KR20090085666A - 세포를 포함한 복합 생체물질에서 단백용해 활성도를 측정하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 응고중인 혈액이나 혈장의 샘플(제1 샘플)에서 나타나거나 사라지는 트롬빈 활성과 같은 단백용해 활성과정을 실시간으로 결정하는 방법으로서, 단백용해 활성도에 의한 반응으로 형성된 변환 생성물의 양에 관련된 탐지 신호를 일으키는 신호기질을 상기 샘플에 첨가하고; 샘플의 신호를 시간에 따라 감시하여 곡선을 그리며; 응고물이 밀집되어 나머지 샘플 대부분이 유체로 남고 세포의 침전이 방해되도록 상기 샘플을 자주 혼합하되 뒤의 2 단계를 교대로 반복한다.

Description

세포를 포함한 복합 생체물질에서 단백용해 활성도를 측정하는 방법{Method for measuring the concentration of transient proteolytic activity in composite biological media containing cells}
본 발명은 진단 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 혈액이나 기타 체액에서 변화하는 생물학적 활성효소의 농도를 실시간으로 감시하는 방법과 이 방법에 사용되는 기구에 관한 것이다.
체액에는 생리심리학적으로 중요한 생화학적 체계가 있는데, 이런 체계는 혈액이나 응고체계나 혈소판 체계나 보체계(complement system)나 소화효소나 위장내 효소에 작용한다. 이런 체계의 생리학적 기능을 평가하기 위해, 단백용해 활성도를 실시간으로 추적하는 것은 아주 중요하다. 이런 기능평가는 장애가 있을 때 동맥경화, 심각한 출혈, 감염, 자기면역질환, 소화장애와 같은 심각한 질환을 유발하기 때문에 진단분야에서 아주 중요하다.
혈소판이 풍부하거나 부족한 혈장내의 트롬빈을 판단하는 기존의 방법에서는 혈장을 수분간에 걸쳐 겔 상태로 바꾸는데, 이는 피브리노겐을 불용성 피브린으로 바꾸기 위해서이다. 피브린은 중합되어 피브린 그물을 형성하고, 실제로는 이런 그물이 응고물이다. 이런 응고물은 트롬빈이 생기는 유체(혈장이나 혈청)가 들어있는 스폰지와 같다. 트롬빈이 생성되는 동안, 신호기질은 신호생성 이탈기(leaving group)로 바뀐다. 겔은 비교적 투명하므로, 응고중인 혈정에서 형광신호를 실시간으로 기록할 수 있다. 그러나, 혈액 전체를 측정할 경우, 깨끗한 혈장에서 측정했을 때에 비해 신호량이 5% 미만으로 크게 줄어들고, 특히 적혈구의 어떤 움직임도 신호에 영향을 준다. 피브린 그물(겔)도 적혈구를 걸러내고, 잠시 후에 "응고물 수축"이 일어나 겔을 불균일하게 하면서 겔 내부에 걸린 유체와 겔 외부에 남아있는 유체로 분리가 일어난다. "스폰지 그물"에 대한 응고물 수축 현상은 마치 스폰지를 짜내는 것과 같은 효과를 일으킨다. 이런 현상은 신호에 큰 영향을 미쳐, 측정이 거의 불가능하다.
WO 03/093831은 혈장에서 트롬빈의 활성도를 실시간 측정하는 기술을 소개한다. 여기서는 생체물질에 신호기질을 첨가한다. 단백용해 효소는 이런 기질을 변환시킬 수 있고, 기질의 이탈기를 측정할 수 있다. 결국, 신호의 성질에 따라, 형광물질, 광밀도, NMR 등을 측정한다. 형광물질을 사용하면, 혈소판이 풍부한 혈장이나 피브린이 들어있는 혈장과 같은 농밀한 용액에서의 측정이 가능하다. 또, 혈소판, 백혈구 및 적혈구가 들어있는 혈액의 측정도 가능하다. 그러나, 적혈구는 역시 신호측정에 아주 큰 장애가 된다.
따라서, 신뢰성이 높으면서도 간단한 방법으로 전체 혈액에서 트롬빈 생성을 실시간으로 측정하는 방법이 필요하고, 본 발명은 이런 방법을 제공한다.
WO 03/093831에서 소개한 단백용해 활성도, 특히 트롬빈 활성도의 측정을 빈번한 혼합조건하에 응고중인 혈액이나 혈장에 대해 실시했을 때, 응고물이 겔 상태로 되지 않고 훨씬 농밀하게 응고되어 피브린 그물 밖으로 거의 모든 유체가 남아있다는 놀라운 현상을 보았다.
