CN102539355B - 用于同时测定多种凝固蛋白酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在单一测试反应中同时测定多种凝固蛋白酶活性或者同时测定多种凝固蛋白酶抑制的生色方法。为了这一目的，使用两种生色底物，所述底物具有不同的最大吸收并且所述底物的颜色信号可以被光谱学分开。

Description

用于同时测定多种凝固蛋白酶的方法

技术领域

本发明属于凝固诊断学领域并涉及用于同时测定多种凝固蛋白酶活性的方法或用于同时测定多种凝固蛋白酶的抑制的方法。

背景技术

已建立的抗凝治疗的主要目标在于抑制促凝的凝固因子凝血酶（因子IIa）和因子Xa。在例如导致凝固因子合成抑制的利用诸如华法灵钠的维生素K拮抗剂的口服抗凝与通过抑制血流中活性凝固因子的抗凝之间作出了区别。在抑制或失活血流中活性凝固因子的抗凝剂的情况下，在具有直接作用的抗凝剂和具有间接作用的那些之间作出了区别。具有直接作用的抗凝剂如例如利伐沙班(rivaroxaban)、达比加群或美拉加群结合凝血酶或因子Xa，并因此具有高度的特异性。具有间接作用的抗凝剂如例如肝素结合内源性凝固因子抑制剂例如抗凝血酶，并数倍强化其抗凝作用。

抑制血流中活性凝固因子的所有抗凝剂都以特异性失活模式为特征。特定的物质类型如例如未分级分离的、高分子量肝素既抑制凝血酶又抑制因子Xa。其他物质具有高度特异性作用，即，或者抑制凝血酶（例如，水蛭素、达比加群、美拉加群），或者抑制因子Xa（例如，戊糖如磺达肝素(fondaparinux )、利伐沙班）。

在血栓栓塞性疾病的治疗过程期间，有时会更换抗凝剂。当治疗腿部深静脉血栓时，经典的情况是从肝素（抑制血流中凝血酶和因子Xa）转换为华法灵钠（抑制肝脏中凝固因子合成）。随着治疗中的这种变化，血流中凝血酶和因子Xa的相对失活可改变。对于治疗的控制和药物的给药，知晓凝血酶和因子Xa的活性或抑制是重要的。因此，能够可靠地测定患者血液中活性凝固因子凝血酶和因子Xa的活性或抑制是必要的。

在凝固诊断学中，在用于检查凝血级联功能性的“总体测试”和用于测定个别凝血因子活性的“个别测试”之间作出了区别。对于总体测试和个别测试均已知不同的测试形式。在测试形式方面，在凝固测试和生色测试之间基本上作出了区别。

在生色测试中，将通常由血浆组成的待测患者样品与凝固激活剂和凝固因子的底物混合。由于大多数凝血因子是丝氨酸内肽酶，即可以切割肽键的水解酶，因此主要使用被待测凝血因子高度特异性切割并且具有可检测信号基团的肽底物。优选地，使用可切割的生色或荧光信号基团，其通过光度法进行测定。专利文献EP 0034122 A1和US 4,508,644描述了许多生色肽底物及其在凝固诊断测试中的应用，例如用于测定蛋白水解凝固因子因子IIa（凝血酶）和Xa。文献EP 0078764 A1描述了用于测定蛋白水解凝固因子XIIa的生色方法。

特别地，生色测试还可以用于测定抑制患者样品中凝血因子活性的抗凝剂。对于这种目的，通常将待测患者样品与活化的凝固因子和所述凝固因子的底物混合。样品中存在的抗凝剂越多，活化凝固因子的抑制越强并且切割的底物越少。

已建立的并且也市售的生色测试特别地使用生色团对-硝基苯胺（pNA）和5-氨基-2-硝基苯甲酸（ANBA），其在405 nm有最大吸收。通常利用光度法测定产生的黄色。当测定抗凝剂时，测试反应中的颜色浓度与样品中抗凝剂浓度成反比。

