、
(c)前記トロンビンを可逆的に活性化するステップと、
(d)前記トロンビンの活性を評価する場合、前記トロンビンを、前記混和物中に元々存在する前記フィブリノゲン、および、前記既知量の前記フィブリノゲンと反応させるか、または、前記フィブリノゲンの機能性を評価する場合、前記トロンビンを、前記混和物中に元々存在する前記フィブリノゲン、および、前記既知量の前記トロンビンと反応させるステップと、
(e)前記トロンビンの活性を評価する場合、前記混和物中に元々存在するトロンビンの活性を決定するか、または、前記フィブリノゲンの機能性を評価する場合、前記混和物中に元々存在するフィブリノゲンの機能性を決定するステップと、
を含む、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記トロンビンが、組換え体であるか、または、動物もしくはヒト材料に由来し、前記フィブリノゲンが、組換え体であるか、または、動物もしくはヒト材料に由来する、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
ステップ(b)および(c)が同時に実施される、方法。 - 請求項3に記載の方法において、
前記混和物が粉末状である、方法。 - 請求項4に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液が、9.5〜10.5のpHを有する、方法。 - 請求項5に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液が、10のpHを有する、方法。 - 請求項4に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液が、炭酸塩、トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)塩基、ホウ酸塩、グリシン、リン酸塩、メチルアミン、2−(シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(CHES)、3−(シクロヘキシルアミノ)−1−プロパンスルホン酸(CAPS)、または、3−(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホン酸(CAPSO)から成る群から選択される少なくとも1つの成分のアルカリ性溶液を含む、方法。 - 請求項7に記載の方法において、
前記既知量の前記フィブリノゲンが、前記不活性なトロンビンおよび前記フィブリノゲンを有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを6.0〜8.5未満に下げることのできる第2溶液中にある、方法。 - 請求項8に記載の方法において、
前記既知量の前記フィブリノゲンが、前記不活性なトロンビンおよび前記フィブリノゲンを有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを7.0〜8.5未満に下げることのできる第2溶液中にある、方法。 - 請求項9に記載の方法において、
前記既知量の前記フィブリノゲンが、前記不活性なトロンビンおよび前記フィブリノゲンを有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを7.5まで下げることのできる第2溶液中にある、方法。 - 請求項8に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを下げることのできる前記第2溶液が、トリス塩酸、イミダゾール、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸(HEPES)、リン酸塩、バルビタール、4−モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、1,4−ピペラジンジエタンスルホン酸(PIPES)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、クエン酸塩、または、炭酸塩から成る群から選択される少なくとも1つの成分の溶液である、方法。 - 請求項11に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを下げることのできる前記第2溶液が、25mM〜500mMトリス塩酸緩衝液を含む、方法。 - 請求項12に記載の方法において、
前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを下げることのできる前記第2溶液が、100mM〜150mMトリス塩酸緩衝液を含む、方法。 - 請求項8に記載の方法において、
ステップ(b)において、前記既知の過剰量の前記フィブリノゲンが、不活性なトロンビンおよび前記フィブリノゲンを有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液に添加される、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
ステップ(b)が、8.5〜11.5の範囲のpHを有する第3溶液を形成するように、既知量の前記フィブリノゲンを有する第2溶液を、前記不活性なトロンビンおよび前記フィブリノゲンを有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液に添加することを含む、方法。 - 請求項15に記載の方法において、
前記トロンビンを可逆的に活性化するステップ(c)が、前記第3溶液のpHを6.0〜8.5に調整することを含む、方法。 - 請求項8に記載の方法において、
前記混和物中に元々存在する前記トロンビンの活性または前記混和物中に元々存在する前記フィブリノゲンの機能性が、凝固時間を測定する動的凝固分析によって決定され、
前記凝固時間が、前記トロンビンの既知の活性または前記フィブリノゲンの既知の機能性と相関する、方法。 - 請求項17に記載の方法において、
