CN102798632A - 一种检测巴曲酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速、特异性地测定巴曲酶活性的方法，采用生色底物法，使用酶标仪，在一定反应时间和一定活力的标准品范围内获得线性反应曲线，建立产物吸光值和巴曲酶量的线性关系，据此计算样品的相应酶活。此外，还对该标准曲线的回收率和精密度做了仔细研究，该方法准确度高，步骤简单，成本较低，适用于巴曲酶原料及蛇毒血凝酶类制剂的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及药品、生物制品产品领域，具体涉及一种利用生色底物法测定巴曲酶活性的方法。
背景技术
蛇毒血凝酶是从蝰蛇毒中提取并利用现代生物技术分离纯化精制而成。它是一种以止血作用为主的酶制剂，含有两种可促进血液凝固的成分，分别为蝰蛇巴曲酶(Batroxobin)和磷脂依赖性凝血因子X激活物(简称FXA)。其中，对于巴曲酶的研究已有七十多年的历史，早在1936年Van Klobusitzky等就从巴西矛头蛇的毒液中纯化出一种酶性止血剂Batroxobin，在国内又称“巴曲酶”。巴曲酶属于丝氨酸蛋白酶类分子，是一种单链糖蛋白，它能专一作用于纤维蛋白原分子Aα链N末端的Arg16-Gly17肽键，释放血纤维蛋白肽A，生成不稳定的可溶性纤维蛋白Ⅰ单体，进而交联聚合成纤维蛋白Ⅰ多聚体，促进出血部位血小板聚集产生止血效应，并激活血管内皮释放组织型纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)，发挥抗血栓的作用。据报道，巴曲酶在临床上已被广泛应用于不稳定性心绞痛、高黏血症等多种疾病的治疗和闭塞性心脑血管血栓性疾病的预防，疗效确切，不良反应低微。
迄今为止，巴曲酶活性测定主要有两种方法：国家药品标准规定巴曲酶原料及制剂酶活性的测定方法均采用凝固法，在体外将纤维蛋白原转变为纤维蛋白后生成凝块时，根据凝块生成的快慢判定巴曲酶的效价，此方法灵敏度可达到2.5Bu/ml，重现性较好，但该法操作需目测判断纤维蛋白原凝固时间，受检测者主观干扰较大；第二种为酶联免疫吸附法(ELISA)，其原理是利用抗原抗体反应，将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，经底物显色后用分光光度计判定结果，基于酶的高催化效率，反应过程可被无限放大，具有很高的灵敏度和强特异性，但需要高纯度的抗体，成本很高，制约其广泛应用。
鉴于上述方法的局限性，寻找一种高效、经济的活性测定方法成为巴曲酶应用研究的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、可靠、准确的巴曲酶活性测定方法。
本发明中的巴曲酶或降纤酶在检测过程中可解离发色物质S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl)，释放出在405nm波长处有特定吸光值的黄色产物对硝基苯胺(PNA)，通过检测405nm处PNA的吸光度，即可对巴曲酶活性进行测定，在这一波长下，其它物质对光的吸收小于PNA对光吸收的1％，随着酶活性梯度变化，吸光度也呈现梯度变化，在一定时间内，反应产物吸光度与酶的活性线性相关。据此可绘制标准曲线并计算待测巴曲酶样品的活性。该方法包括以下步骤：
(1)配制pH＝7.5，浓度为0.02M的Tris-HCl缓冲液A；
(2)用(1)步制备的缓冲液将巴曲酶生色底物S-2238配制成溶液B；
(3)用(1)步制备的缓冲液将降纤酶标准品配制成系列不同活性单位的母液C；
(4)用(1)步制备的缓冲液将待测巴曲酶样品稀释成溶液D；
(5)将系列不同活性单位的标准品母液C与待测样品溶液D分别加到酶标板不同孔中，再向每孔中补充溶液A和相同体积的溶液B，保持每孔溶液的总体积一致，孔内溶液混合混匀，放入预热至37℃的酶标仪中反应，分别测定每孔中酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，并根据测定得到的不同浓度标准品母液吸光度A405值，绘制标准品的活性单位-吸光度线性标准曲线，上述标准品母液C及待测巴曲酶样品溶液D活性单位为Bu；
(6)将测定的巴曲酶样品的吸光度A405值，代入(5)步得到的酶活性标准曲线，确定待测巴曲酶样品的酶活性。
其中，优选地，上述(2)步中溶液B的浓度为3mM，(3)步使用的降纤酶标准品活性浓度为16Bu/ml，制成的系列不同活性单位的母液C活性是：1.5Bu、1.2Bu、0.9Bu、0.6Bu、0.3Bu、0.15Bu，(5)步中加入的溶液B体积为49.5μl，每孔溶液总体积为300μl。
上述(5)步中的混合溶液在酶标仪预热时间为4分钟，反应时间为15分钟，测定405nm波长处每孔酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸收值A405。
