ES2355110T3 - Método para la determinación automática del potencial endógeno de trombina. - Google Patents

Abstract

Método para la determinación del potencial endógeno de trombina (PET) de una muestra de sangre o plasma coagulados, donde la cinética de reacción de un sustrato de trombina es medida como función del tiempo, caracterizado porque a) se determina el rango lineal de la fase de saturación de la cinética total de reacción dentro de una ventana de tiempo predeterminada específica de la prueba, y después b) por medio de la pendiente A de la cinética de reacción en el rango lineal de la fase de saturación, la cual corresponde a la pendiente de la cinética α2MT, se determina de manera iterativa la constante de enlace C de trombina a la α2-macroglobulina según la ecuación: con C0 = 0 e i número índice para el valor de cinética de trombina T en el punto de tiempo ti, j número índice para las iteraciones, y entonces c) se determinan los valores de cinética α2MT y se sustraen de los valores asociados de la cinética total de reacción, y después d) mediante promedio de los valores de cinética de la trombina libre, los cuales fueron determinados para el rango lineal de la cinética total de reacción en la fase de saturación, se determina el valor bruto de PET.

Description

La presente invención se refiere a un método para la determinación automática del potencial endógeno de trombina en una muestra de sangre o plasma.

La regulación de la hemóstasis ocurre mediante la interacción de diferentes activadores, inhibidores, así como 5 mecanismos de retroalimentación positiva y negativa. Los defectos en esta estructura pueden conducir a un desbalance en el sistema de hemóstasis y tener como consecuencia bien sea una hemorragia o una trombosis.

La trombina, una serinproteasa, es la enzima central de la coagulación sanguínea plasmática, cuya función principal es la inducción de la polimerización de la fibrina y con ello la formación del coágulo. En caso de necesidad, la formación de trombina es puesta en marcha mediante la activación 10

de la molécula precursora enzimática inactiva protrombina. Para, en el caso de lesión, limitar local y temporalmente el proceso de coagulación, ocurre prontamente una restricción de la coagulación, entre otros mediante la complejación y con ello inactivación de la trombina libre, por factores inhibidores como por ejemplo antitrombina o α2-macroglobulina (α2M). Los desórdenes en el interior del proceso, que regula la formación o inhibición de trombina, pueden conducir a estados hiper- o bien hipocoagulatorios y con ello a desórdenes patológicos en la coagulación. 15 En la detección de la formación y la inhibición de la trombina está por consiguiente una inmensa significancia de los respectivos estados de coagulación.

La capacidad (potencial) intrínseca (endógena) de una muestra particular de plasma, en el caso de muestras de plasma, para la formación e inhibición de trombina libre enzimáticamente activa es definida también como potencial endógeno de trombina (PET). Puesto que todos los componentes biológicos que están presentes en material de 20 ensayo y pueden influir en la inhibición y formación de trombina, condicionan el potencial individual de trombina de una muestra, la determinación de PET es adecuada tanto como prueba global, con la que pueden incluirse los componentes del sistema de hemóstasis, como también para la vigilancia de medidas terapéuticas.

Un parámetro que es determinado preferiblemente para la cuantificación del potencial endógeno de trombina y que en la literatura es definido también como "potencial endógeno de trombina", es la integral de tiempo/concentración o 25 bien la superficie bajo la curva de la formación de trombina [ver EP 0 420 332-B1, EP 0 802 986-B1 y Hemker et al. (1993) Thromb. Haemostasis 70: 617-624]. Este parámetro es una medida de la cantidad y de la actividad de la trombina endógena, la cual estaba presente desde un tiempo t = 0 en una muestra de sangre o plasma coagulada.

Para la determinación del PET, en una muestra de sangre o plasma que tiene la capacidad de coagular, se mide el rendimiento cinético de un sustrato de trombina por la liberación de un indicador medible. Puesto que la 30 concentración de sustrato de trombina es ajustada de modo que en el curso de la reacción el sustrato no puede ser consumido completamente, la cantidad de un indicador liberado se comporta idealmente de modo proporcional a la actividad enzimática de la trombina formada en el transcurso de la reacción de coagulación.

Sin embargo, se sabe que con los sustratos actualmente disponibles de trombina, los cuales exhiben un tamaño de molécula inferior a 8 kD, adicionalmente a la actividad fisiológicamente relevante de la trombina libre también se 35 mide la actividad fisiológicamente irrelevante del complejo α2-macroglobulina-trombina (α2MT). A partir de la medición de la cantidad de indicador liberado a lo largo del tiempo resulta una cinética de reacción, la cual no alcanza ninguna fase de plató a pesar de lo avanzada y finalmente completa inhibición de la trombina libre, sino que se eleva nuevamente.

