CN113252590A - 一种注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：(1)将待测样品进行一次稀释后，与嗜热菌蛋白酶混合，进行孵育酶切，再进行二次稀释，得到待测总活的样品溶液；根据样品的单链比例，将待测样品稀释后，得到待测UK活性的样品溶液；(2)将尿激酶标准品溶液、所述待测总活的样品溶液、所述待测UK活性的样品溶液分别与S‑2444底物溶液混合，放入酶标仪中进行检测，记录OD值，通过绘制标准曲线和计算，得到尿激酶原活性及单链比例。所述检测方法实现了对注射用重组人尿激酶原纯化中间体、原液及成品中总活性及UK活性的定量检测，操作简单、快速、灵敏度高，重现性好，大大提高检验效率。
Description
技术领域
本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法。
背景技术
注射用重组人尿激酶原(商品名，普佑克)用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治疗。注射用重组人尿激酶原的原料为重组人尿激酶原(pro-UK)，即注射用重组人尿激酶原的原液，其制备方法见200410058006.0(公开号为CN1730098A)。
注射用重组人尿激酶原(Pro-UK)原料的原生产工艺是20L发酵规模。20L发酵工艺中采用S-2444生色速率法对注射用重组人尿激酶原原液及成品得单链比例进行测定。目前，为了满足蓬勃发展的市场需求，现将工艺放大到300L发酵规模。
因此，为满足纯化工艺中各步中间体及发酵液质量控制及更多的样品检验需求，需要开发除准确度更好、效率更高的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法。所述检测方法实现了对注射用重组人尿激酶原纯化中间体、原液及成品中总活性及UK活性的定量检测，操作简单、快速、灵敏度高，重现性好，大大提高检验效率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将待测样品进行一次稀释后，与嗜热菌蛋白酶混合，进行孵育酶切，再进行二次稀释，得到待测总活的样品溶液；根据样品的单链比例，将待测样品稀释后，得到待测UK活性的样品溶液；
(2)将尿激酶标准品溶液、所述待测总活的样品溶液、所述待测UK活性的样品溶液分别与S-2444底物溶液混合，放入酶标仪中进行检测，记录OD值，通过绘制标准曲线和计算，得到尿激酶原活性及单链比例。
由于注射用重组人尿激酶原纯化中间体、原液及成品中部分样品的UK活性很低，因此注射用重组人尿激酶原活性及单链比例检测难度大。因此，在本发明中，选用特异性底物S2444作为显色底物，使样品活性能够通过酶标仪等设备准确检测；选用T60(嗜热菌蛋白酶)将单链的尿激酶原酶切为双链的尿激酶；选用灵敏度高，读数迅速的酶标仪；通过选择高特异性底物，优化显色读数时间，优化酶切时间等，以准确测定样品活性。
在本发明中，选择S-2444作为底物，S-2444是一种通过化学方法合成的特异性尿激酶发色底物其分子式为Pyro-Glu-Arg-pNA，反应原理如下所示：(其中，pNA的生成速率(即每1秒405nm处增加的吸光度)与酶活性成正比)
在本发明中，S2444显色底物由上海船夫生物技术有限公司和吉尔生化有限公司定制。这两种显色底物均可与尿激酶进行反应，且标准品不同浓度点回算结果RSD在1.16％～2.58％。故两种显色底物均可用于此方法。
优选地，步骤(1)中，所述稀释均采用Tris-Base缓冲液。
优选地，步骤(1)中，所述Tris-Base缓冲液的pH为7-8，例如可以是7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8等。
优选地，以所述Tris-Base缓冲液总质量为100％计，所述Tris-Base缓冲液按质量百分含量计包括：三羟甲基氨基甲烷0.5-1.0％、氯化钠0.5-1.0％、Tween-200.005-0.015％，余量为水。
以所述Tris-Base缓冲液总质量为100％计，所述三羟甲基氨基甲烷含量为0.5-1.0％，例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等。
以所述Tris-Base缓冲液总质量为100％计，所述氯化钠含量为0.5-1.0％，例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等。
以所述Tris-Base缓冲液总质量为100％计，所述Tween-20含量为0.005-0.015％，例如可以是0.005％、0.006％、0.008％、0.01％、0.012％、0.014％、0.015％等。