本发明中需加入过量生色底物S-2238，因酶量一定时，酶反应随着底物浓度不断增加到一定程度将表现为0级反应，即酶反应速率不再受底物浓度的影响。因此，在底物远远过量的情况下，酶反应速率对酶浓度呈线性关系。优选地，上述酶标板中每孔溶液总反应体积为300μl时，加入降纤酶标准品母液活性单位＜3Bu/孔，生色底物S-2238溶液浓度≥0.149mM。
本发明反应需预热4分钟，然后再37℃反应15分钟的原因主要在于，未预热时，反应体系里的底物分子和酶分子不能完全接触，易造成局部反应，预热可以加速分子混匀，保证整个体系都能在37℃以最大反应速度反应，容易得到线性反应曲线。
与现有测定方法相比，本发明中整个反应过程在96孔板中进行，体系体积小，效率高，酶标仪的使用也大大减少了吸光度的读数时间。因此，本方法过程简单，便于控制，易于操作，重复性很好。
本发明中，酶与底物生色反应无终止剂，为取得较好的实验结果，整个操作过程需紧凑，以免人为造成标准曲线有较大误差。
附图说明
图1是本发明实施例1中酶活性标准曲线；
图2是本发明实施例2中酶活性标准曲线；
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式。
1、仪器与试药
巴曲酶生色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl)(购于Lexington公司)，降纤酶标准品白色粉末(购于中国药品生物制品检定所、规格为64Bu/瓶)，0.02M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，待测巴曲酶/蛇毒血凝酶样品。
酶标仪(型号Biorad 680)。
2、实验方法
(1)实施例1
①用0.02M Tris-HCl缓冲液，该溶液的pH＝7.5，配制3mM的S-2238底物溶液和16Bu/ml的降纤酶标准品母液；
②随机选取兆科药业(合肥)有限公司生产留样的、批号为20100409的蛇毒血凝酶制剂作为测试样品，标记量为1Ku/ml；
③酶标板中每孔加入活性单位分别为1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15Bu的降纤酶标准品母液，用0.02M Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5，补足至250.5μl，再加入49.5μl 3mM生色底物S-2238溶液，混匀，每个活性单位标准品母液3个复孔，反应体系如表1；
表1 降纤酶标准品反应体系
④酶标板孔中加入0.2Ku蛇毒血凝酶制剂，体积200μl，49.5μl 3mM生色底物S-2238和50.5μl 0.02M Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5，混匀；
⑤将上述③、④制备的酶标板放入预热4分钟至37℃的酶标仪中反应15分钟后，分别平行测定405nm波长处每孔酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405。以降纤酶标准品的活性单位Bu为横坐标，相应的对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405为纵坐标，制作酶活性的标准曲线，实验结果获得的标准曲线方程为：y＝0.625x+0.091，R2＝0.999。测定得到的蛇毒血凝酶制剂吸光度A405值为0.529，将该值代入标准曲线计算得到的该制剂中巴曲酶活力单位为0.7Bu。由于加入反应体系中体积为200μl，故该批蛇毒血凝酶制剂中巴曲酶活力为3.5Bu/ml。
(2)实施例2
选取兆科药业(合肥)有限公司生产的四批蛇毒血凝酶制剂，批号分别为20100315、20100206和20091217，规格均为1Ku/ml。酶标板中，标准曲线反应体系同实施例1，各3个复孔。该三批待测样品反应体系均为200μl制剂(酶量为0.2Ku/孔)、50.5μl Tris-HCl溶液和49.5μl S-2238底物，每个样品各5个复孔。将制备好的酶标板，放入预热4分钟至37℃的酶标仪中反应15分钟后，分别平行测定405nm波长处每孔酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，制作酶活性标准曲线，测定待测样品吸光度A405值，代入标准曲线计算得到的待测样品活性单位见表2。
表2 实施例2样品的测定结果
(3)实施例3
取某批兆科药业(合肥)有限公司分离纯化后留样的蛋白含量为3.3mg/ml和3.73mg/ml的巴曲酶单体，分别用0.02M Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5，将其稀释为3.3μg/ml和3.73μg/ml，在酶标板中，标准曲线反应体系同实施例1，各3个复孔。待测样品反应体系分别为24μl和21μl制剂母液，酶量为0.08μg/孔、226.5μl和229.5μL Tris-HCl溶液和49.5μl S-2238底物，每个样品各5个复孔。将上述制备好的酶标板立即放入预热4分钟至37℃的酶标仪中反应15分钟后，分别平行测定405nm波长处每孔酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，制作酶活标准曲线，测定待测样品吸光度A405值，代入标准曲线计算得到的待测样品活性单位见表3。