Para deducir la cinética de la trombina fisiológicamente relevante T(t) proveniente de la cinética total de reacción 40 medida, debe determinarse de manera conocida la fracción α2MT (t) de la actividad del complejo α2MT y sustraerlo de la cinética total K (t):

La cantidad de complejo α2MT es directamente dependiente de la cantidad de trombina libre. A partir de la molécula precursora enzimáticamente inactiva de la protrombina se forma primero que todo la trombina libre, la cual es 45 formada directamente a partir de la α2-macroglobulina, mediante lo cual se forma el complejo α2MT relativamente estable. Puesto que también la concentración del complejo α2MT cambia en el curso de la reacción de modo proporcional a la concentración de trombina, se describió como ecuación diferencial la correlación matemática entre la cinética de trombina T (t) y la cinética α2MT (t) del complejo α2MT [Hemker et al. (1993) Thromb. Haemostasis 70: 617-624]: 50

con

 diferencial parcial

α2MT (t) concentración del complejo α2-macroglobulina-trombina en el punto de tiempo t

T (t) concentración de trombina en el punto de tiempo t

C constante para el enlace de trombina a α2M. 5

Los métodos de valoración hasta ahora conocidos para la determinación del potencial endógeno de trombina o bien de la concentración de trombina libre [Hemker et al. (1993) Thromb. Haemostasis 70: 617-624; WO 2004/016807-A1, Wielders et al, Thromb. Haemostasis 77: 629-636; Kessels et al, Comput. Biol. Med. 24 : 277-288] describen vías muy complejas para la solución de esta ecuación diferencial (2). El método conocido determina la cinética del complejo α2-macroglobulina-trombina, según la cual se forma, antes de todo, la primera derivada de la cinética total 10 de reacción. Los promedios necesarios resultantes de este procedimiento de analítico pueden en suma conducir a inexactitudes. Para la determinación de las constantes C para el enlace de trombina a la α2-macroglobulina se indican métodos complejos de optimización, por ejemplo el método modificado de Newton del programa de software "Microsoft EXCEL Solver", cuya especificación la mayoría de las veces no es conocida para el usuario y la cual tampoco no siempre llega a un resultado. Además se consideran una serie de parámetros enzimocinéticos, como 15 por ejemplo las constantes de Michaelis de sustratos específicos para, partiendo de la cantidad de sustrato que reaccionó, poder inferir la cantidad de trombina libre. Estos parámetros específicos de sustrato tienen que ser bien sea conocidos a partir de la literatura o calculados en pruebas previas para el sustrato empleado.

La realización del método conocido hasta ahora para la determinación del potencial endógeno de trombina en equipos que pueden emplearse en el laboratorio de coagulación, es limitada en tanto que debido a la complejidad 20 del método conocido hasta ahora es indispensable una elevada capacidad de almacenamiento de datos y resulta un tiempo de cálculo relativamente largo. Para laboratorios diagnósticos que tienen que cumplir con una elevada capacidad de procesamiento de muestras, por razones de capacidad son una desventaja particular los largos tiempos de procesamiento.

La presente invención basó por consiguiente su objetivo en poner a disposición un método simplificado que hiciera 25 posible una determinación rápida y segura del potencial endógeno de trombina en equipos comunes de análisis para el diagnóstico de la coagulación.

La solución de este objetivo es la puesta a disposición de los métodos y elementos acordes con la invención descritos en las reivindicaciones.

La presente invención para la determinación del potencial endógeno de trombina (PET) de una muestra incluye 30

1. La determinación, conocida por el experto de la cinética de reacción de un sustrato de trombina como función del tiempo y

2. La determinación acorde con la invención de un valor bruto PET, el cual hace posible la cuantificación del potencial endógeno de trombina de una muestra.

La medición de la cinética de reacción de un sustrato de trombina, necesaria para la determinación del potencial 35 endógeno, exige que la muestra analizada sea mezclada con un sustrato de trombina, el cual induce la formación de trombina, por ejemplo mediante la adición de un activador de formación de trombina, y exige que se mida una propiedad física o química del sustrato de trombina que reaccionó, como función del tiempo.

Como materiales de muestras son adecuados por ejemplo sangre o plasma de origen humano o animal. Son particularmente bien adecuados los plasmas ricos en plaquetas o pobres en plaquetas, los cuales pueden ser 40 mezclados con EDTA y/o citrato.