优选地，所述Tris-Base缓冲液由以下制备方法制备得到：将三羟甲基氨基甲烷和氯化钠溶于MilliQ注射用水后，与Tween-20混合后，再采用盐酸调节pH，最后再采用MilliQ注射用水定容。
优选地，步骤(1)中，所述一次稀释后得到的待测样品溶液浓度为0.01-1mg/mL，例如可以是0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL等。
优选地，步骤(1)中，所述嗜热菌蛋白酶的添加浓度为55-65μg/mL，例如可以是55μg/mL、56μg/mL、57μg/mL、58μg/mL、59μg/mL、60μg/mL、61μg/mL、62μg/mL、63μg/mL、64μg/mL、65μg/mL等，优选为60μg/mL。
优选地，步骤(1)中，所述孵育酶切的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，优选为37℃。
优选地，步骤(1)中，所述孵育酶切的时间为30-60min，例如可以是30min、35min、36min、37min、38min、39min、40min、41min、42min、45min、50min、55min、60min等，优选为40-60min，进一步优选为40min。
取相同样品，相同方法平行制备，在相同温度下酶切不同时间，以酶切60min为基准，计算各个时间下的活性；当酶切时间从40min到60min时，其测得活性一致，激活率在99-100％，因此选择40min作为此方法的酶切时间。
优选地，步骤(2)中，所述二次稀释为稀释至标准曲线定量限内。
优选地，步骤(2)中，所述待测总活的样品溶液的浓度为40-400ng/mL，例如可以是40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、140ng/mL、160ng/mL、180ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、300ng/mL、350ng/mL、400ng/mL等。
优选地，所述样品的单链比例与待测样品的稀释倍数成负相关，待测样品的蛋白浓度和稀释倍数成正相关。
单链比例为样品本身属性与总活样品稀释倍数无关，相同蛋白浓度的样品其单链比例越高，UK活性样品的稀释倍数越低。优选地，步骤(2)中，所述尿激酶标准品溶液的浓度为40-400ng/mL，例如可以是40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、140ng/mL、160ng/mL、180ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、300ng/mL、350ng/mL、400ng/mL等。
优选地，步骤(2)中，所述S-2444底物溶液的浓度为1-2mg/mL，例如可以是1mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL等。
优选地，步骤(2)中，所述检测使用96孔板于酶标仪内读取OD值。
由于在各类吸光度检测设备中，酶标仪可以对96孔板进行读数，且具备温度控制功能，可以满足实验需求，对样品量需求少，且灵敏度高。在本方法中极其适用。
优选地，步骤(2)中，所述检测的读数波长为400-410nm，例如可以是400nm、401nm、402nm、403nm、404nm、405nm、406nm、407nm、408nm、409nm、410nm等，优选为405nm。
优选地，步骤(2)中，所述检测的读数时间为10-80min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min等，优选为60min。
由于S-2444在与尿激酶反应后，会根据酶活性的大小生成产物，其产物在405nm处有最大光吸收，通过检测单位时间内光吸收值的变化，可根据光吸收值的变化值进行活性计算。原有的生色速率法通过连续读取5个时间点的OD值，再以OD值及读数时间做回归曲线，取斜率(即生色速率)进行活性计算，此方法数据量大，计算复杂。当底物溶液加入反应孔的时间一定时，其在一定时间下的OD值大小即可准确反映出其样品的活性大小。
而当时间较短时，样品与底物来不及反应，不同浓度的样品间OD值差别很小不能准确反应出活性；当时间较长时，受底物浓度及设备读数上限限制，部分活性较高的样品可能会停止反应或者达到仪器读数上限。因此，为获得最好的实验结果，应选择合适的反应时间。
优选地，步骤(2)中，所述检测的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，优选为37℃。
优选地，所述绘制标准曲线为：以尿激酶标准品溶液的浓度为横坐标，以尿激酶标准品溶液的OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
