CN111684076A - 纤维蛋白原测试 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于测量样品中纤维蛋白原水平的新颖且直接的方法，所述方法在紧急情况下特别有用。与常用的凝集测定不同，该新颖方法不依赖于凝血酶形成并且不受口服抗凝药物或其他化学品的存在干扰。
Description
本发明涉及一种用于测量样品中纤维蛋白原水平的新颖且直接的方法，所述方法在紧急情况下特别有用。与常用的凝集测定不同，该新颖方法不依赖于凝血酶形成并且不受口服抗凝药物或其他化学品的存在干扰。
纤维蛋白原主要由肝脏合成，其正常范围介于1.5mg/ml血浆至3mg/ml血浆之间。纤维蛋白原是在出血性疾患和血栓形成中发生的血块形成的一部分。在正常情况下，纤维蛋白原形成由凝血酶(因子IIa)的作用激活，从而导致从纤维蛋白原的α多肽链和β多肽链的N末端切割两个短肽，即纤维蛋白肽A和B。纤维蛋白单体的新形成的N末端自发地与纤维蛋白单体的C末端相互作用以形成纤维蛋白聚合物，所述纤维蛋白聚合物在因子XIIIa的影响下交联以形成交联的纤维蛋白聚合物，也称为血块形成。
然而在大量失血的情况下，凝血酶或凝血酶原仍能够充分维持凝血级联-尽管处于低得多的水平-纤维蛋白原是达到临界水平的首个关键凝血因子。血块的质量在很大程度上取决于纤维蛋白原浓度。因此，纤维蛋白原状态是急诊室收治时的关键信息。即时且准确的纤维蛋白原水平测定对于在手术前、围手术和手术后阶段触发医疗策略至关重要，特别是在准备具有高出血风险的手术(例如心脏或肝脏手术)时。在纤维蛋白原水平低于临界浓度的情况下，必须向患者供应纤维蛋白原浓缩物等。
当前，所有可用的测试都依赖于在不同水平触发的凝集级联，这不允许直接确定样品中的纤维蛋白原水平。在将CaCl2添加到样品(例如血液或血浆)中时，测量凝集的形成。它们的准确性受到例如肝素、维生素K拮抗剂或直接或所谓的新型口服抗凝剂(DOAC或NOAC)的药物的极大影响或干扰，这些药物均针对所述凝集级联的不同部分。这些干扰药物可导致错误的结果，所述错误的结果可能导致对患者的高风险。
如今的标准是所谓的“克劳斯测定(Clauss-assay)”(Mackie等人，ThrombHaemost.2002年6月；87(6):997-1005)，其是耗时的并且需要专门的缓冲液和凝血酶试剂以及高度的技术技能。校准不是直接的。该方法基于测试样品中的凝集能力与具有导出的纤维蛋白原浓度的参照样品中的凝集能力之间的比较。凝集期间其他因子(例如XIII因子)的参与在定量中是无法排除的，来自内源或外源(如药物或激素)的血液组分的变化和/或来自不同供应商的仪器和试剂的变化使得该方法容易受到许多参数的干扰。因此，不可能直接测量纤维蛋白原水平。
另一种可用的方法是测定凝血酶原时间(PT)，该方法在终点测量方面与克劳斯测定相似，即血浆纤维蛋白原水平是通过对参与凝集级联的因子进行光学测量或机械强度测量而间接确定的。用这种方法也不能直接测量纤维蛋白原水平。与克劳斯测定相比，PT的结果甚至更加可变。无法排除DOAC/NOAC的干扰。
另一种可能的方法是使用抗原-抗体特异性相互作用的原理的基于免疫的ELISA。ELISA技术基于检测ng/ml范围内的浓度，即需要将样品强稀释数百万倍以达到ELISA兼容范围，这很容易出错、繁琐并且在测量期间引入了不准确性。此外，该测试通常需要4个小时的实验室时间，因此不适用于紧急情况。测试的执行和/或解译需要训练有素的技术人员的许多技能。
因此，开发一种更准确、可靠、直接、独立于平台且快速的方法是持续的任务，所述方法有助于在紧急情况下以及临床实验室，包括床旁检测(point-of-care testing，POCT)、私人住宅或兽医的典型工作环境(例如围场或畜棚)中(每天)测量纤维蛋白原水平，从而实现对纤维蛋白原水平的定量测定，其独立于凝血级联工作，因此不受抗凝血药物或其他干扰化学品的(负面)影响。
出人意料的是，我们现在开发出了这样的测试方法，所述测试方法允许直接且定量地测量样品中的纤维蛋白原水平，所述方法适用于人类和动物两者。与现有技术测试方法(例如，克劳斯测定或PT)相反，该新颖的测试方法不涉及凝血级联的激活，因此独立于凝血酶形成而工作。
该新颖的测试基于酶动力学，其中丝氨酸内肽酶[EC 3.4.21]，特别是蛇毒丝氨酸内肽酶(snake venom serine endopeptidase)，优选地venombin A[EC 3.4.21.74]的活性与给定样品(例如血液或血浆)中的纤维蛋白原水平成反比。该新颖的测试独立于凝血工作，即独立于且无需测量凝血酶活性。与例如US4692496或WO200136666中描述的基于经由CaCl2活化凝血酶并且其中测量凝块形成的方法不同，该新颖的测试方法的原理基于(有意地)抑制凝血级联，例如抑制内源性和外源性途径两者。因此，根据本发明，通过如本文所定义的丝氨酸-内肽酶的酶促反应速度的变化来测量纤维蛋白原水平，所述酶促反应速度的变化与样品中纤维蛋白原浓度的增加成反比。
因此，本发明涉及一种用于测量样品(例如血液或血浆)中的纤维蛋白原的新颖方法，以及一种用于测量样品(例如血液或血浆)中的纤维蛋白原水平的诊断试剂盒，所述方法是在没有CaCl2和/或没有凝血酶活性的情况下执行的。
特别地，本发明涉及一种用于测量样品(例如血液或血浆)中的纤维蛋白原的新颖方法，以及一种用于测量此类样品中的纤维蛋白原水平的诊断试剂盒，所述方法是在不产生校准曲线和/或不存在任何附加的参照材料(例如纤维蛋白原标准品)的情况下直接应用的。
此外，本发明涉及丝氨酸内肽酶[EC 3.4.21]，特别是蛇毒丝氨酸内肽酶，优选地venombin A[EC 3.4.21.74]用于测量样品(例如血液或血浆)中的纤维蛋白原水平的方法中以及用于此类测量的诊断试剂盒中。
此外，本发明涉及一种(检测)底物，例如人造或天然(检测)底物，优选地人造(检测)底物用于测量样品(例如血液或血浆)中纤维蛋白原水平的方法中以及用于此类测量的诊断试剂盒中，所述方法特别地包括通过丝氨酸内肽酶[EC 3.4.21]，，特别是蛇毒丝氨酸内肽酶，优选地venombin A[EC 3.4.21.74]催化切割所述底物。
此外，本发明涉及一种可检测部分(moiety)用于测量样品(例如血液或血浆)中的纤维蛋白原水平的方法中以及用于此类测量的诊断试剂盒中以及用于此类测量的诊断试剂盒中，所述方法特别地包括通过所述丝氨酸内肽酶[EC 3.4.21]，特别是蛇毒丝氨酸内肽酶，优选地venombin A[EC 3.4.21.74]的作用催化切割(检测)底物来释放所述可检测部分。
如本文所用，与纤维蛋白原相关的术语“水平”、“状态”或“浓度”在本文中可互换使用。给定样品(例如血液或血浆)中纤维蛋白原的水平与检测到的丝氨酸内肽酶[EC3.4.21]的活性成反比。
如本文所用的术语“酶活性”是指蛋白水解活性，即如本文所定义的(检测)底物的切割导致从所述(检测)底物释放可检测部分，所述可检测部分可以通过本领域已知并且在本文中定义的方法测量。
在一个实施方式中，如本文所定义的方法/诊断试剂盒包含蛋白酶抑制剂，例如导致凝块形成的纤维蛋白聚合的抑制剂，特别是凝血酶抑制剂，包括但不限于肝素。