Como sustratos de trombina son adecuados por ejemplo oligopéptidos, que se componen de una parte que incluye una secuencia específica de reconocimiento para la trombina, y de una señal de grupo saliente con una propiedad física medible. La señal de grupo saliente, la cual de modo preferible después de la separación dispone de una propiedad física modificada, puede ser por ejemplo un grupo cromóforo, quimioluminiscente o fluorescente cuya 45 propiedad puede ser medida. Son grupos comóforos de señal preferidos aquellos cuya propiedad óptica puede ser medida fotométricamente, como por ejemplo para-nitroanilida (pNA), cuya absorción por la trombina después de la separación puede ser medida a una longitud de onda de 405 nm. Son ejemplos de sustratos sintéticos de trombina los que son adecuados para la ejecución de la presente invención, por ejemplo los descritos en las reivindicaciones 1 a 5 de la patente EP 0 802 986-B1. 50

La concentración de sustrato de trombina es ajustada de modo que en el transcurso de la reacción el sustrato puede no ser agotado completamente, con lo que la cantidad de indicador liberado se comporta de manera proporcional a la actividad enzimática de la trombina libre y como complejo de α2-macroglobulina formada en el curso de la reacción de coagulación [ver Hemker et al. (1993) Thromb. Haemostasis 70: 617-624].

Para evitar la formación de molestos coágulos de fibrina la muestra puede ser bien sea desfibrinada con ayuda de métodos antes conocidos, como por ejemplo mediante la adición de venenos de serpientes como por ejemplo batroxobina, mediante calor, mediante precipitación o mediante cromatografía de inmunoafinidad, o puede añadirse a la muestra un inhibidor de polimerización de fibrina. Péptidos que son adecuados para la inhibición de la polimerización de fibrina, sin inhibir la trombina presente en la mezcla son por ejemplo objeto de las reivindicaciones 5 1 y 2 de la patente EP 0 456 152-B1.

Para inducir la formación de trombina pueden por ejemplo emplearse soluciones que contienen iones Ca2+ y adicionalmente por ejemplo tromboplastina o un activador de contacto como por ejemplo caolín, fosfolípidos, veneno de serpiente o trombomodulina y proteína C activada. Dependiendo del cuestionamiento diagnóstico, el experto puede elegir de entre una multiplicidad de activadores conocidos de la coagulación de la sangre, para observar bien 10 sea un rango parcial o a la totalidad del sistema de coagulación (ver también EP 0420 332-B1).

La medición de la propiedad física de sustrato de trombina que reaccionó ocurre preferiblemente a partir de la adición a la muestra de activador de la formación de trombina, preferiblemente en intervalos de tiempo de 1 a 25 medidas por 10 segundos. Los valores de medida asignados cronológicamente describen la cinética de reacción de sustrato de trombina o bien la cinética total de reacción (ver también curva A en las figuras 1 a 3). La pendiente de la 15 curva de reacción total es una medida de la velocidad de reacción con la que se escinde el sustrato de trombina o bien con la que se libera el grupo señal (indicador).

La medición de la cantidad de indicador liberado sobre el tiempo suministra una curva típica de reacción total la cual por inspección visual puede ser dividida a grosso modo en tres fases:

a) una primera fase, la denominada fase de inducción, la cual comienza con la adición del activador de formación de 20 trombina en el punto t0 y se caracteriza por un trazado plano de la curva, por consiguiente una baja velocidad de reacción. Es el estado de la reacción en el cual comienza la formación de trombina. Dependiendo de la estructura de la prueba la fase de inducción puede durar entre 0 y 30 minutos.

b) Una segunda fase, la denominada fase exponencial, la cual sigue a la fase de inducción y la cual se caracteriza por un trazado de pendiente inclinada, por consiguiente una alta velocidad de reacción. Esta fase abarca el 25 segmento de reacción en el cual la tasa de formación de trombina alcanza su máximo y finalmente también la tasa de inhibición de trombina es máxima. En esta fase ocurre la reacción de sustrato de trombina tanto mediante la trombina libre como también mediante la actividad del complejo α2-macroglobulina-trombina (α2MT). Esta fase dura hasta el punto de tiempo en el cual ya no hay más trombina libre.

c) una tercera fase, la denominada fase de saturación, la cual se caracteriza por un transcurso de la curva 30 continuamente ascendente sin embargo comparativamente plano comparado con la fase exponencial. Esta fase abarca el segmento de reacción en el cual la transformación del sustrato de trombina es atribuible exclusivamente a la actividad del complejo de α2-macroglobulina-trombina (α2MT). Esta fase es reconocida porque la velocidad de reacción o bien la cantidad de indicador liberado por unidad de tiempo permanece constante, mediante lo cual la cinética total de reacción adopta un transcurso lineal ascendente de modo continuo. 35