前記トロンビンの活性または前記フィブリノゲンの機能性が、活性単位または機能性数量に変換される、方法。 - 請求項8に記載の方法において、
前記混和物中に元々存在する前記トロンビンの活性または前記混和物中に元々存在する前記フィブリノゲンの機能性が、濁度測定、比濁法、粘度測定、または、機械的終点分析法を用いて決定される、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記トロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物が、粉末状で、基質上にあり、
ステップ(b)が、前記不活性なトロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物を有する前記基質を、既知量の前記フィブリノゲンを有する第2溶液中に入れることによって、実行される、方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記トロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物が、非水性懸濁液である、方法。 - 請求項21に記載の方法において、
前記非水性懸濁液が、アルコールと、トロンビンと、フィブリノゲンとを含む、方法。 - 請求項22に記載の方法において、
前記アルコールが、エタノールである、方法。 - トロンビンおよびフィブリノゲンの未反応混和物中における、フィブリノゲンの機能性を決定するための方法において、
(a)8.5〜11.5の範囲のpHを有する反応抑制性溶液すなわち第1溶液中に、前記トロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物を溶解することによって、前記トロンビンの反応性を抑制して、不活性なトロンビンおよびフィブリノゲンを有する混合物を生成するステップと、
(b)前記混合物に、前記不活性なトロンビンおよび前記フィブリノゲンを有する前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを6.0〜8.5未満に下げることのできる、第2溶液中に含まれる既知量のトロンビンを添加するステップと、
(c)前記トロンビンを、前記フィブリノゲンと反応させるステップと、
(d)前記混和物中に元々存在するフィブリノゲンの機能性を決定するステップと、
を含む、方法。 - 請求項24に記載の方法において、
前記トロンビンの反応性を抑制する前記ステップが、トロンビン阻害剤を添加することを更に含む、方法。 - 請求項25に記載の方法において、
前記トロンビン阻害剤が、アンチトロンビン、ヘパリン、低分子ヘパリン、低分子ヘパリン類似体、フォンダパリヌクス、アルガトロバン、メラガトラン、エフェガトラン、イノガトラン、ダビガトラン、ビバリルジン、ヒルダン、ならびに、レピルジンおよびデシルジンのようなヒルダン誘導体から成る群から選択される、方法。 - トロンビンおよびフィブリノゲンの未反応混和物中における、フィブリノゲンの機能性を決定する方法において、
(a)8.5〜11.5の範囲のpHを有する反応抑制性溶液すなわち第1溶液中に、前記トロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物を溶解することによって、前記トロンビンの反応性を抑制して、不活性なトロンビンおよびフィブリノゲンを有する混合物を生成するステップと、
(b)前記混合物に既知量のトロンビン様酵素を添加するステップと、
(c)前記トロンビン様酵素を、前記フィブリノゲンと反応させるステップと、
(d)前記混和物中に元々存在するフィブリノゲンの機能性を決定するステップと、
を含む、方法。 - 請求項27に記載の方法において、
前記トロンビンの反応性を抑制する前記ステップが、トロンビン阻害剤を添加することを更に含む、方法。 - 請求項27に記載の方法において、
前記トロンビン阻害剤が、アンチトロンビン、ヘパリン、低分子ヘパリン、低分子ヘパリン類似体、フォンダパリヌクス、アルガトロバン、メラガトラン、エフェガトラン、イノガトラン、ダビガトラン、ビバリルジン、ヒルダン、ならびに、レピルジンおよびデシルジンのようなヒルダン誘導体から成る群から選択される、方法。 - 請求項27に記載の方法において、
前記トロンビン様酵素が、バトロキソビン、または、アンクロッドである、方法。 - トロンビンおよびフィブリノゲンの未反応混和物における、トロンビンの活性を決定するための方法において、
(a)8.5〜11.5の範囲のpHを有する反応抑制性溶液すなわち第1溶液中に、前記トロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物を溶解することによって、前記トロンビンの反応性を可逆的に抑制して、不活性なトロンビンおよびフィブリノゲンを有する混合物を生成するステップと、
(b)前記混合物に、前記反応抑制性溶液すなわち第1溶液のpHを、6.0〜8.5未満に下げることができる第2溶液に含まれる既知量のフィブリノゲンを添加するステップと、
(c)前記フィブリノゲンを、前記トロンビンと反応させるステップと、
(d)凝固塊形成を評価するステップと、
を含む、方法。 - トロンビンおよびフィブリノゲンの未反応混和物における、トロンビンの活性を決定するための方法において、
(a)8.5〜11.5の範囲のpHを有する反応抑制性溶液すなわち第1溶液中に、前記トロンビンおよび前記フィブリノゲンの前記混和物を溶解することによって、前記トロンビンの反応性を可逆的に抑制して、不活性なトロンビンおよびフィブリノゲンを有する混合物を生成するステップと、
(b)前記混合物に、既知量の色素生産性または蛍光発生性のトロンビン基質を添加するステップと、
(c)前記トロンビンを可逆的に活性化するステップと、
(d)前記トロンビンを、前記色素生産性または蛍光発生性のトロンビン基質と反応させるステップと、
(e)前記混和物中に元々存在する前記トロンビンの活性を決定するステップと、
を含む、方法。
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