在用于测量样品(例如血液或血浆)中纤维蛋白原水平的方法中使用、用于执行本发明以及在用于此类测量的诊断试剂盒中使用的合适的丝氨酸内肽酶[EC 3.4.21]，特别是蛇毒丝氨酸内肽酶，优选地venombin A[EC 3.4.21.74]可以选自蛇毒酶，例如来自矛头蝮属(Bothrops)、蝮蛇属(Agkistrodon)、锯鳞蝰属(Echis)、原矛头蝮属(Protobothrops)、红口蝮属(Calloselasma)、竹叶青属(Trimeresurus)或响尾蛇属(Crotalus)，优选地选自慕杰僧矛头蝮(B.moojeni)、普通矛头蝮(B.atrox)、美洲矛头蝮(B.jararaca)、埃及锯鳞蝰(E.pyramidum)、锯鳞蝰(E.carinatus)、亚红口蝮蛇(A.rhodostoma)、原矛头蝮(P.mucrosquamatus)、红口蝮(C.rhodostoma)或东部菱斑响尾蛇(C.adamanteus)的蛇毒。更优选地，酶是从慕杰僧矛头蝮(Bothrops moojeni)(称为巴曲酶(batroxobin))或普通矛头蝮(Bothrops atrox)的毒液中分离出的，或者是与巴曲酶(例如UniProtKB-P04971)至少约55％，例如至少约60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％同一的酶，包括但不限于已知为calobin、安克洛酶(ancrod)(例如以商品名
销售)、flavoxobin、响尾蛇毒酶(crotalase)的酶，以及具有如本文所定义的丝氨酸内肽酶活性的其他酶。
用于执行本发明(包括用于此类测量的诊断试剂盒)的合适的(检测)底物可以选自任何人造或天然的(检测)底物，特别是人造底物，所述底物可以通过如本文所定义的丝氨酸内肽酶的作用而被催化切割，从而导致从如本文所定义的底物释放可检测部分。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种与可检测部分连接的(检测)底物在用于测量样品(例如血液或血浆)中的纤维蛋白原水平的方法中使用以及在用于此类测量的诊断试剂盒中使用。
检测方法包括但不限于目前在POC设备或实验室测试中使用的机械(不基于血块的)、安培(电化学)、光学、机电、光电化学、生电的或光机械检测。所述检测方法/技术基于对通过所述丝氨酸内肽酶从与可检测部分连接的所述(检测)底物，特别是人造底物进行所述酶促切割而释放的可检测部分的检测/测量。从(检测)底物，特别是人造底物释放可检测部分产生用于合适的方法/技术的可检测/可测量信号的变化。特别地，可检测部分可通过具有(光)电化学、产电(amperogenic)、生色和/或产荧光原理的方法检测/测量。
在一个实施方式中，人造底物包括但不限于表1中根据式(I)至(X)的底物，例如以商品名
Electrozyme TH、H-D-苯丙氨酰基-哌可酸基-精氨酸-对氨基-对甲氧基二苯胺(PPAAM)、甲苯磺酰基-甘氨酰基-脯氨酰基-精氨酸-4-氨基-2-氯酚已知的底物或根据WO2009053834(例如，段落[0047])、WO2000050446(例如，第5页至第6页)或WO2016049506(例如段落[0018]和[0019])的底物，或具有式(I)至(X)但在N末端部分处具有替代的保护基的底物，和/或具有式(I)至(X)并且在保护基与式(I)至(X)中所示的第一个N末端氨基酸之间引入了附加的氨基酸的底物。技术人员知道使用哪些保护基，例如丁氧羰基、甲酰基等。
表1.考虑的(检测)底物的列表。pNA＝对硝基苯胺。But＝L-α-氨基丁酸(2-氨基丁酸)。Pip＝L-哌可酸。AMC＝7-氨基-4-甲基香豆素。有关更多详细信息，请参见文本。
| 化学式 | 式编号 |
| Tos-Gly-Pro-Arg-pNA AcOH | (I) |
| H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·2AcOH | (II) |
| H-D-CHG-But-Arg-pNA·2AcOH | (III) |
| H-D-CHA-Ala-Arg-pNA·2AcOH | (IV) |
| H-D-CHA-Gly-Arg-pNA·2AcOH | (V) |
| CH<sub>3</sub>OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH | (VI) |
| H-β-Ala-Gly-Arg-pNA·2AcOH | (VII) |
| H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl | (VIII) |
| H-D-CHA-Ala-Arg-AMC·2AcOH | (IX) |
| BZ-L-Phe-L-Val-L-Arg-pNA | (X) |
如本文所述的用于测量样品中的纤维蛋白原水平的方法以及用于此类测量的诊断试剂盒包括如本文所定义的酶的蛋白水解活性的检测，所述方法可以在适合于检测此类蛋白水解活性的任何设备上执行，例如Xprecia Stride(Siemens Healthcare)、
(Roche Diagnostics)、
系统(Axonlab/Abbott)、ESR或qLabs系统(Operon Biotech&Healthcare)、Alere
系统(AlereTM)、
microINR(
Microsystems)、
PT(
)，或用于或本领域中已知用于基于实验室的测试或血液分析领域中POCT的其他系统。
如本文所定义的用于测量样品中的纤维蛋白原水平的方法以及用于此类测量的诊断试剂盒包括：测量如本文所定义的丝氨酸内肽酶(例如巴曲酶)对所定义的人造和/或天然底物，特别是人造底物的蛋白水解活性，所述底物连接至如本文所定义的特定可检测部分，即有助于检测蛋白水解活性的任何化学基团或粒子群，例如连接至检测底物的产荧光基团、生色基团、产电基团和/或(光)化学基团。测量蛋白水解活性与时间的关系，即由于蛋白水解活性而产生信号的速度，其中检测到的信号指示可通过本领域已知的不同技术检测的人造和/或天然底物，特别是人造底物的催化切割活性。该速度受纤维蛋白原的存在影响。可以在特定的OD，例如OD405下测量如本文所定义的可检测部分(例如pNA)的蛋白水解释放。释放的pNA越多，OD405越高，酶(例如巴曲酶)的工作越快，反应中存在的纤维蛋白原越少。
如本文所用，测量“OD405”是指对在405nm的光下的光密度(OD)的测量。释放的pNA给予反应颜色，所述颜色可以在最大吸收(为405nm)下测量。
因此，与至少约0.3mg/ml样品至0.6mg/ml样品的纤维蛋白原水平或样品中完全没有纤维蛋白原从而导致最陡峭的曲线相比，样品中的高纤维蛋白原水平，即至少约5mg/ml样品的水平，导致了最不陡峭的曲线(表明要切割的检测底物更少)(参见图1)。信号产生的速率直接取决于样品中纤维蛋白原的浓度，并且是纤维蛋白原的酶促切割与含有可检测部分的(人造和/或天然)底物的酶促切割之间竞争的指示，这两种反应均被如本文所定义的丝氨酸内肽酶的活性催化。