El curso de la curva de reacción o bien la duración de las tres diferentes fases de reacción depende - aparte del potencial endógeno de la muestra para la formación e inhibición de trombina - de las condiciones de reacción específicas elegidas para la prueba. Ejemplos de tales condiciones de reacción, las cuales pueden ser modificadas por el experto dependiendo del cuestionamiento diagnóstico y las cuales repercuten en la cinética de reacción, son el tipo o también la concentración del activador de trombina empleado o el tipo y forma de pretratamiento del 40 material de muestra. Dependiendo de la estructura de la prueba, se determina empíricamente la duración total de la reacción en pruebas piloto rutinarias, para poder adaptar la duración de medida de manera que en una medición sean tenidas en cuenta suficientemente todas las tres fases de reacción. Como resulta del ejemplo de ejecución y las figuras 1 a 3, para la determinación del potencial endógeno de trombina allí representada a modo de ejemplo es suficiente una duración del tiempo total de reacción de 20 minutos. 45

La medición continúa por el tiempo necesario hasta que terminan la formación o inhibición de la trombina libre en la prueba y la cinética de reacción medida del sustrato de trombina es atribuida sólo a la actividad del complejo α2-macroglobulina-trombina (α2MT). Una duración de medida particularmente preferida se caracteriza porque el segmento de reacción en el que la transformación del sustrato de trombina es atribuible exclusivamente a la actividad del complejo α2-macroglobulina-trombina (α2MT), es decir la fase de saturación, se prolonga por un período 50 de tempo lo suficientemente largo de modo que es posible una determinación segura del valor bruto de PET.

El método acorde con la invención se caracteriza porque, primero que todo, dentro de una ventana de tiempo predeterminada específica de la prueba se determina en el rango lineal de la fase de saturación de la cinética total de reacción.

Esta ventana de tiempo, cuyo punto de inicio en lo que sigue es definido como tmin y cuyo punto final también es 55 definido como tend, es fijada de modo que con seguridad excluye la fase de inducción, puesto que el rango lineal de la cinética de reacción, la cual se presenta posiblemente en el curso de la fase de inducción, debería estar excluida de la evaluación.

El punto de inicio tmin es fijado de modo que él está después de la fase de inducción. Preferiblemente el punto de inicio tmin se posiciona al final de la fase exponencial o bien en el rango de transición de la fase exponencial a la fase de saturación (ver también Fig. 1).

El punto final tend es entonces fijado de modo que se ubica en la fase de saturación y la ventana de tiempo resultante tmin a tend abarca por lo menos tres puntos de medida dentro de la fase de saturación. 5

Preferiblemente se fija el tamaño y posición de la ventana de tiempo de modo que esta abarca más de tres puntos de medición en la fase de saturación, particularmente preferido 4 a 500 puntos de medición, muy particularmente preferido 100 a 300 puntos de medición.

La ventana de tiempo, dentro de la cual debería determinarse el rango lineal, es un parámetro específico de prueba que es fijado dependiendo de las condiciones elegidas de reacción. Con este propósito el experto puede determinar 10 en una serie de pruebas piloto rutinarias el curso típico de la curva de reacción bajo iguales condiciones de reacción. De modo ventajoso, para estas pruebas piloto se emplean muestras conocidas, las cuales disponen de diferentes potenciales endógenos de trombina (abreviatura: valores PET), con lo cual en la determinación previa de la ventana de tiempo específica de la prueba puede tenerse en cuenta la variabilidad de la duración de las fases de reacción. De esta forma, el experto puede definir la ventana de tiempo de manera que en la evaluación de muestras 15 desconocidas se asegura que el punto de inicio tmin es fijado cronológicamente siempre después de la fase de inducción y el punto final tend es fijado de modo que la ventana de tiempo resultante abarca por lo menos tres puntos de la fase de saturación.

La determinación del rango lineal dentro de la ventana de tiempo predeterminada ocurre preferiblemente con ayuda de un método de regresión. 20

En una forma particularmente preferida de operar de un método de regresión, para cada posible ventana de tiempo cuyo punto final corresponde a tend y cuyo punto inicial corresponde a tmin o un punto cualquiera de medición dentro de la ventana de tiempo predeterminada tmin a tend, se forma el cuadrado del coeficiente de correlación r de Pearson:

con 25

n número de puntos de medición en la ventana de tiempo

i variable numérica

ti serie con los valores de tiempo de la cinética de reacción medida

Ki serie con los valores medidos de la cinética de reacción medida.