表3 实施例3样品的测定结果
(4)实施例4
取另一批兆科药业(合肥)有限公司分离纯化后留样的蛋白含量分别为1.928mg/mL、2.47mg/ml、3.6mg/ml、4.35mg/ml和5.93mg/ml的巴曲酶单体，分别用0.02M Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5，将其稀释为1.928μg/ml、2.47μg/ml、3.6μg/ml、4.35μg/ml和5.93μg/ml。在酶标板中，标准曲线反应体系同实施例1，各3个复孔。待测样品反应体系中酶活性为0.08μg/孔，每孔中分别加入49.5μl 3mM生色底物S-2238溶液，用0.02M Tris-HCl缓冲液，pH＝7.5，补足至300μl，混匀，每个样品各5个复孔。将上述制备好的酶标板，放入预热4分钟至37℃的酶标仪中反应15分钟后，分别平行测定405nm波长处每孔酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，制作酶活的标准曲线，测定待测样品吸光度A405值，代入标准曲线计算得到待测样品活性单位见表4。
表4 实施例4样品的测定结果
(5)实施例5
将邦亭(锦州奥鸿药业有限责任公司，批号20080207，1Ku/管)、巴曲亭(蓬莱诺康药业有限公司，批号0903042，1Ku/管)和立芷雪(瑞士索高药厂，批号812811，1Ku/管)三种注射用血凝酶制剂，分别用0.02M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)将其稀释为4Ku/ml。酶标板中，标准曲线反应体系同实施例1，各2个复孔。待测样品反应体系为200μl制剂母液(酶活力为0.2Ku/孔)、50.5μl Tris-HCl溶液和49.5μl S-2238底物，每个样品各2个复孔。将上述制备好的酶标板立即放入预热4分钟至37℃的酶标仪中反应15分钟后，分别平行测定405nm波长处每孔酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，制作酶活的标准曲线，测定待测样品吸光度A405值，代入标准曲线计算得到的待测样品活性单位见表5。
表5 实施例5样品的测定结果
(6)实施例6
取兆科药业(合肥)有限公司分离纯化后留样的蛋白含量分别为3.467mg/ml、3.75mg/ml、4.46mg/ml和5.115mg/ml的巴曲酶单体为测试样品，用0.02M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)将其稀释，稀释后浓度分别为3.467μg/ml、3.75μg/ml、4.46μg/ml和5.115μg/ml。酶标板中，标准曲线反应体系同实施例1，各2个复孔。待测巴曲酶样品反应体系酶量为0.08μg/孔，每孔中分别加入49.5μl 3mM生色底物S-2238溶液，用0.02M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)补足至300μl，混匀，每个样品各2个复孔。将上述制备好的酶标板立即放入预热4分钟至37℃的酶标仪中反应15分钟后，分别平行测定405nm波长处每孔酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，制作酶活的标准曲线，测定得到待测样品吸光度A405值，代入标准曲线得到的待测样品活性单位见表6。
表6 实施例6样品的测定结果
(7)实施例7
按照以上标准曲线加样方法，共做3块板，每块板标准曲线3个复孔，以降纤酶为标准品，选择兆科药业(合肥)有限公司批号为20100409蛇毒血凝酶制剂为供试品(巴曲酶标示量为3.5Bu/mL)，选取0.60Bu/孔为中浓度，上下增减25％，即0.75/孔、0.45Bu/孔为高、低浓度，每孔中再分别加入49.5μl 3mM生色底物S-2238溶液，用0.02M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)补足至300μl，混匀，每个样品各5个复孔。将上述制备好的酶标板立即放入预热4分钟至37℃的酶标仪中反应15分钟后，分别平行测定405nm波长处每孔酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，制作酶活的标准曲线，测定得到待测样品吸光度A405值见表7。由表中看出：高中低浓度下，计算得到的平均活力单位分别为：0.772、0.584、0.412Bu。三个浓度的平均回收率均较高，大于90％。
表7 标准样品回收率
(8)实施例8
测定降纤酶生色底物法活性测定的精密度。