用于执行本发明的合适的样品可以是含有未知浓度的纤维蛋白原的任何液体，特别是血液或血浆，其优选地从哺乳动物分离，例如从人或动物(例如牛、马或普通家养宠物)分离。在血液样品的情况下，血液可以以全(静脉或动脉)血毛细管样品的形式从患者/测试对象新鲜采集，所述样品可以收集在真空采血管(vacutainer)中或来自手指穿刺(即未经处理的血液样品)。样品可以进一步以任何其他形式进行处理，包括使用冷冻样品(即经处理的血液样品)。如本文所述的方法还可适用于未处理或经处理形式(例如，冷冻的、分离的等)的血浆样品。
在一个实施方式中，本发明涉及一种用于测量如本文所定义的样品中的纤维蛋白原水平的方法，所述样品选自新鲜全血；以及一种用于此类测量的诊断试剂盒，其中所述测量优选地是在产电或生色(检测)底物存在的情况下进行的。
在一个实施方式中，本发明涉及一种用于测量如本文所定义的样品中的纤维蛋白原水平的方法，所述样品选自血浆；以及一种用于此类测量的诊断试剂盒，其中所述测量优选地是在生色或产电(检测)底物存在的情况下进行的。
与目前已知的典型实验室测试相比，如本文所定义的用于测量纤维蛋白原水平的方法以及用于此类测量的诊断试剂盒的一些有利特征如下：
(1)与例如常规PT相比使用简便
(2)无需生成校准曲线，即不需要参照材料，例如纤维蛋白原标准品
(3)以低成本快速取得结果
(4)大大提高了患者服务，即纤维蛋白原水平的更快和更准确的测量，从而快得多且更可靠地决定适当的医学或外科干预
(5)样品运输和加工的风险与成本降低
(6)不被抗凝剂，例如肝素、NOAC和/或DOAC干扰
(7)与依赖多步骤级联的测定相比，具有(优选)单一酶促步骤的靶向
(8)关于仅具有INR功能性的设备(例如
)，当考虑每个患者的纤维蛋白原水平时，PT-INR结果可靠得多。
在一个方面中，本发明涉及一种用于测量样品中的纤维蛋白原水平的方法以及一种用于此类测量的诊断试剂盒，所述方法包括以下步骤：
(1)提供样品，例如取自患者或测试对象的血液，例如取自手指穿刺的人或动物血液、来自真空采血管的静脉或动脉血或血浆；
(2)将所述样品引入包含所有必要组分(例如丝氨酸内肽酶、连接至可检测部分的检测底物、可选的抑制剂)的相应的盒(cartridge)或测试条(取决于检测系统或设备)、物理通道，和设备中存在的检测器或检测器的一部分中；
(3)将盒或测试条引入相应的设备；以及
(4)对样品进行分析，包括报告和传送结果，即样品中的纤维蛋白原水平。
根据本发明的方法和/或诊断试剂盒可以在各种已知的测试设备上执行，例如任何已知的基于实验室的凝血分析仪，包括但不限于以上指出的那些。
根据测试系统/设备，该新颖的方法和/或诊断试剂盒可以以湿或干化学的形式使用，即，其中组分(包括底物、酶、抑制剂等)为液体形式，例如在试管/盒中，或者其中组分(底物、酶、抑制剂等)为固体形式，例如在测试条上。使要测量的样品(例如血液或血浆样品)与所述组分接触，并通过选定的设备测量相应的信号。测试设备可连接至远程设备，例如平板电脑或智能手机。
在一个实施方式中，如本文所定义的纤维蛋白原水平的测量以及用于此类测量的诊断试剂盒是使用来自Roche Diagnostics的
系统对经处理或未处理的样品，特别是血液或血浆样品，优选地人血或血浆样品执行的，其中底物包括但不限于选自由以下项组成的组的底物：表1中列出的根据式(I)至(X)的底物、具有式(I)至(X)但在N末端部分具有替代的保护基团的底物，和/或具有式(I)至(X)并且在保护基团与式(I)至(X)中所示的第一个N末端氨基酸之间引入了附加氨基酸的底物，前提条件是pNA被另一种适用于
系统的可检测部分(例如苯二胺，例如作为Electrozyme TH市售)替代。优选地将所述底物与如本文所定义的丝氨酸内肽酶，特别是巴曲酶一起孵育，从而产生由所述设备(例如，
设备)测量/分析的电化学信号(或取决于检测部分的其他信号)。所测量的信号产生速率与测试样品中纤维蛋白原的浓度成反比。
在另一个实施方式中，使用来自Axonlab/Abbott的
在样品中执行如本文所定义的纤维蛋白原水平的测量以及用于此类测量的诊断试剂盒，所述样品包括但不限于经处理或未处理的样品，特别是血液或血浆样品，优选地人血或血浆样品，其中底物为例如H-D-苯丙氨酰基-哌可酸基-精氨酸-对氨基-对甲氧基二苯胺(PPAAM)，或包括但不限于以下的底物：选自由以下项组成的组的底物：表1中列出的根据式(I)至(X)的底物、具有式(I)至(X)但在N末端部分处具有替代的保护基团的底物，和/或具有式(I)至(X)并且在保护基团与式(I)至(X)中所示的第一个N末端氨基酸之间引入了附加氨基酸的底物，前提条件是pNA被另一种适用于
设备的可检测部分(例如对甲氧基二苯胺)取代。所述底物优选与如本文所定义的丝氨酸内肽酶，特别是巴曲酶一起孵育，从而产生由合适的设备(例如
设备)测量/分析的电化学信号。所测量的信号与测试样品中纤维蛋白原的浓度成反比。结果的计算可以是信号与纤维蛋白原浓度之间的线性关系或非线性关系(参见图1)。
为了在本领域中已知的其他设备上执行，如本文所定义的纤维蛋白原水平的测量，包括如本文所定义的用于测量纤维蛋白原水平的诊断试剂盒，可以进一步经调适用于本领域技术人员已知的相应设备。
在本发明的一个方面中，在紧急情况下测量患者或测试对象的纤维蛋白原水平，即，应尽可能快地获得结果。取决于设备检测系统，样品中的纤维蛋白原水平可以在约少于10min内，例如约7分钟、5分钟、4分钟、3分钟或甚至约2分钟内测量。
因此，本发明涉及一种如本文所定义的用于测量样品中的纤维蛋白原水平的方法，其中所述结果(即样品中存在的纤维蛋白原水平)在从如本文所述的(检测)底物的蛋白水解切割开始算起的约少于10min，例如约7分钟、5分钟、4分钟、3分钟或甚至约2分钟内可获得。
根据本发明的直接纤维蛋白原测量可以与其他凝血测试相结合，所述其他凝血测试例如包括但不限于凝集时间、凝血酶或抗凝血酶活性、组织因子测定。
如本文所用，与如本文所述的样品中纤维蛋白原水平的测量有关的术语“分析”包括执行根据设备和(检测)底物的特定算法，所述底物可以是天然或人造底物，特别是人造底物，其中测量丝氨酸内肽酶的反应速度，所述反应速度与样品中纤维蛋白原的浓度直接相关。术语“底物”和“检测底物”在本文中可互换使用。
术语“慕杰僧巴曲酶(Batroxobin moojeni)”或“巴曲酶(batroxobin)”或“蛇毒凝血酶(reptilase)”或“降纤酶(defibrase)”在本文中可互换使用，并且定义从矛头蝮属特别是从慕杰僧矛头蝮的毒液分离的丝氨酸蛋白酶。
如本文所用，术语“蛇毒丝氨酸内肽酶”是指直接从动物分离出的酶，但也指基于天然酶的(序列)信息而以合成方法合成的酶，包括通过发酵或细胞培养产生的酶，所述发酵或细胞培养产生与巴曲酶(UniProtKB-P04971)具有至少55％同一性并且能够如本文所述的切割纤维蛋白原的重组酶。
如本文所用，术语“患者”和“测试对象”在本文中可互换使用，是指测量根据本发明的纤维蛋白原水平的受试者(人或动物)。因此，在常用意义上，它既包括健康受试者，也包括不健康受试者。
如本文所用，术语“高纤维蛋白原水平”是指浓度为约在1升样品(例如(人)血液或血浆)中至少5g纤维蛋白原。如本文所用的术语“低纤维蛋白原水平”是指浓度在1升样品(例如(人)血液或血浆)中约0.3g至0.6g纤维蛋白原的范围内。
如本文所用的术语“酶促速度”是指每单位时间产生的酶促(切割)产物或可检测部分的量，例如米氏(Michaelis-Menten)等式中的“v”。