따라서, 본 발명에 의하면, 응고중인 혈액이나 혈장의 샘플(제1 샘플)에서 나타나거나 사라지는 트롬빈 활성과 같은 단백용해 활성과정을 실시간으로 결정하는 방법에 있어서:
a) 단백용해 활성도에 의한 반응으로 형성된 변환 생성물의 양에 관련된 탐지 신호를 일으키는 신호기질을 상기 샘플에 첨가하는 단계;
b1) 상기 샘플의 신호를 시간에 따라 감시하여 곡선을 그리는 단계; 및
c1) 응고물이 밀집되어 나머지 샘플 대부분이 유체로 남고 세포의 침전이 방해되도록 상기 샘플을 자주 혼합하는 단계;를 포함하고,
상기 b1과 c1 단계를 교대로 반복하는 방법을 제공한다.
이런 방법은,
d) a) 단계의 신호기질에 대해 공지의 안정된 단백용해 활성도를 보이면서 아무런 단백용해 활성도를 일으키지 않는 제2 샘플에는 불활성인 수단을 첨가하는 단계;
e) a)의 신호기질을 d) 단계에 첨가해, 공지의 안정된 단백용해 활성도를 갖는 수단에 의해 반응시 탐지 가능한 신호를 일으키도록 하는 단계;
b2) 상기 제1 샘플과 제2 샘플에서의 신호 과정을 결정하여 각 샘플의 곡선을 구하는 단계;
f) 상기 곡선들을 비교해 제1 샘플에서의 단백용해 활성과정을 유도하는 단계; 및
c2) 제1 샘플에서 응고물이 더 밀집되어 샘플 대부분이 유체상태로 남아있고 세포침전은 방해되도록 제1 및 제2 샘플을 자주 섞는 단계;를 더 포함하고,
b2와 c2 단계를 교대로 반복한다.
본 발명에 있어서, 단백용해 활성도는 트롬빈을 포함한 혈액응고인자 활성도, 섬유소 용해인자 활성도 또는 보체계(complement system) 활성도이다. 또, 신호기질은 이탈기를 갖는 화합물이고, 이탈기는 단백용해효소와 반응하여 탐지가능한 변환생성물을 생성하고, 이 경우의 신호기질로는 Z-Gly-Gly-Arg-AMC이 바람직하고, 변환생성물로는 분광법으로 측정이 가능한 형광물질, 광밀도, NMR이 바람직하다. 또, 이탈기로는 형광기, 발색기(chrophoric group) 또는 수소이온을 방출하는 기가 바람직하다. 또, 변환생성물이 p-니트로아닐리드(nitroanilide) 또는 7-아미노-4-메틸-쿠마린(coumarin)일 수도 있다. 또, 공지의 안정된 단백용해 활성도를 갖는 수단이 알파2-마크로글로불린-트롬빈 복합체, 스타피로코굴라제-프로트롬빈(staphylocoagulase-prothrombin) 복합체 또는 감마 트롬빈이다. 또, 본 발명에 따른 방법에서 신호기질을 첨가하기 전에 제1 기질에 프로테아제(protease) 활성제를 첨가하는 것이 좋은데, 이 경우 프로테아제 활성제로는 칼슘이온, 인지질(phospholipids), 조직인자, 용해성 조직인자, 트롬보플라스틴(thromboplastin), 카올린(kaolin) 또는 엘라그산(elagic acid)을 사용한다. 또, 제1 샘플이 연구중인 단백용해 체계에 대한 제1 샘플의 영향을 시험할 시약을 더 함유할 수도 있는데, 이 경우 단백용해 체계는 지혈혈전체계(haemostatic-thrombotic systme)이고, 시약으로는 항혈소판제(antiplatelet agent)나 항응고제와 같은 항혈전제(antithrombotic agent)를 사용하고, 항혈전제는 헤파린, 데르마탄황산염(dermatan sulphate), 히루딘(hirudin)이나 아가트로반(argatroban)이나 멜라가트란(melagatran)과 같은 직접적 트롬빈 억제제, TAP(tick anticoagulant protein)와 같은 인자 Xa 억제제, 또는 트롬보모듈린(thrombomodulin)이나 활성단백질 C와 같은 단백 C 경로 활성제(protein C pathway activator)이다.