优选地，将所述待测总活的样品溶液的OD值代入标准曲线中，计算得到样品的总活；将所述待测UK活性的样品溶液的OD值代入标准曲线中，计算得到样品的UK活性。
优选地，所述单链比例的计算公式为：单链比例＝(样品的总活-样品的UK活性)/样品的总活。
优选地，所述检测方法包括以下步骤：
(1)采用Tris-Base缓冲液将待测样品稀释至后0.01-1mg/mL，加入浓度为55-65μg/mL的嗜热菌蛋白酶，混匀后，在35-40℃下进行孵育酶切40-60min，再采用Tris-Base缓冲液稀释至标准曲线定量限内，得到待测总活的样品溶液；根据样品的单链比例，将待测样品稀释后，得到待测UK活性的样品溶液；
(2)分别取尿激酶标准品溶液、所述待测总活的样品溶液、所述待测UK活性的样品溶液点样于96孔板中；再分别加入1-2mg/mL的S-2444底物溶液，放入酶标仪中进行读数；
通过绘制标准曲线和计算，得到尿激酶原活性及单链比例：以尿激酶标准品溶液的浓度为横坐标，以尿激酶标准品溶液的OD值为纵坐标，绘制标准曲线；将所述待测总活的样品溶液的OD值代入标准曲线中，计算得到样品的总活；将所述待测UK活性的样品溶液的OD值代入标准曲线中，计算得到样品的UK活性；所述单链比例＝(样品的总活-样品的UK活性)/样品的总活。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明选用特异性底物S2444作为显色底物，使样品活性能够通过酶标仪等设备准确检测；选用T60(嗜热菌蛋白酶)将单链的尿激酶原酶切为双链的尿激酶；选用灵敏度高，读数迅速的酶标仪；通过选择高特异性底物，优化显色读数时间，优化酶切时间等，以准确测定样品活性；
(2)本发明提供的方法实现了对注射用重组人尿激酶原纯化中间体、原液及成品中总活性及UK活性的定量检测，操作简单、快速、灵敏度高，重现性好，大大提高检验效率。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中各组分来源如下所示：
尿激酶标准品：中国食品药品检定研究院，140410-201224；
待测样品：天士力生物医药股份有限公司生产；
嗜热菌蛋白酶：sigma公司，T7902；
S-2444底物：上海船夫生物技术有限公司。
制备例1
本制备例提供一种Tris-Base缓冲液，所述Tris-Base缓冲液由以下制备方法制备得到：称取三羟甲基氨基甲烷6.06g，氯化钠5.86g于烧杯中，加入MilliQ注射用水溶解后，加入100μL的Tween-20，混匀后调节pH至7.5，再定容至1000mL。2-8℃保存。
制备例2
本制备例提供一种激活剂T60(嗜热菌蛋白酶)，所述激活剂T60(嗜热菌蛋白酶)由以下方法配置得到：称取0.006g的T60，加入上述Tris-B缓冲液(pH 7.5)溶解后，定容至100mL，0.5mL/支分装后，≤-20℃保存。
制备例3
本制备例提供一种S-2444底物溶液，所述S-2444底物溶液由以下方法配置得到：取S2444尿激酶显色剂，根据其标示量，加入Tris-B缓冲液(pH 7.5)使其终浓度为1.5mg/mL，2-8℃下避光保存。
制备例4
本制备例提供不同浓度的尿激酶标准品溶液，所述尿激酶标准品溶液由以下方法配置得到：取尿激酶标准品，根据其标示量，加入Tris-B缓冲液(pH 7.5)溶解，使其溶液浓度为99.20IU/mL，得到尿激酶标准品母液；
Sta01(99.20IU/mL)：取尿激酶标准品母液100μL加入96孔板即得；
Sta02(79.36IU/mL)：取尿激酶标准品母液80μL加入96孔板，再加入Tris-B缓冲液(pH 7.5)20μL，混匀即得；
Sta03(59.52IU/mL)：取尿激酶标准品母液60μL加入96孔板，再加入Tris-B缓冲液(pH 7.5)40μL，混匀即得；
Sta04(39.68IU/mL)：取尿激酶标准品母液40μL加入96孔板，再加入Tris-B缓冲液(pH 7.5)60μL，混匀即得；
Sta05(19.84IU/mL)：取尿激酶标准品母液20μL加入96孔板，再加入Tris-B缓冲液(pH 7.5)80μL，混匀即得；
Sta06(9.92IU/mL)：取尿激酶标准品母液10μL加入96孔板，再加入Tris-B缓冲液(pH 7.5)90μL，混匀即得；
空白对照(Blank)：加入Tris-B缓冲液(pH 7.5)100μL，即得。
实施例1
本实施例提供一种注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)采用Tris-Base缓冲液将待测样品稀释至后0.01-1mg/mL，加入浓度为60μg/mL的嗜热菌蛋白酶，混匀后，在37℃下进行孵育酶切40min，再采用Tris-Base缓冲液稀释至标准曲线定量限内，得到待测总活的样品溶液；根据样品的单链比例，将待测样品稀释后，得到待测UK活性的样品溶液；