特别地，本发明给出了以下实施方式：
(1)一种通过一个或多个酶促步骤直接测量样品中纤维蛋白原水平的方法，所述一个或多个酶促步骤包括通过蛇毒丝氨酸内肽酶催化切割检测底物，优选地人造检测底物。
(2)一种直接测量样品中纤维蛋白原水平的方法，所述方法包括通过蛇毒丝氨酸内肽酶的作用催化切割检测底物的步骤，其中所述纤维蛋白原水平与从所述检测底物的催化切割测量的信号成反比。
(3)如上述和如本文所定义的方法，其中纤维蛋白原水平的测量不受样品中存在的抗凝剂的干扰，所述样品优选为人或动物样品，更优选为血液或血浆样品。
(4)如上述和如本文所定义的方法，其中所述检测底物与能够在测量期间在被切割掉后通过(光)电化学、产电、生色和/或产荧光方式检测的可检测部分连接。
(5)如上述和如本文所定义的方法，其中所述蛇毒丝氨酸内肽酶源自矛头蝮属、蝮蛇属、锯鳞蝰属、原矛头蝮属、红口蝮属、竹叶青属或响尾蛇属，优选地选自慕杰僧矛头蝮、普通矛头蝮、美洲矛头蝮(Bothrops jararaca)、埃及锯鳞蝰(Echis pyramidum)、锯鳞蝰(Echis carinatus)、亚红口蝮蛇(Agkistrodon rhodostoma)、原矛头蝮(Protobothropsmucrosquamatus)、红口蝮(Crotalus rhodostoma)和东部菱斑响尾蛇(Crotalusadamanteus)的蛇毒。
(6)用于测量样品中纤维蛋白原水平的诊断测定，所述诊断测定包括蛇毒丝氨酸内肽酶，以及优选地通过使用如上述或如本文所定义的方法，用所述内肽酶催化切割的人造检测底物。
(7)如上述或如本文所定义的方法/测定，所述方法/测定用于集中化血液学或临床实验室、急诊室、甚至在医院外发生的紧急情况、医疗实践(medical practice)、私人住宅、围场、畜棚或床旁检测(POCT)环境。
(8)蛇毒丝氨酸内肽酶在测定样品中纤维蛋白原水平中的用途，其中所述样品中的纤维蛋白原水平与催化人造底物的酶促速度成反比。
(9)用于测量样品中纤维蛋白原水平的设备，所述样品优选来自人或动物，更优选血液或血浆，其中可以通过传感器检测由蛇毒丝氨酸内肽酶的作用催化的对连接至底物的产荧光、生色或产电检测部分的切割，所述检测信号与样品中的纤维蛋白原水平成反比。
以下实施例仅是说明性的，并不意图以任何方式限制本发明的范围。在本申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的内容据此以引用方式并入，特别是WO2009053834、WO2000050446或WO2016049506中公开的底物。
附图说明
图1.示出了根据以秒为单位的时间(x轴)，纤维蛋白原水平与其信号(在此为例如在y轴上指示的405nm下的吸收)之间的关系。平直线表示高纤维蛋白原浓度，点线表示低纤维蛋白原浓度，并且短划线表示样品中的纤维蛋白原为零。有关更多说明，请参见文本。
图2.当使用
系统时，纤维蛋白原水平(在x轴上以g/L为单位给出)与由甲氧基二苯胺产生的电信号(y轴)之间的关系成反比。
图3.当使用
系统时，纤维蛋白原水平(在x轴上以g/L为单位给出)与由苯二胺产生的电信号(y轴)之间的关系成反比。
图4.使用
作为人造底物和巴曲酶作为酶，在0％、20％或40％的市售人血浆中对人血浆纤维蛋白原的酶动力学进行建模。当存在0.67g/L和1.35g/L的纤维蛋白原时，
-巴曲酶的Km分别增加约2倍和大于5倍，同时V最大保持在类似的速度。底物浓度在x轴上给出，酶活性在y轴上给出。有关更多说明，请参见文本。
图5.使用
作为人造底物和巴曲酶作为酶，在0％、30％或60％的市售人血浆中对人血浆纤维蛋白原的酶动力学进行建模。当存在0.8g/L和1.56g/L的纤维蛋白原时，
-巴曲酶的Km分别增加约2.5倍和大于5倍，同时V最大保持在类似的速度。底物浓度在x轴上给出，酶活性在y轴上给出。有关更多说明，请参见文本。
图6.测定限定的样品中的纤维蛋白原水平。图6A示出了在不同血浆Citrol-1(PL)浓度下的pNA释放曲线。将PL重构并稀释至指示的浓度1.6-150％，在室温下在巴曲酶、Pefachrom TH和Pefabloc FG存在下进行的反应中的理论纤维蛋白原(Fg)浓度为0.04-3.75g/L。将用酶标仪(Clariostar，BMG Labtech)在每分钟处记录的OD 405值相对于初始背景OD 405值进行归一化。将归一化的OD 405值的平均值绘制在Y轴上，其中标准偏差的误差条线来自3个样品，而X轴示出了多至10分钟的记录时间。绘制代表不同纤维蛋白原浓度的各条曲线(用不同的形状和阴影表示，有关详情请参见图例)，并在各次记录之间用直线连接。图6B示出了典型的标准曲线，描绘了在不同记录时间处纤维蛋白原浓度与归一化的OD 405之间的关系。X轴是计算出的反应中的纤维蛋白原浓度，而Y轴是从3个平行测定归一化的OD 405。每条曲线代表在不同记录时间(例如4分钟、6分钟、7分钟、10分钟和15分钟)(图例)处的纤维蛋白原浓度与信号的关系。通过GraphPad Prism 7生成不同记录时间处的回归线(实线)和它们的95％置信区(包含在实线之间的点线内)。图6C示出了在不同血浆PL浓度和2种其他市售对照血浆(对照血浆P和低异常对照测定血浆(低PL))下的pNA释放曲线。根据说明书将所有血浆重构为100％血浆。将PL连续稀释，以创建跨越反应中0.08-1.25g/L的纤维蛋白原浓度的标准曲线，为清楚起见，仅绘制了3.1％和50％的稀释度。在同一实验运行中包括其他两种血浆对照血浆P(Siemens)和低异常对照测定血浆(IL)，在室温下在巴曲酶、Pefachrom TH和Pefabloc FG存在下进行反应。将每分钟记录的OD405值相对于初始背景OD 405值进行归一化。将归一化的OD 405值的平均值绘制在Y轴上，其中标准偏差的误差条线来自3个样品，而X轴示出了多至10分钟的记录时间。绘制代表不同纤维蛋白原浓度的各条曲线(用不同的形状和阴影表示，有关详情请参见图例)，并在各次记录之间用直线连接。图6D示出了标准曲线，其描绘了在第10分钟的记录时间处纤维蛋白原浓度与归一化的OD 405之间的关系。X轴是使用PL的反应中计算出的纤维蛋白原浓度，而Y轴是从3个平行测定归一化的OD 405。实线回归线是通过GraphPad Prism 7生成的。为了评估对照血浆P和低PL的纤维蛋白原浓度，对这2种血浆的归一化的OD 405值进行内推(带箭头的点线)，因此给出当反应中的血浆为50％浓度时OD信号至纤维蛋白原浓度的转换。图6E示出了在不同时间点处的对照血浆P(Siemens)和低异常对照测定血浆(HemosIL)的评估的纤维蛋白原浓度。Y轴表示这两种血浆对照血浆P(实心圆)和低异常对照测定血浆(空心圆)在未稀释时的纤维蛋白原浓度，其中误差条线代表标准偏差。X轴是图6c和图6d中解释的反应的多至10分钟的记录时间。点线内的阴影区域表示这两种血浆的95％置信区间，对照血浆P用点阴影化并且低异常对照测定血浆用影线阴影化。有关更多说明，请参见文本。