본 발명은 또한,
- 공지의 농도의 α2M-트롬빈 복합체;
- 공지의 농도의 트롬빈;
- 기존의 기술로 측정할 수 있는 신호를 낼 수 있는 이탈기(leaving group)를 갖는 형광물질, 광밀도, NMR와 같은 신호기질을 함유한 용액;
- 응고반응을 일으키기 위한, 트롬보플라스틴, 조직인자, 엘라그산이나 카올린 등이 들어있는 촉발제;
- 특히 지혈상태의 이상상태가 예상될 때 트롬빈 농축과정을 촉진하는 첨가제로서, 예컨대 제5혈액응고인자 돌연변이(Factor V Leiden)나, 항혈전제나 항혈소판제에 특히 유용한 트롬보모듈린(thrombomodulin)이나 활성단백질 C와 같은 첨가제;
- 신호기질이 들어있는 시약;
- 제1항 내지 제15항 중의 어느 하나에서 설명한 방법으로 결정된 트롬빈 활성도 곡선을 계산하기 위해 컴퓨터의 메모리에 설치되는 소프트웨어 프로그램; 및
- 사용 매뉴얼;을 포함하는 기구도 제공한다. 이 기구는 동결건조 시약을 더 포함할 수도 있다.
도 1은 96개 홈이 새겨진 판의 부분 평면도로서, 상부 도면에는 농밀한 응고물이 각각의 홈에 형성되었고, 하부 도면에는 투명한 혈장이 농밀한 겔 상태로 바뀌었다. 트원형으로 20초 간격으로 5초간 흔들면서 이들을 혼합했다.
도 2는 혈액내 트롬빈 측정값을 보여주는 그래프로서, 혼합물에는 0.5 pM 조직인자, 형광물질(400㎛ ZGGR-AMC), 염화칼슘과 혈액이 포함되었다. 형광물질은 96홈 판 형광계로 측정했고, 트롬빈은 신호를 이용해 계산했다.
도 3은 트롬빈 보정제의 초기속도(분단 형광단위)와 적혈구용적율(hematocrit)의 관계를 보여준다. 트롬빈 보정제는 알파2-마크로글로불린(α2-M)을 갖는 트롬빈의 복합체로서, α2-M은 형광물질로 바뀌기는 해도 트롬빈의 혈장 억제제(안티 트롬빈)에 의해 억제되지 않으며, 응고반응에 참여하지 않는다. 이런 트롬빈 보정제는 기질을 바꾸고, 측정된 형광원은 형광신호를 내고, 이를 형광계로 측정한다. 모든 샘플에서 활성도가 같아도, 적혈구 용적율(전체 혈액에 대한 적혈구의 비율) 때문에 초기속도는 다르다. 기증자마다 적혈구 용적율이 다르므로, 트롬빈 보정자의 초기속도를 이용해 이런 차이를 교정할 수 있다.
"빈번한 혼합조건"에 의해, 반응이 일어나는 용기를 움직이거나 용기내의 유체를 움직여 유체나 유체내의 세포와 같은 비유체를 좀더 균일하게 분산시키는 것을 의미한다. 균일한 분산은 분명히 바람직한 상태일 것이다. 예를 들어, 트롬빈 발생이 일어나는 용기를 원을 그리면서 흔들면, 응혈이 겔 상태로 되지 않고 훨씬 더 밀집상태로 되고 그 외부는 모두 유체상태로 될 것이다. 이것은 유체 안에서 자기교반기 등을 회전시켜서도 이루어질 수 있다. 그 결과, 응고물 후퇴가 신호에 더이상 신호에 영향을 미치지 않는다.
트롬빈이 생성되는 용기인 큐벳(cuvette)은 보통 투명하고 온도조절장치 안에 위치하여, 기질의 변화로 생긴 신호를 기록할 수 있다. 용기의 상단이나 바닥에서 형광 측정이 일어나면, 적혈구 침전물이 신호에 추가 흡수효과를 준다. 용기의 측면에서 측정하면 침전의 영향을 줄인다. 한편, 응고중에 침전중인 적혈구가 위로 떠오르도록 반복 혼합하면 침전을 막을 수 있다. 예를 들어, 수초간 흔든 다음 1초내에 형광신호를 반복 측정해도 전체 혈액내의 트롬빈을 충분히 판단할 수 있다. 신호량이 크게 줄어든데 대한 단점은 형광신호의 최적 파장을 선택함과 더불어 형광신호를 받는 광학장치를 적절히 배치하면 일부 극복될 수 있다.
측정할 샘플에서 이 신호의 시간에 따른 전개를 감시하고 샘플을 혼합하는 것을 판단이 끝날 때까지 교대로 반복한다. 전체 측정에 걸리는 시간은 대략 10분 내지 90분이다. 혼합과 판단을 교대로 반복하는 주파수는 분당 3회 내지 8회이다. 판단 시간은 매번 10~80 밀리초 정도이다. 이 방법은 본 명세서를 읽고나서는 당업자에게 아주 명백할 것이다. 다른 참고사항은 본 발명에서 참고한 WO 03/093831을 참고할 것.