为了测定凝血酶和因子Xa的抑制，进行两个单独的测试是必要的，其中在每种情况下测定两种凝固因子中的一种的抑制。在单一测试反应中同时测定两种凝固因子的活性或抑制将是期望的。这将具有下列优势：减少材料消耗和时间支出，以及在相同条件下进行两种测定、避免进行测试时的变化如例如移液误差，其可能导致在测定两个结果之间关联中的误差。

发明内容

因此，本发明的目的是提供允许在单一测试反应中同时测定凝血酶和因子Xa的方法。WO 2006/072602 A1描述了用于同时测定凝血酶和纤溶酶的方法，其中使用荧光底物，纤溶酶是纤维蛋白溶解系统的酶。

本发明目的是通过将样品与第一蛋白水解凝固因子特异性的第一生色底物和第二蛋白水解凝固因子特异性的第二生色底物混合实现的，其中第一生色底物具有生色团，该生色团的最大吸收与第二生色底物的生色团的最大吸收相差至少100 nm。产生的生色信号可以在光谱学上分开并可以用光度法在不同波长彼此独立地测定。

因此，本发明提供用于在单一测试反应中同时测定第一蛋白水解凝固因子和第二蛋白水解凝固因子的活性的方法，其中将样品与第一蛋白水解凝固因子特异性的第一生色底物和第二蛋白水解凝固因子特异性的第二生色底物混合，并且其中用光度法测定在测试反应中的吸收变化（颜色信号形成），并且其中第一生色底物具有生色团，该生色团的最大吸收与第二生色底物的生色团的最大吸收相差至少100 nm。

附图说明

图1是显示富集不同浓度利伐沙班和/或阿加曲班的正常血浆样品中因子Xa活性的抑制[%]（参见实施例2）的条形图。在405nm波长处测定具有ANBA生色团的因子Xa特异性肽底物的切割。不考虑阿加曲班浓度（凝血酶抑制剂），在具有升高的利伐沙班浓度（因子Xa抑制剂）的样品中测定到升高的因子Xa抑制。

图2是显示富集不同浓度利伐沙班和/或阿加曲班的正常血浆样品中凝血酶活性的抑制[%]（参见实施例2）的条形图。在575nm波长处测定具有碱性蓝49生色团的凝血酶特异性肽底物的切割。不考虑利伐沙班浓度（Xa因子抑制剂），在具有升高的阿加曲班浓度（凝血酶抑制剂）的样品中测定到升高的凝血酶抑制。

具体实施方案

术语“蛋白水解凝固因子”应当理解为意味着在哺乳动物、优选人凝血系统中具有促凝（凝固促进的）、抗凝（凝固抑制的）或纤维溶解（凝块降解的）功能的任何血浆丝氨酸蛋白酶。促凝的蛋白水解凝固因子是例如因子IIa（凝血酶）、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa、以及因子XIIa。抗凝的蛋白水解凝固因子是例如蛋白Ca（活化的蛋白C）。纤维溶解的蛋白水解凝固因子是例如纤溶酶。

术语“同时测定”应当理解为意味着在单一测试反应中测定两种蛋白水解凝固因子。

在本发明的上下文中，“样品”应当理解为意味着可疑包含待测蛋白水解凝固因子或一种或多种待测抗凝剂的材料。术语“样品”特别地包含人或动物体液、尤其是血液和血浆。

“蛋白水解凝固因子特异性的生色底物”应当理解为意味着被蛋白水解凝固因子以足够特异性转化的底物，其中生色团作为特异性底物转化的结果被释放。可切割底物、特别是对于活化凝固因子具有至少一个切割位点的底物是本领域技术人员充分知晓的。可切割底物可以是通过活化蛋白水解凝固因子的作用分解成两个切割产物的分子，该分子是合成、重组或使用生物技术方法制备的分子或是天然的分子。可切割底物可以完全或部分由肽组成。优选地，它包含至少在切割位点区域中的肽部分。优选地，可切割底物的肽部分由3至大约150个氨基酸残基组成。专利文献EP 0034122 A1和US 4,508,644描述了许多生色肽底物、它们的制备、以及它们在凝固诊断学测试中的应用，例如用于测定凝固因子因子IIa（凝血酶）和Xa。文献EP 78764 A1描述了用于测定凝固因子XIIa的生色方法。