图7.测试了PT和aPTT中抗凝药物的干扰。图7A示出了在存在不同浓度的来自Roche的cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物的情况下，巴曲酶-Pefachrome TH反应的米氏酶动力学曲线图。X轴代表增加的Pefachrome TH浓度，而Y轴代表巴曲酶在室温下的酶活性。曲线代表在不存在(对照)和存在0.03倍至2倍推荐使用浓度的来自Roche的cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物的情况下的酶活性的关系。蛋白酶抑制剂混合物的增加的使用抑制了巴曲酶的酶活性。抑制是多种抑制类型的混合，其中V最大减小，并且Km增大。图7B和图7C示出了在如图7a所示的不同浓度的来自Roche的cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物的存在下，巴曲酶-Pefachrome TH底物的米氏常数(Km)(图7B)和V最大(图7C)。参数是通过GraphPad Prism7评估的。当在巴曲酶-Pefachrome TH底物反应中抑制剂混合物的浓度增加时，Km增大，而对于V最大则情况相反。误差条线表示在Km或V最大的平均值附近的95％置信区间，同时由于极大置信区间，从在较高抑制剂浓度下执行的反应获得的那些值的误差条线被省略。巴曲酶-Pefachrome TH底物反应受通用蛋白酶抑制剂的混合物影响，但不受血液凝结中典型的治疗性和非治疗性抑制剂的影响。有关更多说明，请参见文本。
图8.使用本发明的巴曲酶-Pefachrome TH酶促反应进行的用不同DOAC的干扰研究。图8A示出了在不同浓度的达比加群(Dabigatran)存在下巴曲酶-Pefachrom TH反应的米氏酶动力学曲线图。X轴代表增加的Pefachrome TH浓度，而Y轴代表巴曲酶在室温下的酶活性。曲线表示在0ng/mL(作为阴性对照)和31-500ng/mL的达比加群存在下酶活性的关系。达比加群的增加使用并未显著抑制巴曲酶的酶活性。图8B示出了在不同浓度的0.13-2.0μg/mL的阿加曲班(Argatroban)存在下巴曲酶-Pefachrom TH反应的米氏酶动力学曲线图。如图8A那样执行测试。图8C示出了在不同浓度的38-600ng/mL的利伐沙班(Rivaroxaban)存在下巴曲酶-Pefachrom TH反应的米氏酶动力学曲线图。如图8A那样执行测试。图8C示出了在不同浓度的达比加群、阿加曲班和利伐沙班存在下巴曲酶-Pefachrom TH反应的米氏酶动力学曲线图。X轴代表增加的Pefachrome TH浓度，而Y轴代表巴曲酶在室温下的酶活性。有关每种药物处理的更多详细曲线图，请参阅单独的曲线图(8a：达比加群，8b：阿加曲班，8c：利伐沙班)。药物的增加使用并未显著抑制巴曲酶的酶活性。图8D示出了米氏常数(Km)，图8E示出了在如图8a至图8d所示不同浓度的达比加群、阿加曲班或利伐沙班存在下巴曲酶-Pefachrome TH底物的V最大。Km未受所有抑制剂的所有浓度的显著影响。由于巴曲酶-Pefachrome TH底物的Km更受纤维蛋白原存在的影响，因此这种纤维蛋白原测试原理应很好地抵抗DTI和DXaI的存在。极高剂量药物的存在可能略微降低V最大，但对纤维蛋白原测定的影响可视为可忽略不计的。误差条线表示在Km或V最大的平均值附近的95％置信区间。有关更多说明，请参见文本。
图9.示出了使用化学品的干扰。图9A示出了在已知抑制凝结和纤溶途径的化学品存在下巴曲酶-Pefachrom TH反应的米氏酶动力学曲线图。X轴代表增加的Pefachrome TH浓度，而Y轴代表巴曲酶在室温下的酶活性。曲线表示在6U/mL的法安明(Fragmin)(可从Pfizer购得的低分子量肝素)以及10TIU/mL的抑肽酶(aprotinin)和0.1M的6-氨基己酸的组合存在下酶活性的关系。与未处理的反应(对照)相比，这些试剂没有显著影响活性。图9B示出了米氏常数(Km)，图9C示出了在已知抑制凝结和纤溶途径的化学品存在下巴曲酶-Pefachrome TH底物的V最大。Km未受所有抑制剂的所有浓度的显著影响。由于巴曲酶-Pefachrome TH底物的Km更受纤维蛋白原存在的影响，因此这种纤维蛋白原测试原理应很好地抵抗这些抑制剂的存在。误差条线表示在Km或V最大的平均值附近的95％置信区间。有关更多说明，请参见文本。
图10.在2种不同PL浓度下的pNA释放曲线，用于表明巴曲酶-Pefachrome TH反应的可调试性。在37℃的反应运行中，在适当量的巴曲酶和Pefachrome TH中将PL稀释至4％和24％，以创建纤维蛋白原浓度分别为约0.1g/L和0.7g/L的反应(关于细节请参见图例)。将每分钟记录的OD 405值(X轴)相对于初始背景OD 405值进行归一化，因此OD 405被归一化为Y轴。将归一化的OD 405值的平均值绘制在Y轴上，其中标准偏差的误差条线来自3个样品，而X轴示出了多至10分钟的记录时间。由连接归一化的OD 405值的平均值的直线表示的每条曲线描绘了在不同条件下的反应速度(有关细节，请参见图例)。
实施例
实施例1：在具有PT-INR和ACT功能的PoC设备上进行全血纤维蛋白原水平测量
本文描述了使用
床旁系统(Axonlab/Abbott)对样品中的纤维蛋白原水平进行测量，这应能够使得所述设备的用户在很短的时间内确定来自测试对象(患者)的纤维蛋白原水平。
该测试应与由
提供的现有凝血酶原时间(PT)非常相似地工作，区别在于给出了由组织因子触发的INR信息。新的纤维蛋白原利用蛇毒蛋白巴曲酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。在存在凝血酶样丝氨酸蛋白酶的人造检测底物(包括PPAAM或
)以及巴曲酶的情况下，所述人造底物与纤维蛋白原进行竞争。在测试中使用固定量的巴曲酶和PPAAM，能够确定纤维蛋白原浓度与由所述量的检测底物PPAAM产生的电化学信号之间的关系。纤维蛋白原与PPAAM竞争巴曲酶，从而导致纤维蛋白原水平与电化学信号之间成反比关系(图2)。
实施例2：用来自Roche Diagnostics的
进行纤维蛋白原测定
本文描述了使用来自Roche Diagnostics GmbH的
XS床旁设备对样品中的纤维蛋白原水平进行测量，这应能够使得该设备的用户在很短的时间内确定来自测试对象(患者)的全血样品中的纤维蛋白原水平。
该测试应与通过
XS提供的现有凝血酶原时间(PT)测试非常相似地工作。新的纤维蛋白原测试利用蛇毒蛋白巴曲酶将样品纤维蛋白原转化为纤维蛋白。在存在包括Electrozyme TH或
的人造检测底物(即凝血酶样丝氨酸蛋白酶的底物)以及巴曲酶的情况下，所述人造底物与纤维蛋白原竞争。在测试中使用固定量的巴曲酶和检测底物的情况下，能够确定纤维蛋白原浓度与由所述量的活性检测底物产生的电化学信号之间的关系。由于纤维蛋白原与检测底物竞争巴曲酶，因此纤维蛋白原水平与电化学信号之间彼此成反比的关系(图3)。
实施例3：用标准分光光度计进行纤维蛋白原测定
使用含有可检测部分对硝基苯胺(pNA)的
和巴曲酶以及多种人血浆浓度，使用
(BMG Labtech)测量纤维蛋白原水平。同样，测量作为天然底物的纤维蛋白原与人造底物
之间对被巴曲酶(E)切割的竞争。
使用30％和60％的不同稀释度的市售人血浆作为纤维蛋白原的来源。制备具有分别为0.8g/L和1.56g/L的不同纤维蛋白原水平的样品。基于每分钟释放的pNA的量来计算酶活性。pNA的量与405nm处的吸收成正比。在(E)存在下，测试不同浓度的