El cuadrado del coeficiente de correlación de Pearson r2 es una medida de la linealidad de la curva de reacción en el 30 respectivo rango de medida o bien ventana de tiempo. r2 puede adoptar valores entre 0 y 1. Cuanto más alto es el valor, tanto mejor es la linealidad. Se determina el máximo del cuadrado del coeficiente de correlación de Pearson ri así calculado y se elige la ventana de tiempo con el valor máximo, por consiguiente rango o bien segmento de reacción con el mejor trazado lineal.

Para el caso en el que varias ventanas de tiempo exhiban el mismo valor máximo, se elige la más grande de estas 35 ventanas.

En otra forma preferida de operar, puede definirse una extensión mínima necesaria para el rango lineal. Para garantizar una determinación particularmente confiable del potencial endógeno de trombina, el experto quiso fijar que el rango lineal, en el cual finalmente debería basarse la determinación del potencial endógeno de trombina, no debería estar por debajo de un número mínimo definido de puntos de medición, es decir de una extensión mínima 40 definida. Puesto que la extensión mínima del rango lineal, la cual debería ser consultada para la determinación del valor bruto PET, debería ser hecha dependiendo del curso de la curva de reacción o bien de la dispersión de los valores de medida en el rango lineal, el experto debería ajustar la extensión mínima a las condiciones de reacción específicas de la prueba elegidas por él, de modo que se dé una suficiente seguridad estadística para la determinación de un valor bruto PET confiable. Para el caso en que la ventana de tiempo con el mejor curso lineal 45 no satisfaga el alcance mínimo especificado, puede entonces emplearse por ejemplo el alcance para la evaluación subsiguiente, la cual incluye exactamente la cantidad mínima definida de puntos de medida y cuyo punto final corresponde a tend. En eso la ventaja de este proceder consiste en que, por ejemplo, también cinéticas en las cuales

valores individuales de medida se desvían fuertemente ("dispersión") no tienen que ser completamente descartados sino que pueden ser aún evaluados. Un valor bruto PET determinado de tal manera puede ser emitido con una referencia correspondiente, con lo cual el usuario por ejemplo puede examinar la curva de reacción por evaluación visual.

El método acorde con la invención se caracteriza además porque en virtud de la pendiente A de la cinética total de 5 reacción en el rango lineal de la fase de saturación, la cual corresponde a la pendiente de la cinética α2MT, se determina de manera iterativa la constante de enlace C de trombina a la α2-macroglobulina.

Este paso del método se basa en que la reacción de sustrato de trombina en la fase de saturación reduce únicamente la actividad enzimática del complejo α2MT. La velocidad de reacción con el sustrato de trombina es dividida, es decir la cantidad de indicador liberado, el cual es liberado por unidad de tiempo, se correlaciona con la 10 pendiente de la curva total de reacción. Puesto que la concentración del complejo α2MT en la fase de saturación permanece constante, se divide por unidad de tiempo la misma cantidad de sustrato de trombina, mediante lo cual sube de manera lineal la curva total de reacción. En consecuencia, la pendiente A del rango lineal de la cinética total de reacción K (t) en la fase de saturación puede ser puesta a nivel con la pendiente de la cinética t de α2MT, α2MT (t). 15

Considerando la ecuación diferencial (2)

vale por consiguiente:

La pendiente A de la cinética total de reacción K (t) puede ser calculada de modo preferido con ayuda de una 20 regresión lineal:

con:

n número de puntos de medida en el rango lineal de la fase de saturación

i variable numérica 25

ti serie con los valores de tiempo en el rango lineal de la fase de saturación

Ki serie con los valores medidos de la cinética total de reacción en el rango lineal de la fase de saturación.

Puesto que según la ecuación (4), C•T(t) tendría que ser igual a A, en rigor en el rango lineal vale:

30

Sin embargo, puesto que se trata de una serie de valores T(ti) de cinética que tienen errores, los cuales no forman una recta ideal, esta exigencia no es satisfecha.

De allí que es ventajoso, en lugar de igualar C•T(ti) con A, minimizar la pendiente A por variación de C con ayuda de un método para el cálculo de compensación de las desviaciones de la pendiente calculada de α2MT, lo cual según la ecuación (4) es igual a C•T(ti). Para ello es particularmente ventajoso el empleo del método de los mínimos cuadrados, el cual también es definido como método de los cuadrados errores mínimos o método de least squares.