“生色团”应当理解为意味着可以通过特异性蛋白水解凝固因子的作用从底物中切割（解离）的以及在底物切割后具有与未切割状态下不同的吸收性质的信号基团（“标记”）。依照本发明，第一生色底物具有生色团，切割后该生色团的最大吸收与切割后第二生色底物的生色团的最大吸收相差至少100 nm。表1显示已知生色团的选择，它们切割后的最大吸收，以及最大吸收彼此相差至少100 nm的生色团的优选组合。优选的生色团是从底物切割后在可见波长范围380 nm到780 nm具有最大吸收的那些。

通过在测试反应中吸收变化（颜色信号形成）的光度法测定来测定凝固因子的活性，上述变化与凝固因子的活性成比例。术语“吸收变化的光度法测定”应当理解为意味着这样的吸收测定，其中测定透射过测试反应的光束强度的减少（透射测定法）。为了测定颜色信号形成，选取被待测解离生色团吸收的波长区域。

依照本发明，吸收变化的光度法测定包含在至少两个不同波长下测试反应的吸收测定，优选地所述波长处于所用生色团的最大吸收区域。可选地，可以用白光照射测试反应，白光将在通过测试反应后在光谱学上衰弱。测试反应随时间的吸收变化的测定可以通过对应于所用两种生色团最大吸收的波长的光的交替脉冲实现，所述脉冲以短间隔交替。

表1

生色团	最大吸收	可以与之组合
			对-硝基苯胺 (pNA)	405 nm	比色指数碱性蓝49 或124
5-氨基-2-硝基苯甲酸 (ANBA)	405 nm	比色指数碱性蓝49 或124
			比色指数碱性蓝49	625 nm	pNA, ANBA
比色指数碱性蓝124	625 nm	pNA, ANBA

特别优选的生色团是phenoxazime衍生物，例如，举例来说，比色指数碱性蓝（Color Index Basic Blue）49（C.I. 碱性蓝49，CAS登记号11075-19-7）或者比色指数碱性蓝124（C.I. 碱性蓝124，CAS登记号89106-91-2），它们具有大约600nm的最大吸收并且产生蓝色。专利文献EP 0258784 A2公开了特别优选的phenoxazime衍生物以及相应标记的肽底物。

为了检查患者的凝固状态，依照本发明的方法可以用于同时测定患者样品中存在的两种蛋白水解凝固因子的活性。为了这个目的，通常在加入两种生色底物前，将样品与一种或多种引起待测蛋白水解凝固因子直接或间接活化的试剂混合。直接活化应当理解为意味着使用这样的试剂，所述试剂直接活化待测蛋白水解凝固因子，不依赖于其他凝固因子的存在。间接活化应当理解为意味着使用这样的试剂，所述试剂活化凝血级联的一种或多种凝血因子，这进而活化待测蛋白水解凝固因子。试剂类型取决于何种凝固因子将被测定、凝固因子的活性是否将被单独测定、或者凝血级联或一部分凝血级联（外源性或内源性途径）的功能性是否将在凝固因子的基础上被测定。能够直接或间接活化蛋白水解凝固因子的物质以及各种物质的特定混合物是本领域技术人员所熟知的，并且包含例如：磷脂，诸如例如负电荷磷脂；脂蛋白，诸如例如促凝血酶原激酶；蛋白，诸如例如组织因子，活化丝氨酸蛋白酶，诸如例如因子IIa（凝血酶）、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa、或者活化蛋白C；蛇毒，如例如PROTAC^® 酶、ecarin、textarin、noscarin、巴曲酶、血小板素、或者鲁塞尔喹蛇毒（RVV）；接触活化剂，如例如二氧化硅、高岭土、鞣花酸或硅藻土。可包含活化剂的另外物质是例如缓冲物质、盐、去污剂、离子特别是钙离子、以及螯合剂。