和纤维蛋白原的pNA释放速度，结果和分析汇总在图4和表2中。
基于米氏酶动力学建模，纤维蛋白原的存在改变了酶-底物反应的米氏常数(Km)，同时反应的最大酶促反应速度(V最大)没有显著改变。增大的Km和相似的V最大一致地证明了纤维蛋白原与
之间的非抑制性竞争。
根据米氏方程，其中在这种情况下几乎恒定的Kcat表示每秒每个活性部位的最大底物分子数量，并且(S)和(E)两者的浓度也在反应中相同，Km的增加显著影响酶促反应速度(v)。由于纤维蛋白原的存在，酶促反应速度的改变可以容易地进行测量，并提供对纤维蛋白原浓度的估算。使用
作为人造底物(S)，我们监测了在不同水平的人血浆来源的纤维蛋白原存在下，通过作为酶(E)的巴曲酶而导致的pNA生成的v，如表2所示。v的变化是由于纤维蛋白原的存在，并且v的下降与纤维蛋白原浓度的增加成正比，这是由于基于米氏酶动力学的Km增大。
表2.在存在不同浓度的人血浆来源的纤维蛋白原的情况下，通过用巴曲酶进行切割而导致的
的酶促反应。在405nm下测量7min或10min后的酶促反应时间。数据基于2次独立的测量。有关更多详细信息，请参见文本。
在此继续使用
作为人造底物(S)，我们监测了在不同水平的人血浆来源的纤维蛋白原存在下，通过巴曲酶而导致的pNA生成的v(表2)。v的变化是由于纤维蛋白原的存在，并且v的下降与纤维蛋白原浓度的增加成反比，这是由于基于米氏酶动力学的Km增大。
实施例4：用标准分光光度计进行纤维蛋白原测定
使用含有可检测部分对硝基苯胺(pNA)的
和巴曲酶以多种人血浆浓度，使用
(BMG Labtech)测量纤维蛋白原水平。同样，测量作为天然底物的纤维蛋白原与人造底物
之间对被巴曲酶(E)切割的竞争。
使用30％和60％的不同稀释度的市售人血浆作为纤维蛋白原的来源。制备具有分别为0.8g/L和1.56g/L的不同纤维蛋白原水平的样品。基于每分钟释放的pNA的量来计算酶活性。pNA的量与405nm处的吸收成正比。在(E)存在下，测试不同浓度的
和纤维蛋白原的pNA释放速度，结果和分析汇总在图5和表3中。
基于米氏酶动力学建模，纤维蛋白原的存在改变了酶-底物反应的米氏常数(Km)，同时反应的最大酶促反应速度(V最大)没有显著改变。增大的Km和相似的V最大一致地证明了纤维蛋白原与
之间的非抑制性竞争。
根据米氏方程，其中在这种情况下几乎恒定的Kcat表示每秒每个活性部位的最大底物分子数量，并且(S)和(E)两者的浓度也在反应中相同，Km的增加显著影响酶促反应速度(v)：
由于纤维蛋白原的存在，酶促反应速度的改变可以容易地进行测量，并提供对纤维蛋白原浓度的估算。使用
作为人造底物(S)，我们监测了在不同水平的人血浆来源的纤维蛋白原存在下，通过作为酶(E)的巴曲酶而导致的pNA生成的v，如表3所示。v的变化是由于纤维蛋白原的存在，并且v的下降与纤维蛋白原浓度的增加成反比，这是由于基于米氏酶动力学的Km增大。
表3.在存在不同浓度的人血浆来源的纤维蛋白原的情况下，通过用巴曲酶进行切割而导致的
的酶促反应。在405nm下测量7min、11min或16.5min后的酶促反应时间。数据基于2次独立的测量。有关更多详细信息，请参见文本。
在此继续使用
作为人造底物(S)，我们监测了在不同水平的人血浆来源的纤维蛋白原存在下，通过巴曲酶而导致的pNA生成的v(表3)。v的变化是由于纤维蛋白原的存在，并且v的下降与纤维蛋白原浓度的增加成正比，这是由于基于米氏酶动力学的Km增大。
实施例5：通过巴曲酶的动力学测定血浆纤维蛋白原浓度
使用商购可得的良好表征的血浆执行纤维蛋白原水平的测量，以检验这种创新的纤维蛋白原测量原理在血液样品中的可行性。
当前公认的纤维蛋白原测定是基于凝块的克劳斯测试。将可购自Siemens andInstrumentation Laboratory的对照血浆(IL)在标准克劳斯测试中用作纤维蛋白原测量中的对照，并且对纤维蛋白原浓度进行了良好的表征(表4)。为了测试这种生色纤维蛋白原测定在血浆纤维蛋白原测定中的可行性，简要地，从连续稀释的Citrol-1(购自Siemens的对照血浆)获得校准曲线(图6a、图6b)。通过从使用Citrol-1创建的校准曲线内推(intrapolating)，对其他2种具有不同纤维蛋白原水平的血浆(表4)对照血浆P(Siemens)和低异常对照测定血浆(IL)进行测定，以评估它们的纤维蛋白原浓度(关于细节，请参见图6c、图6d和图6e)。
表4.血浆样品及其纤维蛋白原浓度。提取如产品插页中所述的对照血浆P(购自Siemens)、低异常对照测定血浆(购自IL)和对照血浆Citrol-1(购自Siemens)，并汇总在该表中。每种纤维蛋白原浓度均以通过不同的仪器/分析仪和试剂确定的平均值和置信区间(括号内)显示。有关更多详细信息，请参见文本。
根据图6中描述的当前条件，该测定能够在0.05g/L与0.3g/L的纤维蛋白原水平之间具有良好的区分或分离(图6a和图6b)。在这种临床表征的对照血浆中清楚地证明了纤维蛋白原浓度与为405nm下的OD的可测量信号之间的反比关系(图6a和图6b)。产生校准曲线，并评估2种血浆的纤维蛋白原浓度(图6c和图6d)。这2种血浆的评估与血浆供应商给出的值非常吻合(图6e/表4)。因此，基于巴曲酶动力学，使用本发明的方法正确地评估了具有异常低的纤维蛋白原水平的临床相关血浆样品。
实施例6：在基于巴曲酶动力学的纤维蛋白原测量中直接凝血酶(DTI)和直接FXa抑制剂(DXaI)的干扰研究
在本实施例中，已经测试了本发明方法抵抗来自直接凝血酶或Fxa抑制剂的干扰的有利特性。
在紧急情况下，当患者需要纤维蛋白原水平评估时，纤维蛋白原测试需要有尽可能少的干扰因素。包括DTI和DXaI在内的直接口服抗凝剂(DOAC)的使用越来越普遍地用于预防许多疾病中的血栓形成。在本实施例中，我们以我们的新方法测试了3种蛋白酶抑制剂达比加群(DTI)、阿加曲班(DTI)和利伐沙班(aDXaI)，以评定这种类型的这些代表性药物在我们的纤维蛋白原测量方法中的干扰。为了评估这些药剂的抑制效应，我们观察了这些药剂对巴曲酶与其底物Pefachrome TH之间的酶动力学的影响。在获自Roche的蛋白酶抑制剂混合物cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物的存在下测试了巴曲酶-Pefachrome TH酶促反应(参见图7a)。基于米氏酶动力学模型评估酶动力学参数(如V最大和Km)，并且所述混合物对酶促反应的抑制效应是清晰可见的(图7a)，并且米氏参数V最大和Km指示抑制混合物(图7b和图7c)。
随着酶动力学研究的建立，通过在两种常见的血液凝固测试，即凝血酶原时间(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)中测试这些药物的效力来开始DTI和DXaI的干扰。在存在这些DTI和DXaI的情况下，这两个测试将显示出凝集时间延迟。基于该原理，我们通过应用PT和aPTT中报告的峰值和谷血浆浓度评定了这些药物的效力。结果显示在表5中：分别表示为DTI和DXaI的直接凝血酶和FXa抑制剂能够延迟基于凝血酶原时间(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的血液凝集时间。所报道的达比加群的最大浓度和谷浓度介于447-10ng/mL之间，而利伐沙班介于535-6ng/mL之间。单独地向对照血浆中掺加不同量和类型的抑制剂，并通过BCS-XP(Siemens)记录PT和aPTT的凝集时间。