Por consiguiente según el método de los mínimos cuadrados se exige que: 5

con

Ti= T (ti) valor de cinética de trombina en el punto de tiempo ti

istart índice del comienzo del rango lineal

iend índice del final del rango lineal. 10

Para satisfacer la exigencia es condición indispensable que la derivada según C sea igual a 0. Por consiguiente se fija C de modo que

Mediante la solución de la ecuación según C se obtiene: 15

Puesto que para la constante C hay una retroalimentación con la ecuación (2), porque el valor de las constantes C depende de la cinética de trombina T, la cual respecto a la ecuación (13) es nuevamente una función de las constantes C, se determina C modo iterativo, en lo cual el resultado de una etapa de iteración es tomado como valor de salida de la respectiva siguiente etapa de iteración: 20

con C0 = 0

e

i número índice para el valor de cinética de trombina T(ti)

j número índice para las iteraciones. 25

Para la terminación de la iteración se define un criterio de finalización. El criterio de finalización es fijado por el experto de manera específica para la prueba, dependiendo de las condiciones de reacción elegidas en una serie de pruebas piloto rutinarias, en lo cual se prueba en cuál punto de tiempo la cinética calculada de trombina no varía ya más de modo significativo. Preferiblemente se define el criterio de finalización de modo que cuando la desviación |Cj - Cj+1| es mayor a un valor máximo ε predeterminado, se fija Cj = Cj+1 y la ecuación 13 es calculada nuevamente con 30 el nuevo Cj, hasta que la desviación |Cj - Cj+1| no supera ya ε.

La presente invención se caracteriza además porque se determinan los valores α2MT (t) de la cinética α2MT. Con ayuda de las constantes de enlace C calculadas puede ahora calcularse para cada uno de los puntos del tiempo los valores α2MT (t) de la cinética α2MT. Para ello se resuelve numéricamente la ecuación diferencial (2) considerando la ecuación (1) y sigue:

5

La ecuación (11) es entonces formulada como diferencia finita [para ello ver también Fritsch, Herbert: Finite-Differenzen-Methode. Editorial IRB Stuttgart, 1998 (ISBN 3816712797) o Marsal, Dietrich: Finite Differenzen und Elemente. Numerische Lösung von Variationsproblemen und partiellen Differentialgleichungen. Editorial Springer Berlin Heidelberg, 1989 (ISBN 3540501924)]:

10

de lo que puede desarrollarse una serie de tiempo para los valores de cinética α2MT:

con α2MT0=0.

Con ayuda de las constantes de formación C calculadas en la ecuación (10), los valores de cinética K medidos y los valores de tiempo t asociados, con ayuda de la ecuación (13) pueden determinarse los valores α2MT (t) de la 15 cinética α2MT, para cada punto de tiempo.

El método acorde con la invención se caracteriza además porque se sustraen los valores de la cinética α2MT de los valores asociados de la cinética total de reacción. Para la determinación del valor de cinética de trombina T (t) en el punto de tiempo i+1 se forma la diferencia entre el valor de cinética total de reacción K (t) medido en el punto de tiempo i+1 y el valor α2MT (t) de la cinética α2MT determinado para el punto de tiempo precedente i: 20

El método acorde con la invención se caracteriza además porque el promedio se forma de los valores que fueron determinados para la cinética de la trombina libre T(t) en el rango lineal de la fase de saturación.

En el rango lineal de la fase de saturación de la cinética total de reacción la cinética de trombina T(t) debería correr casi paralela al eje del tiempo, por consiguiente los valores calculados de trombina ser aproximadamente 25 constantes. El promedio de los valores de la cinética de la trombina libre T(t), los cuales fueron determinados para el rango lineal de la fase de saturación de la cinética total de reacción (istart a iend), puede también ser definido como valor bruto PET (Etpr):

En una forma preferida de operación puede comprobarse la calidad del valor bruto PET determinado con ayuda de 30 métodos estadísticos, preferiblemente mediante la formación de los coeficientes de variación Vk de la cinética de la trombina libre, que fueron consultados para el promedio:

El valor bruto de una muestra PET determinado con ayuda del método acorde con la invención tiene la unidad de la propiedad física medida del sustrato de trombina empleado, como por ejemplo densidad óptica, absorción en [mE] o similares.

En una forma preferida de operar puede fijarse el estatus de coagulación de un paciente o bien de una muestra de 5 un paciente mediante la comparación con el valor bruto PET de una muestra patrón normal. Como muestras patrón normales son adecuadas por ejemplo agrupaciones de muestras de sangre o plasma de conejillos de Indias saludables. Los valores brutos de PET, los cuales están por encima de un valor bruto PET estándar normal, sugieren una disposición trombofílica. Los valores brutos PET que están por debajo de un valor bruto estándar normal sugieren una disposición hemorrágica. Además, la comparación del valor bruto PET de una muestra con el 10 valor bruto PET de muestras de concentración conocida de trombina o bien protrombina hace posible una cuantificación de la trombina formada en la muestra.