(2)分别取尿激酶标准品溶液、所述待测总活的样品溶液、所述待测UK活性的样品溶液点样于96孔板中；再分别加入1.5g/mL的S-2444底物溶液，放入酶标仪中进行读数；
通过绘制标准曲线和计算，得到尿激酶原活性及单链比例：以尿激酶标准品溶液的浓度为横坐标，以尿激酶标准品溶液的OD值为纵坐标，绘制标准曲线；将所述待测总活的样品溶液的OD值代入标准曲线中，计算得到样品的总活；将所述待测UK活性的样品溶液的OD值代入标准曲线中，计算得到样品的UK活性；所述单链比例＝(样品的总活-样品的UK活性)/样品的总活。
实施例2
读数时间筛选
S-2444在与尿激酶反应后，会根据酶活性的大小生成产物，其产物在405nm处有最大光吸收，通过检测单位时间内光吸收值的变化，可根据光吸收值的变化值进行活性计算。原有的生色速率法通过连续读取5个时间点的OD值，再以OD值及读数时间做回归曲线，取斜率(即生色速率)进行活性计算，此方法数据量大，计算复杂。当底物溶液加入反应孔的时间一定时，其在一定时间下的OD值大小即可准确反映出其样品的活性大小。当时间较短时，样品与底物来不及反应，不同浓度的样品间OD值差别很小不能准确反应出活性；当时间较长时，受底物浓度及设备读数上限限制，部分活性较高的样品可能会停止反应或者达到仪器读数上限。
具体测试结果如下表1所示：
表1
由表1测试数据可知，分别用10-80minOD值拟合的标准曲线均满足R2>0.99，每个浓度点准确度均大于90％。结合标准品最低浓度点OD值的信噪比，标准品最高点OD值，设备OD值检测限，实验效率等因素，最终选择60min作为此方法的数据采集点。
实施例3
酶切孵育时间
取制备例2提供的样品，在37℃下酶切不同时间，以酶切60min为基准，计算各个时间下的活性，结果见下表2：
表2
| 酶切时间/min | 60 | 50 | 40 | 30 | 20 | 10 | 0 |
| 总活性(IU) | 3965630 | 3908741 | 3945877 | 3843160 | 3601383 | 3001679 | -76642 |
| 激活率/％ | 100 | 99 | 100 | 96 | 92 | 79 | -3 |
由表2测试数据可知，当酶切时间从40min到60min时，其测得活性一致，因此选择40min作为此方法的酶切时间。
实施例4
专属性1-尿激酶标准品催化底物显色反应
尿激酶标准品：用Tris-B缓冲液(pH 7.5)将标准品母液稀释至99.20IU/mL、79.36IU/mL、59.52IU/mL、39.68IU/mL、19.84IU/mL、9.92IU/mL做标准曲线；
尿激酶标准品+空白辅料：取空白辅料(除不含尿激酶原外，其他组分均与注射用重组人尿激酶原组分完全一致的空白对照样品)1只，加入2mL Tris-B缓冲液(pH 7.5)复溶后，用此溶液溶解并稀释尿激酶标准品母液至99.20IU/mL、79.36IU/mL、59.52IU/mL、39.68IU/mL、19.84IU/mL、9.92IU/mL，平行制备3份；
尿激酶标准品+T60：取尿激酶标准品1只，用浓度为15ug/mL的T60溶液溶解并稀释至99.20IU/mL、79.36IU/mL、59.52IU/mL、39.68IU/mL、19.84IU/mL、9.92IU/mL，平行制备3份。
结果见下表3：
表3
由表3测试结果可知，样品反应体系中的空白辅料和T60对底物S2444的显色反应无影响。此专属性验证通过。
实施例5
专属性2-对照品单链比例检测专属性验证
注射用重组人尿激酶原对照品：取注射用重组人尿激酶原对照品1支，加入Tris-B缓冲液(pH 7.5)复溶后稀释至0.01mg/ml后按照实施例1进行检测，平行制备3份；
注射用重组人尿激酶原对照品+人血白蛋白：取注射用重组人尿激酶原对照品1支，用含有3‰人血白蛋白的Tris-B缓冲液(pH 7.5)复溶后稀释至0.01mg/ml后按照实施例1进行检测，平行制备3份。
具体结果见下表4：
表4
由表4测试结果可知，在对照品单链比例检测中，加入人血清白蛋白后，单链比例检测结果与未添加的检测结果一致。故人血清白蛋白对对照品的单链比例检测无影响，此专属性验证通过。
实施例6
定量范围测试
尿激酶标准品：用Tris-B缓冲液(pH7.5)将标准品母液稀释至约120IU/ml、100IU/ml、80IU/ml、60IU/ml、40IU/ml、20IU/ml、10IU/ml、5IU/ml，每个浓度平行制备3份。
具体结果见下表5：
表5
如表5所示，配置的5-120IU/ml的尿激酶标准品所拟合的标准曲线均满足标准曲线R2>0.98，符合标准。
实施例7
准确度测试