表5.在临床浓度范围内的DTI和DXaI的抑制效应的汇总，还测试了其对巴曲酶介导的纤维蛋白原测定的影响。它们由抑制剂的名称以及血浆中的最终浓度表示。阴性对照(表示为Neg.对照)是没有任何抑制剂掺加的对照血浆。另一个阴性对照(表示为ISTH)是由国际血栓形成和止血协会(International Society on Thrombosis and Hemostasis，ISTH)推荐的对照血浆，其也没有任何抑制剂的掺加。
检测根据作用方式和浓度的从强到弱的效力谱，并且结果与文献一致。
已经证明了所述药物抑制凝血酶和FXa的效力，在巴曲酶-Pefachrome TH酶促反应中研究了达比加群、阿加曲班和利伐沙班的干扰效应。在酶动力学研究中，我们将0-500ng/mL的达比加群加入到巴曲酶-Pefachrome TH反应中(参见图8a)。对介于0-2μg/mL范围内的药物阿加曲班进行类似的研究(参见图8b)。另外，将0-600ng/mL的利伐沙班应用于该酶动力学研究中(参见图8c)。在这项研究中，我们没有观察到DTI和DXaI具有像购自Roche的蛋白酶抑制剂混合物那样的强抑制效应(比较图8a至图8c)。在每种药物的最高剂量下V最大可能会略有降低，但在不同药物和浓度下Km保持非常恒定(图8e和图8f)。由于Km是根据纤维蛋白原的存在而偏移的主要参数，即纤维蛋白原浓度越高，则Km增加越大(关于细节，请参见实施例3和实施例4)，因此我们可以可靠地否定测定将受到典型的DTI和DXaI或常见的DOAC的干扰。
实施例7：已知影响基于凝集的测定的化学物质的干扰研究
在该实施例中，针对已知影响基于凝集的测定的化学干扰测试本发明方法的有利特性。
类似于先前实施例中执行的测试，评估巴曲酶与其底物Pefachrome TH之间的酶动力学。已被证明干扰基于凝集的测定的潜在干扰物质是肝素(包括未分级肝素和低分子量肝素，即UFH和LMWH)、水蛭素、EDTA和纤维蛋白原降解产物(FDP)。肝素和水蛭素是治疗血栓形成的治疗物质。血浆中FDP含量增加是由于增加纤溶和纤维蛋白原裂解的条件。正常的FDP水平为约5-8μg/mL。已知更高的FDP浓度抑制血块形成。在出血治疗中抑制纤溶的药物(如抑肽酶和6-氨基己酸)也包括在本研究中。另外，对血浆扩容剂溶液中使用的胶体羟乙基淀粉(HES)进行了干扰活性研究。
首先，测试了非常高浓度的低分子量肝素(法安明)、抑肽酶和6-氨基己酸对巴曲酶-Pefachrome TH酶反应的干扰(参见图9a)。所预测的V最大和Km与未处理的对照没有显著差异(图9b和图9c)。因此，非常可靠的结论是，本发明的纤维蛋白原测量方法不会受到这些物质的干扰。
我们使用相同的方法进一步评定了未分级肝素(利克凝(Liquemin)：至4U/mL)、钙螯合剂EDTA(至8mM)、水蛭素(至4U/mL)、HES(至5mg/mL)、FDP(至57μg/mL)的干扰。我们没有看到来自所有这些物质的显著干扰，从而再次表明本发明方法对于这些物质的独立性或不受干扰性(数据未显示)。
实施例8：可调试的酶促条件
由于典型的PoC设备(即iSTAT和CoaguCheck)在测试期间将其血液样品加热至体温，因此我们在体温下操作时研究了该原理。我们调整了几个参数，以便能够增加信号输出并在低纤维蛋白原浓度下实现良好的区分。
成功地执行了基于巴曲酶动力学的本发明纤维蛋白原检测方法对体温的调试。调节了参数(如酶和底物的浓度)，以在血浆中低纤维蛋白原浓度下产生期望的表现(参见图10)。
Claims (14)
1.一种用于测量样品中的纤维蛋白原水平的方法，其中凝血级联被抑制，优选地抑制内源性和外源性途径两者。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括酶促切割反应，其中纤维蛋白原的酶促切割与样品中存在的检测底物的酶促切割进行竞争。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法包括使用丝氨酸内肽酶进行纤维蛋白原的酶促切割。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中酶促切割的速度取决于所述样品中的纤维蛋白原水平。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，所述方法包括测量丝氨酸内肽酶的蛋白水解活性，所述蛋白水解活性与所述样品中的纤维蛋白原水平成反比。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，所述方法是在不存在CaCl2和/或在不存在凝血酶活性的情况下执行的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，所述方法包括存在蛋白酶抑制剂，优选地纤维蛋白聚合抑制剂，更优选地凝血酶抑制剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法不包括生成校准曲线和/或生成/存在纤维蛋白原标准品。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述样品选自血液或血浆。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法用于集中化血液学或临床实验室、急诊室、甚至在医院外发生的紧急情况、医疗实践、私人住宅、围场、畜棚或床旁检测(POCT)环境。
11.一种用于执行根据权利要求1至10中任一项所述的方法的诊断试剂盒。
12.一种丝氨酸内肽酶[EC 3.4.21]，优选地为蛇毒丝氨酸内肽酶，更优选地为venombin A[EC 3.4.21.74]，其用于根据权利要求1至10中任一项所述的方法中或用于根据权利要求11所述的诊断试剂盒中。
13.一种检测底物，优选地为人造检测底物，特别是与根据权利要求12所述的丝氨酸内肽酶相组合，其用于根据权利要求1至10中任一项所述的方法中或根据权利要求11所述的诊断试剂盒中。
14.一种可检测部分，优选地与根据权利要求12所述的丝氨酸内肽酶和/或根据权利要求13所述的检测底物相组合，其用于根据权利要求1至10中任一项所述的方法中或根据权利要求11所述的诊断试剂盒中。
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Families Citing this family (3)
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4692406A (en) * | 1983-08-25 | 1987-09-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and a reagent for the simultaneous determination of fibrinogen and fibrinogen fission products in plasma |