在一个实施方案中，可以向测试反应中额外添加纤维蛋白聚合的抑制剂。纤维蛋白聚合抑制剂应当理解为意味着一种物质，特别是合成的寡肽，其抑制通过凝血酶作用形成的纤维蛋白单体的缔合（聚合作用）并且因此阻碍反应混合物中的凝块形成，所述凝块形成可能损害颜色信号的光度法测定（参见，例如，EP 0456152 B1）。

此外，为了检查患者的抗凝潜能，依照本发明的方法可以用于同时测定已经向患者样品中添加的两种蛋白水解凝固因子的活性。为了这个目的，将患者样品与确定量的至少两种促凝蛋白水解凝固因子以及所添加凝固因子特异性的两种生色底物混合，并测定凝固因子的蛋白水解活性的抑制。患者的抗凝潜能越大，即样品中存在的抗凝剂越多，一种或多种活化促凝凝固因子的抑制越大并且切割的底物越少。凝固因子的蛋白水解活性的抑制可以通过与对照测试反应比较而定量，在所述对照测试反应中使用不包含抗凝剂的正常样品例如正常人血浆作为样品。

添加何种活化凝固因子取决于何种抗凝剂将被测定。

对于肝素、即高分子量未分级分离肝素（HMW肝素）或者低分子量肝素（LMW肝素）或者类肝素的测定，添加因子IIa（凝血酶）或因子Xa是特别有用的。对于直接凝血酶抑制剂例如阿加曲班、美拉加群、希美加群、比伐卢定、达比加群或水蛭素的测定，添加因子IIa（凝血酶）是特别有用的。对于直接因子Xa抑制剂例如利伐沙班的测定，添加因子Xa是特别有用的。

本发明进一步涉及用于测定患者样品的抗凝潜能的测试试剂盒。依照本发明的测试试剂盒包括具有确定浓度的第一蛋白水解凝固因子的第一试剂，以及具有确定浓度的第二蛋白水解凝固因子的第二试剂，以及

a）包含第一蛋白水解凝固因子特异性的第一生色底物以及第二蛋白水解凝固因子特异性的第二生色底物的第三试剂；或者

b）包含第一蛋白水解凝固因子特异性的第一生色底物的第三试剂以及包含第二蛋白水解凝固因子特异性的第二生色底物的第四试剂，

其中第一生色底物具有生色团，该生色团的最大吸收与第二生色底物的生色团的最大吸收相差至少100 nm。

在优选的测试试剂盒中，第一蛋白水解凝固因子特异性的第一生色底物具有生色团，所述生色团来自包含对-硝基苯胺和5-氨基-2-硝基苯甲酸的集合；并且第二蛋白水解凝固因子特异性的第二生色底物具有生色团，所述生色团来自包含phenoxazime衍生物的集合，或者反之亦然。

特别优选的测试试剂盒包含具有确定凝血酶浓度的第一试剂和具有确定因子Xa浓度的第二试剂以及至少一种包含凝血酶特异性和/或因子Xa特异性生色底物的其它试剂，其中凝血酶特异性生色底物具有生色团，所述生色团的最大吸收与因子Xa特异性生色底物的生色团的最大吸收相差至少100 nm。两种底物可以存在于单一试剂或分开试剂中。优选地，凝血酶特异性生色底物具有生色团，所述生色团来自包含对-硝基苯胺和5-氨基-2-硝基苯甲酸的集合；并且因子Xa特异性生色底物具有生色团，所述生色团来自包含phenoxazime衍生物的集合，或者反之亦然。

依照本发明的测试试剂盒的试剂可以以液体或冻干形式提供。在测试试剂盒的一些或全部试剂以冻干物形式存在时，测试试剂盒可以额外包含溶解该冻干物所需的溶剂，如例如蒸馏水或合适的缓冲剂。