혈소판이 풍부하거나 부족하거나 없는 혈장이나 혈액이 응고하는 동안 트롬빈 활성도와 같은 단백용해 활성도를 실시간으로 판단하는데 본 발명의 방법이 특히 적합하기는 해도, 이 방법은 응고반응을 보이는 타액, 혈청, 소변, 뇌척수액, 배설물과 가튼 체액에도 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 이상 설명한 방법을 실행하기 위한 기구도 제공한다. 이런 기구는 적당한 용기나 기타 기존의 포장수단에 아래 성분들을 포함한다:
- 공지의 농도의 α2M-트롬빈 복합체;
- 공지의 농도의 트롬빈;
- 기존의 기술로 측정할 수 있는 신호를 낼 수 있는 이탈기(leaving group)를 갖는 형광물질, 광밀도, NMR 등의 신호기질을 함유한 용액;
- 응고반응을 일으키기 위한, 트롬보플라스틴, 조직인자, 엘라그산이나 카올린 등이 들어있는 촉발제;
- 특히 지혈상태의 이상상태가 예상될 때 트롬빈 농축과정을 촉진하는 첨가제로서, 예컨대 제5혈액응고인자 돌연변이(Factor V Leiden)나, 항혈전제나 항혈소판제에 특히 유용한 트롬보모듈린(thrombomodulin)이나 활성단백질 C와 같은 첨가제;
- 신호기질이 들어있는 시약;
- 이상 설명한 방법으로 결정된 트롬빈 활성도 곡선을 계산하기 위해 컴퓨터 의 메모리에 설치되는 소프트웨어 프로그램;
- 사용 매뉴얼.
이 기구는 동결건조 시약을 포함할 수도 있다.
실험례
a. 내부보정이 없는 실험
일반적으로 실험은 아래와 같이 진행된다. 96개의 홈이 있는 판의 홈에 촉발제(20㎕)를 넣는다. 이 촉발제는 0.5~20 pM 정도의 저농도 조직인자를 함유한다. 50~150 ㎕, 바람직하게는 80㎕의 구연산첨가 혈액을 첨가하고, 형광물질(예; Z-GGR-AMC)와 염화칼슘의 혼합물을 첨가한 뒤 반응을 시작하는데, 형광물질과 염화칼슘의 농도는 각각 200~600 ㎛와 14~17 mM이지만, 400㎛와 16.7mM이 좋다. 수분이 지난 뒤, 트롬빈의 생성이 시작되고, 농도는 최고값이 될 때까지 계속 상승했다가 떨어진다. 일반적인 곡선은 도 2와 같다. (355nm 여기파장과 460nm 방출 파장으로 측정한) 처음 형광 유도체에서는 트롬빈의 양이 적절하게 측정되었지만, 트롬빈의 농도를 제대로 계산하려면 신호를 더 보정할 것을 권한다. 이런 보정에 대해서는 당업자들에게 잘 알려져 있으므로 자세한 설명은 생략한다.
b. 내부보정이 있는 실험
혈액 샘플을 A와 B의 2개로 나누어, 촉발제(희석된 조직인자)가 들어있는 홈 96개의 판의 홈에 샘플 A를 넣고, 보정된 양의 알파2-마크로글로불린-트롬빈 복합체가 들어있는 홈에 샘플 B를 넣는다. 이 복합체는 아미돌릭 활성(amidolytic activity)은 갖지만 혈장억제제로 억제되지는 못한다. 양쪽 홈에 모두 형광물질을 첨가하면, 샘플 A는 트롬빈을 생성하되 샘플 B는 생성하지 않는다(트롬빈 생성이 억제되거나 구연산첨가 샘플이 재차 석회화되지 않음). 보정된 양의 알파2-마크로글로불린-트롬빈에 의한 기질의 변환으로 샘플B에서 생긴 형광물질로부터, 샘플A의 트롬빈 농도를 계산할 수 있다.