Otro objetivo de la presente invención se refiere a rectas que se caracterizan porque está implementado el método acorde con la invención para la determinación del potencial endógeno de trombina, y por requerimiento de un personal operativo pueden evaluarse los datos de medición registrados de modo automático con la ayuda del 15 método acorde con la invención. En ello pueden ser instrumentos como por ejemplo analizadores automáticos de coagulación, los cuales aparte de una unidad para el procesamiento electrónico de datos también pueden disponer de un dispositivo para la manipulación de muestras y reactivos y/o dispositivos para la medición de propiedades físicas de las muestras o pruebas piloto.

Otro objetivo de la presente invención se refiere a medios de almacenamiento en los cuales se guarda el método 20 acorde con la invención en forma de un programa de computador. A ellos pertenecen aparte de discos duros también medios removibles, como por ejemplo disquetes, CDs o DVDs.

El ejemplo de operación descrito en lo que sigue sirve para la ilustración del método acorde con la invención y no debe ser entendido como limitante.

Ejemplo 25

Determinación automática del valor bruto de PET de muestras de plasma

Para la determinación del valor bruto de PET de muestras de plasma humano se empleó un método de prueba cromogénico como está descrito en EP 0 420 332-B1.

135 µl de plasma pobre en plaquetas (PPP) fueron mezclados con 40 µl de tampón (50 mM Tris-HCl, pH 7,4) y con 40 µl de una solución, que contenía un oligopéptido acoplado a para-nitroanilida (pNA), el cual esta escindido 30 específicamente de la trombina (Pefachrome ®TG; Pentapharm LTD, Suiza) y un inhibidor de la polimerización de fibrina (peptidamida H-Gly-Pro-Arg-Pro-Ala-NH2; ver EP 0 456 152-B1). Después de una incubación por 7 minutos se añadieron como activador de formación de trombina 15 µl de CaCl2 (250 mM) y 30 µl de Innovin® (reactivo consistente en factor de tejido humano recombinante y una mezcla de fosfolípidos sintéticos; Dade Behring Marburg GmbH, Alemania) y comenzaron con la medición de la solución a una longitud de onda de 405 nm. La medición de 35 la absorción ocurrió en un intervalo de tiempo de 1 a 2 mediciones por segundos y sobre un período de tiempo de 20 minutos. Los valores medidos fueron registrados en función del tiempo. Sobre la base de la cinética total de reacción así determinada, a continuación se determinó con ayuda del método acorde con la invención el valor bruto de PET de la muestra. Para las condiciones específicas de prueba elegidas se habían predefinido para la determinación del rango lineal de la fase de saturación de la cinética total de reacción, una ventana de tiempo con el punto de inicio 40 tmin= 650 segundos y el punto final tend= 1078 segundos. La mezcla de las muestras con los reactivos, la medición de la absorción y la determinación automática del valor bruto de PET ocurrieron de manera totalmente automática en un analizador de coagulación BCS® (Dade Behring Marburg GmbH, Alemania), en el cual estaba implementado el método acorde con la invención en forma de un software. En esta forma se investigaron una muestra estándar normal (Fig. 1) y dos muestras patológicas de pacientes (Fig. 2 y 3). 45

Figuras

En las figuras 1, 2 y 3 se representan de manera gráfica en cada caso la cinética total de reacción medida K(t) (curva A), es decir los valores de absorción medidos [mE] en función del tiempo [s], y las cinéticas α2MT(t) del complejo α2MT-macroglobulina-trombina determinadas con ayuda del método acorde con la invención (curva C) así como de la trombina libre T(t) (curva B). 50

Figura 1

Representación gráfica de la cinética total de reacción medida (A) de una muestra de plasma normal y de la cinética de α2MT y trombina determinadas según el método acorde con la invención. Para la ilustración se dibujó la duración aproximada de las tres fases de reacción de la curva total de reacción (A), donde I = fase de inducción, II = fase exponencial y III = fase de saturación. Además se dibujó (líneas punteadas) la ventana de tiempo específica de la 5 prueba aquí empleada tmin=650 s a tend= 1078s, dentro de la cual según el rango se buscó la cinética total de reacción K (t) con la mejor linealidad. El rango lineal (líneas interrumpidas) de la cinética total de reacción fue determinado entre los puntos istart= 672 s e iend = tend = 1078 s. Dentro de este rango lineal la curva determinada de la cinética de trombina (B) transcurrió casi paralela al eje X. Mediante promedio de los valores de trombina, los cuales fueron determinados dentro de esta ventana de tiempo del rango lineal, se determinó un valor bruto de PET de 378 10 mE con un coeficiente de variación de la determinación de 2,9 %.