| WO1989009409A1 (en) * | 1988-03-31 | 1989-10-05 | Ram Nunna | Immunoassays employing novel markers |
| KR20010111891A (ko) * | 2000-06-14 | 2001-12-20 | 정광회 | 뱀의 독소로부터 분리된 신규한 트롬빈 유사효소 및 그의제조방법 |
| CN101680905A (zh) * | 2008-05-22 | 2010-03-24 | 伊西康公司 | 蛋白质分析 |
| CN105102696A (zh) * | 2013-02-08 | 2015-11-25 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 用于目标分子检测的基于亲和力的划分试验 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4692496A (en) | 1984-01-04 | 1987-09-08 | Mobil Oil Corporation | Films of LLDPE, PP and EPR having improved stiffness, tear and impact strength |
| DE19904674A1 (de) * | 1999-02-04 | 2000-08-31 | Haemosys Gmbh | Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Thrombininhibitoren |
| WO2000050446A1 (de) | 1999-02-23 | 2000-08-31 | Pentapharm Ag | Oligopeptidderivate zur elektrochemischen messung der aktivität von proteasen |
| ATE360090T1 (de) | 1999-11-15 | 2007-05-15 | I Stat Corp | Vorrichtung und verfahren zum bestimmen der koagulation in flüssigproben |
| EP1513548A2 (en) * | 2002-06-03 | 2005-03-16 | UAB Research Foundation | Method for reducing obstructive hydrocephalus |
| TWI516601B (zh) | 2007-10-26 | 2016-01-11 | 環球生物醫療感測器私人有限公司 | 電化學檢測之裝置及方法 |
| AU2010230165B2 (en) * | 2009-04-02 | 2015-02-12 | Novozymes A/S | Process for making a milk-based protein hydrolysate |
| CN102798632A (zh) * | 2011-05-25 | 2012-11-28 | 兆科药业（合肥）有限公司 | 一种检测巴曲酶活性的方法 |
| ES2881861T3 (es) | 2014-09-26 | 2021-11-30 | Abbott Point Of Care Inc | Sensores para evaluar la coagulación en muestras de fluidos |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4692406A (en) * | 1983-08-25 | 1987-09-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and a reagent for the simultaneous determination of fibrinogen and fibrinogen fission products in plasma |
| WO1989009409A1 (en) * | 1988-03-31 | 1989-10-05 | Ram Nunna | Immunoassays employing novel markers |
| KR20010111891A (ko) * | 2000-06-14 | 2001-12-20 | 정광회 | 뱀의 독소로부터 분리된 신규한 트롬빈 유사효소 및 그의제조방법 |
| CN101680905A (zh) * | 2008-05-22 | 2010-03-24 | 伊西康公司 | 蛋白质分析 |
| CN105102696A (zh) * | 2013-02-08 | 2015-11-25 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 用于目标分子检测的基于亲和力的划分试验 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| N ITOH ET AL.: "Molecular cloning and sequence analysis of cDNA for batroxobin, a thrombin-like snake venom enzyme" * |
| N ITOH, N TANAKA ET AL.: "Molecular cloning and sequence analysis of cDNA for batroxobin, a thrombin-like snake venom enzyme", 《J BIOL CHEM》, pages 3132 - 3135 * |
| WEON-KYOO YOU ET AL.: "Functional characterization of recombinant batroxobin, a snake venom thrombin-like enzyme, expressed from Pichia pastoris", 《FEBS LETT》, vol. 571, no. 1, 30 July 2004 (2004-07-30), pages 70 - 71 * |
| 吴梧桐主编: "《酶类药物学》", 31 January 2011, 中国医药科技出版社, pages: 574 - 576 * |
| 李家增，贺石林主编: "《血栓形成与临床医学》", 30 April 1991, 湖南科学技术出版社, pages: 432 - 433 * |
| 汤琳: "环境污染控制过程高灵敏生物传感技术研究及其检测体系构建" * |
| 汤琳: "环境污染控制过程高灵敏生物传感技术研究及其检测体系构建", 《中国博士学位论文全文数据库 信息科技辑》, pages 140 - 22 * |
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