Claims (17)

  1. 응고중인 혈액이나 혈장의 샘플(제1 샘플)에서 나타나거나 사라지는 트롬빈 활성도와 같은 단백용해 활성도를 실시간으로 측정하는 방법에 있어서:
    a) 단백용해 활성도에 의한 반응시 형성된 변환 생성물의 양에 관련된 탐지 신호를 생성하는 신호기질을 상기 샘플에 첨가하는 단계;
    b1) 상기 샘플의 신호를 실시간 감시하여 곡선을 그리는 단계; 및
    c1) 응고물을 더 밀집시켜 나머지 샘플 대부분이 유체로 남고 세포의 침전이 방해되도록 상기 샘플을 자주 혼합하는 단계;를 포함하고,
    상기 b1과 c1 단계를 교대로 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    d) a) 단계의 신호기질에는 공지의 안정된 단백용해 활성도를 보이지만, 단백용해 활성도를 일으키지 않는 제2 샘플에는 불활성인 수단을 첨가하는 단계;
    e) a)의 신호기질을 d) 단계에 첨가해, 공지의 안정된 단백용해 활성도를 갖는 수단에 의한 반응시 탐지가능한 신호를 생성하는 단계;
    b2) 상기 제1 샘플과 제2 샘플에서의 신호 과정을 결정하여 각 샘플의 곡선을 구하는 단계;
    f) 상기 곡선들을 비교해 제1 샘플에서의 단백용해 활성과정을 유도하는 단계; 및
    c2) 제1 샘플에서 응고물이 더 밀집되어 샘플 대부분이 유체상태로 남아있고 세포침전은 방해되도록 제1 및 제2 샘플을 자주 섞는 단계;를 더 포함하고,
    b2와 c2 단계를 교대로 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백용해 활성도가 트롬빈을 포함한 혈액응고인자 활성도, 섬유소 용해인자 활성도 또는 보체계(complement system) 활성도인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 신호기질이 이탈기를 갖는 화합물이고, 이탈기는 단백용해효소와 반응하여 탐지가능한 변환생성물을 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 신호기질이 Z-Gly-Gly-Arg-AMC인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 변환생성물이 분광법으로 측정이 가능한 형광물질, 광밀도, NMR인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 이탈기가 형광기, 발색기(chrophoric group) 또는 수소이온 방출기인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 변환생성물이 p-니트로아닐리드(nitroanilide) 또는 7-아미노-4-메틸-쿠마린(coumarin)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 하나에 있어서, 공지의 안정된 단백용해 활성도를 갖는 수단이 알파2-마크로글로불린-트롬빈 복합체, 스타피로코굴라제-프로트롬빈(staphylocoagulase-prothrombin) 복합체 또는 감마 트롬빈인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 하나에 있어서, 신호기질을 첨가하기 전에 제1 기질에 프로테아제(protease) 활성제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 프로테아제 활성제가 칼슘이온, 인지질(phospholipids), 조직인자, 용해성 조직인자, 트롬보플라스틴(thromboplastin), 카올린(kaolin) 또는 엘라그산(elagic acid)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 제1 샘플이 연구중인 단백용해 체계에 대한 제1 샘플의 영향을 시험할 시약을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단백용해 체계가 지혈혈전체계(haemostatic-thrombotic systme)인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 시약이 항혈소판제(antiplatelet agent)나 항응고제와 같은 항혈전제(antithrombotic agent)인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항혈전제가 헤파린, 데르마탄황산염(dermatan sulphate), 히루딘(hirudin)이나 아가트로반(argatroban)이나 멜라가트란(melagatran)과 같은 직접적 트롬빈 억제제, TAP(tick anticoagulant protein)와 같은 인자 Xa 억제제, 또는 트롬보모듈린(thrombomodulin)이나 활성단백질 C와 같은 단백 C 경로 활성제(protein C pathway activator)인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. - 공지의 농도의 α2M-트롬빈 복합체;
    - 공지의 농도의 트롬빈;
    - 기존의 기술로 측정할 수 있는 신호를 낼 수 있는 이탈기(leaving group)를 갖는 형광물질, 광밀도, NMR와 같은 신호기질을 함유한 용액;
    - 응고반응을 일으키기 위한, 트롬보플라스틴, 조직인자, 엘라그산이나 카올린 등이 들어있는 촉발제;
    - 특히 지혈상태의 이상상태가 예상될 때 트롬빈 농축과정을 촉진하는 첨가제로서, 예컨대 제5혈액응고인자 돌연변이(Factor V Leiden)나, 항혈전제나 항혈소판제에 특히 유용한 트롬보모듈린(thrombomodulin)이나 활성단백질 C와 같은 첨가제;
    - 신호기질이 들어있는 시약;
    - 제1항 내지 제15항 중의 어느 하나에서 설명한 방법으로 결정된 트롬빈 활성도 곡선을 계산하기 위해 컴퓨터의 메모리에 설치되는 소프트웨어 프로그램; 및
    - 사용 매뉴얼;을 포함하는 것을 특징으로 하는 기구.
  17. 제16항에 있어서, 동결건조 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 기구.
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