按照实施例1标准曲线加样方法，共做3块酶标板，每块板标准曲线3个复孔，以降纤酶为标准品，选择兆科药业(合肥)有限公司批号为20100409蛇毒血凝酶制剂为供试品(巴曲酶标示量为3.5Bu/mL)，选取0.60Bu/孔为中浓度，上下增减25％，即0.75/孔、0.45Bu/孔为高、低浓度，以这三个浓度进行精密度考察，共做三块板，一块酶标板中每个浓度平行加样5个孔，三个浓度的反应体系如表8。
表8 降纤酶生色底物法活性测定高中低三个浓度反应体系
得到的三块板的A405数据以及计算的板内精密度数据如表9：
表9 降纤酶生色底物法活性测定板内精密度
板1：
板2
板3：
由表9可以看出，各板中板内CV％在0.96-3.77之间，精密度较好。
由三块板相应浓度下各板测定的平均A405值计算得到的板间精密度见表10：
表10 降纤酶生色底物法活性测定板间精密度
各板间CV％小于3，板间精密度也较好。
(9)实施例9
测定降纤酶生色底物法活性测定的重现性。
选取兆科药业(合肥)有限公司生产的、批号为20100725、20100726和20100728的三批蛇毒血凝酶注射液作为供试品，前后分别在biorad公司的酶标仪(BIORAD 680)和在安徽省药检所使用另一型号酶标仪(PowerWave XS)进行重现性试验。每个供试品分别加入0.2Ku到实施例1中降纤酶标准曲线制作同样的反应体系中，平行测定3个复孔，根据标准曲线分别计算两次测定的三批蛇毒血凝酶注射液制剂中巴曲酶活力，比较不同酶标仪的测定结果。
表11 降纤酶生色底物法活性测定重现性
从上表看出，不同厂家和型号的酶标仪测定结果几乎一致，该方法重新性较好。
(10)实施例10
测定降纤酶生色底物法活性测定的专属性。
以降纤酶为标准品，按照实施例1中标准曲线制作的同时，选择兆科药业(合肥)有限公司生产的蛋白浓度为4.35mg/ml的巴曲酶单体，分别加入0.24、0.2、0.16、0.12、0.08、0.04μg至标准曲线同样的反应体系中，测定各浓度相应的A405值，计算巴曲酶效价，确定0.2μg的浓度的巴曲酶效价为0.737Bu，在本方法学检测范围之内，可用于专属性验证试验。
选择蛋白浓度为1.767mg/ml的FXA单体进行巴曲酶效价测定方法学的干扰性研究。现有制剂中巴曲酶单体和FXA单体的蛋白量约为10∶1，故分别设置高、中、低各5个蛋白浓度(0.2、0.1、0.02、0.01、0.005μg)的FXA单体加入至含0.2μg巴曲酶的反应孔中，同时设置不加FXA只含0.2μg巴曲酶单体的阳性对照及只含不同浓度FXA单体的阴性对照。各组3个复孔，测定其A405值，计算出含不同浓度FXA的体系中0.2μg巴曲酶的效价单位。
表12 巴曲酶效价测定方法学考察—专属性结果
由上表看出，FXA对巴曲酶效价测定方法学没有干扰性，该测定方法对巴曲酶专属性较强。
以上所述为本发明的较佳实施案例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (4)
1.一种检测巴曲酶活性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)配制pH＝7.5，浓度为0.02M的Tris-HCl缓冲液A；
(2)用(1)步制备的缓冲液将巴曲酶生色底物S-2238配制成溶液B；
(3)用(1)步制备的缓冲液将降纤酶标准品配制成系列不同活性单位的母液C；
(4)用(1)步制备的缓冲液将待测巴曲酶样品稀释成溶液D；
(5)将系列不同活性单位的标准品母液C与待测样品溶液D分别加到酶标板不同孔中，再向每孔中补充溶液A和相同体积的溶液B，保持每孔溶液的总体积一致，孔内溶液混合混匀，放入预热至37℃的酶标仪中反应，分别测定每孔中酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，并根据测定得到的不同浓度标准品母液吸光度A405值，绘制标准品的活性单位-吸光度线性标准曲线，上述标准品母液C及待测巴曲酶样品溶液D活性单位为Bu；
(6)将测定的巴曲酶样品吸光度A405值，代入(5)步得到的酶活性标准曲线，确定待测巴曲酶样品的活性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(2)步中溶液B的浓度为3mM，(3)步中使用的降纤酶标准品活性浓度为16Bu/ml，制成的系列不同活性单位的母液C活性是：1.5Bu、1.2Bu、0.9Bu、0.6Bu、0.3Bu、0.15Bu，(5)步中加入的溶液B体积为49.5μl，每孔溶液总体积为300μl。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶标板中每孔溶液总反应体积为300μl时，加入降纤酶标准品母液活性＜3Bu/孔，生色底物S-2238溶液B浓度≥0.149mM。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述(5)步中酶标仪预热时间为4分钟，反应时间为15分钟。
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