取原液及成品各1批，激活后进行不同倍数稀释，一份直接进行检测，另一份添加标准品后进行检测。平行制备3份，稀释倍数如表6所示，具体测试结果果参见下表7所示：
表6
表7
如表7所示，在原液和成品中加入标准品，检测的准确都在标准范围内。因此，检测准确度满足要求。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明所述注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将待测样品进行一次稀释后，与嗜热菌蛋白酶混合，进行孵育酶切，再进行二次稀释，得到待测总活的样品溶液；根据样品的单链比例，将待测样品稀释后，得到待测UK活性的样品溶液；
(2)将尿激酶标准品溶液、所述待测总活的样品溶液、所述待测UK活性的样品溶液分别与S-2444底物溶液混合，放入酶标仪中进行检测，记录OD值，通过绘制标准曲线和计算，得到尿激酶原活性及单链比例。
2.根据权利要求1所述的注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述稀释均采用Tris-Base缓冲液；
优选地，步骤(1)中，所述Tris-Base缓冲液的pH为7-8。
3.根据权利要求1或2所述的注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述一次稀释后得到的待测样品溶液浓度为0.01-1mg/mL；
优选地，步骤(1)中，所述嗜热菌蛋白酶的添加浓度为55-65μg/mL，优选为60μg/mL。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述孵育酶切的温度为35-40℃，优选为37℃；
优选地，步骤(1)中，所述孵育酶切的时间为30-60min，优选为40-60min，进一步优选为40min。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述二次稀释为稀释至标准曲线定量限内；
优选地，步骤(2)中，所述待测总活的样品溶液的浓度为40-400ng/mL。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，所述样品的单链比例与待测样品的稀释倍数成负相关，待测样品的蛋白浓度和稀释倍数成正相关。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述尿激酶标准品溶液的浓度为40-400ng/mL；
优选地，步骤(2)中，所述S-2444底物溶液的浓度为1-2mg/mL。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述检测使用96孔板于酶标仪内读取OD值；
优选地，步骤(2)中，所述检测的读数波长为400-410nm，优选为405nm；
优选地，步骤(2)中，所述检测的读数时间为10-80min，优选为60min；
优选地，步骤(2)中，所述检测的温度为35-40℃，优选为37℃。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，所述绘制标准曲线为：以尿激酶标准品溶液的浓度为横坐标，以尿激酶标准品溶液的OD值为纵坐标，绘制标准曲线；
优选地，将所述待测总活的样品溶液的OD值代入标准曲线中，计算得到样品的总活；将所述待测UK活性的样品溶液的OD值代入标准曲线中，计算得到样品的UK活性；
优选地，所述单链比例的计算公式为：单链比例＝(样品的总活-样品的UK活性)/样品的总活。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)采用Tris-Base缓冲液将待测样品稀释至后0.01-1mg/mL，加入浓度为55-65μg/mL的嗜热菌蛋白酶，混匀后，在35-40℃下进行孵育酶切40-60min，再采用Tris-Base缓冲液稀释至标准曲线定量限内，得到待测总活的样品溶液；根据样品的单链比例，将待测样品稀释后，得到待测UK活性的样品溶液；
(2)分别取尿激酶标准品溶液、所述待测总活的样品溶液、所述待测UK活性的样品溶液点样于96孔板中；再分别加入1-2mg/mL的S-2444底物溶液，放入酶标仪中进行读数；
通过绘制标准曲线和计算，得到尿激酶原活性及单链比例：以尿激酶标准品溶液的浓度为横坐标，以尿激酶标准品溶液的OD值为纵坐标，绘制标准曲线；将所述待测总活的样品溶液的OD值代入标准曲线中，计算得到样品的总活；将所述待测UK活性的样品溶液的OD值代入标准曲线中，计算得到样品的UK活性；所述单链比例＝(样品的总活-样品的UK活性)/样品的总活。
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