下述示例性实施方式用于举例说明依照本发明的方法并且不应理解为限制性的。

实施例

实施例1：在单一反应中同时测定血浆中的凝血酶活性和因子Xa活性。

将下述组分混合以形成一个反应：

10 µl 样品

10 µl 正常人血浆库

40 µl 底物试剂（4 mM Z-D-Leu-Gly-Arg-ANBA-甲基酰胺，0.8 mM Tos-Gly-Pro-Arg-碱性蓝49，溶于甘露醇缓冲液，pH 4.0）

100 µl 因子Xa试剂（0.75 U/ml 人因子Xa，溶于4.5 g/l TRIS, 9 g/l NaCl,0.56 g/l EDTA，pH 8.0）

100 µl 凝血酶试剂（5 U/ml牛凝血酶，溶于1.2 g/l TRIS，pH 8.2）

所用样品为正常人血浆。因子Xa从因子Xa特异性肽底物Z-D-Leu-Gly-Arg-ANBA-甲基酰胺切割ANBA，随时间增加405nm波长处的反应中的光密度。同时，凝血酶从凝血酶特异性肽底物Tos-Gly-Pro-Arg-碱性蓝 49切割碱性蓝 49，随时间增加575nm波长处的反应中的光密度。

在全自动Sysmex^® CS-2000i凝固分析仪中同时进行在405nm和575nm处反应光密度的测定以及反应动力学的评估。为了测定光密度，用上述波长的光交替照射反应，并且测定作为波长和时间的函数的反应颜色所引起的光的吸收。

反应动力学的增加与各自酶的活性相关。对于正常血浆样品，因子Xa特异性的405nm处吸光度变化为0.236/分钟，而凝血酶特异性的575nm处吸光度变化为0.111/分钟。

实施例2：在单一反应中同时测定凝血酶和因子Xa抑制剂。

将正常血浆富集以各种浓度利伐沙班（特异性因子Xa抑制剂）和/或阿加曲班（特异性凝血酶抑制剂），并将其用作如实施例1的方法中的样品。

无抑制剂正常血浆的反应动力学的增加被定义为各自酶活性的100%。在这一参照的基础上评估具有各种抑制剂浓度的血浆样品的结果。结果（抑制百分比）总结在表2中。

表2

利伐沙班 (ng/ml)	阿加曲班 (ng/ml)	因子Xa抑制[%]	凝血酶抑制 [%]
				0	0	2	0
0	375	0	18
				0	750	0	31
125	0	42	0
				125	375	40	23
125	750	39	33
				250	0	65	5
250	375	62	22
				250	750	63	35

结果显示，具有不同酶特异性以及具有不同最大吸收生色团的两种生色底物的使用使得可以在单一反应中同时、独立地测定对不同凝固因子有特异性的抑制剂。

Claims (6)

1. 用于在单一测试反应中同时测定第一蛋白水解凝固因子和第二蛋白水解凝固因子活性的方法，其中将样品与确定量的所述第一蛋白水解凝固因子、确定量的所述第二蛋白水解凝固因子、所述第一蛋白水解凝固因子特异性的第一生色底物以及所述第二蛋白水解凝固因子特异性的第二生色底物混合，并且其中用光度法测定所述测试反应中的吸收变化，其特征在于所述第一生色底物具有生色团，所述生色团的最大吸收与所述第二生色底物的生色团的最大吸收相差至少100 nm；其中根据吸收变化的抑制测定所述样品中的抗凝剂浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一蛋白水解凝固因子和所述第二蛋白水解凝固因子选自包含凝血酶、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子XIa、因子XIIa、蛋白Ca以及纤溶酶的集合。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一或第二蛋白水解凝固因子是凝血酶。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一或第二蛋白水解凝固因子是因子Xa。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一或第二生色底物具有对-硝基苯胺或5-氨基-2-硝基苯甲酸作为生色团。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一或第二生色底物具有phenoxazime衍生物作为生色团。