Figura 2

Representación gráfica de la cinética total de reacción medida de una muestra de plasma de un paciente que estaba bajo anticoagulación oral y de la cinética de α2MT y de trombina determinada según el método acorde con la invención. Mediante promedio de los valores de la cinética de trombina libre, la cual había sido determinada para el 15 rango lineal de la cinética total de reacción, se determinó un valor bruto de PET de 136 mE, el cual está reducido de modo significativo frente al valor bruto de PET de la muestra de plasma normal e indica un estatus hemorrágico de coagulación del paciente. El coeficiente de variación de la determinación del valor bruto fue de 2,3 %.

Figura 3

Representación gráfica de la cinética total de reacción medida de una muestra patológica de plasma y de la cinética 20 de α2MT y de trombina determinada según el método acorde con la invención. Mediante promedio de los valores de la cinética de trombina libre, la cual había sido determinada para el rango lineal de la cinética total de reacción, se determinó un valor bruto de PET de 1034 mE, el cual está aumentado de modo significativo frente al valor bruto de PET de la muestra de plasma normal e indica un estatus trombofílico de coagulación del paciente. El coeficiente de variación de la determinación del valor bruto fue de 0,7 %. 25

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para la determinación del potencial endógeno de trombina (PET) de una muestra de sangre o plasma coagulados, donde la cinética de reacción de un sustrato de trombina es medida como función del tiempo, caracterizado porque

   a) se determina el rango lineal de la fase de saturación de la cinética total de reacción dentro de una ventana de tiempo predeterminada específica de la prueba, y después 5

   b) por medio de la pendiente A de la cinética de reacción en el rango lineal de la fase de saturación, la cual corresponde a la pendiente de la cinética α2MT, se determina de manera iterativa la constante de enlace C de trombina a la α2-macroglobulina según la ecuación:

   con C0 = 0 10

   e

   i número índice para el valor de cinética de trombina T en el punto de tiempo ti,

   j número índice para las iteraciones,

   y entonces

   c) se determinan los valores de cinética α2MT y se sustraen de los valores asociados de la cinética total de 15 reacción, y después

   d) mediante promedio de los valores de cinética de la trombina libre, los cuales fueron determinados para el rango lineal de la cinética total de reacción en la fase de saturación, se determina el valor bruto de PET.
2. 2. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque la ventana tiempo específica de la prueba abarca por lo menos 3 puntos de medida dentro de la fase de saturación. 20
3. 3. Método según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque con ayuda de un método de regresión se determina el rango lineal de la fase de saturación de la cinética total de reacción medida.
4. 4. Método según la reivindicación 3 caracterizado porque para cada ventana de tiempo posible, cuyo punto final corresponde al punto final de la ventana de tiempo predeterminada específica de la prueba y cuyo punto de inicio corresponde al punto de inicio de la ventana de tiempo predeterminada específica de la prueba o un punto 25 cualquiera de medida dentro de la ventana de tiempo predeterminada, se forma el cuadrado del coeficiente de correlación r de Pearson.
5. 5. Método según la reivindicación 4 caracterizado porque se determina el máximo del cuadrado del coeficiente de correlación ri y como rango lineal de la cinética total de reacción se elige la ventana de tiempo con el valor máximo.
6. 6. Método según la reivindicación 5 caracterizado porque para el caso en el que el rango lineal determinado esté 30 por debajo de un ancho mínimo definido, se elige como rango lineal una ventana de un ancho mínimo previamente definido.
7. 7. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque la pendiente A de la cinética total de reacción es calculada en el rango lineal de la fase de saturación con ayuda de una regresión lineal.
8. 8. Método según la reivindicación 7 caracterizado porque con ayuda de un método para el cálculo de 35 compensación se minimizan las desviaciones de la pendiente calculada de α2MT frente a la pendiente A de la cinética total de reacción, debidas a variación de las constantes de enlace C de trombina a α2M.
9. 9. Método según la reivindicación 8 caracterizado porque se emplea el método de mínimos cuadrados como método para la compensación de cálculo.
10. 10. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el cálculo de la serie de tiempo de los valores de la 40 cinética α2MT es llevado a cabo mediante aplicación del método de las diferencias finitas.
11. 11. Método según una de las reivindicaciones 1 a 10 caracterizado porque con el coeficiente de variación de los valores de la cinética de la trombina libre en el rango lineal, ocurre un control de calidad del valor bruto de PET.
12. 12. Método según una de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque puede fijarse el estatus de coagulación de un paciente o bien de una muestra de un paciente, mediante la comparación con el valor bruto de PET de una muestra estándar normal.
13. 13. Equipo adecuado para la determinación del potencial endógeno de trombina caracterizado porque allí está implementado un método para la determinación de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12. 5