CN103063592A

CN103063592A - 一种肝素活性的测定方法

Info

Publication number: CN103063592A
Application number: CN2012105891183A
Authority: CN
Inventors: 曹海军; 叶生亮; 胡吉军; 袁靖; 李长清; 陈云华; 刘欣晏; 杨刚
Original assignee: Guizhou Taibang Biological Products Co ltd; Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Guizhou Taibang Biological Products Co ltd; Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: CN103063592B

Abstract

本发明公开一种肝素活性的测定方法，包括标准品与样品处理，标准曲线制定及样品测定，样品肝素活性含量计算三步；其反应体系及时间：①10～40μl肝素活性浓度为0～0.1IU/ml的标准曲线制定溶液及样品与10～40μl浓度为1IU/ml的抗凝血酶混合，37℃孵育3分钟；②加入10～40μl浓度为10nkat/ml活化的牛凝血因子Ⅹ，混合后37℃孵育1.5分钟；③加入10～40μl浓度为2.5mmol/L发色底物S-2765，混合后37℃孵育3分钟；④加入10～40μl体积浓度为50%的乙酸，混合均匀终止反应；试剂使用微量，检测效率高，测定结果精准度高，更适应于较低肝素活性样品的检测。

Description

一种肝素活性的测定方法

技术领域

本发明属于生物医药检测技术领域，具体涉及一种肝素活性的测定方法。

背景技术

肝素是由二种多糖交替连接而成的多聚体，无论在体内还是体外，均具有很强的抗凝作用，临床上把它作为抗凝剂药物而广泛使用，主要用于血栓性疾病的治疗及心血管手术、血液透析、体外循环等过程的抗凝处理。

肝素作为药物，其活性功能的精准检测无论对于生产过程的质量控制还是临床治疗中患者的动态监控均具有重要的意义。作为生物活性物质，其检测不能单单用化学或物理的方法，必须与生物检测法结合，目前肝素的活性测定多采用凝固法和发色底物法。

欧洲药典第7版（European Pharmacopoeia 7.0，EP7.0）采用凝固法测定肝素，该法的基本原理是观察在一定条件下待测样品与标准品对枸橼酸钠抗凝羊血浆与高岭土和脑磷脂混合、重钙化后的抗凝作用（凝固时间），来判断待测样品的肝素活性含量。中国药典（2010版）（三版）同样采用凝固法测定肝素活性，利用硫酸鱼精蛋白能中和肝素，进而影响反应体系中血浆凝固时间，通过凝固时间及中和的硫酸鱼精蛋白量来推算肝素活性。凝固法操作繁琐，耗时费力，尤其是中国药典所采用的方法，最终活性通过两个变量因素间接获得，精准性很差。相对于凝固法，发色底物法具有灵敏度高，操作简便的特点。美国药典第32版（United States Pharmacopeia 32，USP32）对肝素活性测定采用发色底物法，利用肝素-抗凝血酶复合物能够抑制活化的凝血因子Ⅹ水解发色底物的显色反应的基本原理，所述方法虽减少了检测时间，简化了操作程序，但由于其反应体系及时间的限制，需采用对数方程拟合标准曲线，进过对数方程的计算，检测结果与实际偏差较大，更不适于低活性肝素样品的检测。

发明内容

发明目的：本发明针对上述测定技术中存在问题，建立了一种具有较高精准性的肝素活性测定方法，试剂使用微量，操作简便。

技术方案：本发明所采用的技术方案为：

一种肝素活性的测定方法，其操作过程、反应体系及时间具体为：

1. 标准品与样品的处理

0.02mol/LTris缓冲液pH8.4梯度稀释肝素标准品，肝素活性浓度范围在0~0.1IU/ml之间；取4种或4种以上梯度活性浓度，制定标准曲线。样品如需稀释，同样用0.02mol/L Tris缓冲液（pH8.4）稀释至肝素活性浓度至0~0.1IU/ml。

Tris：是Tris(Hydroxymethyl)aminomethane的常用缩写；中文品名：三羟甲基氨基甲烷。

IU ：是International unit的常用缩写，是用生物活性来表示某些蛋白质、抗生素、激素、维生素及抗毒素量的药学单位。

IU/ml：是单位体积（ml）中所含的生物活性量。

2. 标准曲线制定及样品测定

（1）10~40μl等体积的已稀释标准品及样品加入微孔板不同孔中；

（2）每孔同时加入10~40μl等体积的1 IU/ml 抗凝血酶溶液，混合均匀，37℃孵育3分钟；

（3）每孔同时加入10~40μl等体积活化的牛凝血因子Ⅹ溶液，其浓度为10 nkat/ml，混合均匀，37℃孵育1.5分钟；

（4）每孔同时加入10~40μl等体积发色底物S-2765溶液，即N-α-苄氧羰基- D-精氨酰- L-甘氨酰-L-精氨酸-P-硝基苯胺的盐酸盐，N-α-Z-D-Arg-gly-Arg-pNA. HCl溶液，其浓度为2.5 mmol/L，混合均匀，37℃孵育3分钟；

（5）每孔同时加入10~40μl等体积50%（v/v）乙酸，混合均匀终止反应；

（6）10~40μl对应的测定溶液与4倍体积超纯水混合后作空白对照；

（7）微孔板直接在酶标仪上于405nm波长读取吸光值；

（8）根据肝素标准品梯度浓度与所对应吸光值，采用线性方程绘制标准曲线。

3. 样品肝素活性含量计算

依据标准曲线和样品反应物所对应的吸光值，计算肝素活性含量。

上述的一种肝素活性测定方法，其特征在于：所述的10～40μl标准曲线制定溶液及样品、10～40μl浓度为1 IU/ml 的抗凝血酶溶液、10～40μl浓度为10 nkat/ml活化的牛凝血因子Ⅹ溶液、10～40μl浓度为2.5 mmol/L发色底物S-2765、10～40μl 浓度为50%（v/v）乙酸和10～40μl对应的标准曲线制定溶液或待测样品，在同一次测定中所加的量（μl）相同。

本发明有益效果是：

本发明试剂使用微量，操作简便，检测效率提高；所设计的反应体系与时间，检测结果精准性高，更适应于低肝素活性样品的检测。

附图说明

图1为肝素活性测定标准曲线

其中图1中横坐标代表405nm条件下的吸光度，纵坐标代表不同肝素活性（IU/ml），直线是根据不同肝素活性（IU/ml）与405nm条件下的吸光度，采用线性方程所绘制标准曲线。

图1的作用：图1中标准曲线中每一个405nm吸光度值对应一个肝素活性值（IU/ml），根据样品反应体系所测的405nm吸光度值，再根据图1，即可获得对应的样品肝素活性值（IU/ml）。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明所述的测定法做进一步的描述。

实施例1：标准品中肝素活性的测定

（1）以欧洲药品质量管理局（European Directorate for Quality Medicines, EDQM）生产的肝素标准品（1000IU/ml）为供试品，用0.02mol/L Tris缓冲液（pH8.4）将供试品分别稀释20000倍、50000倍和100000倍作为待测标准品A、B、C。

（2）以另一批号EDQM肝素标准品，用0.02mol/L Tris缓冲液（pH8.4）将其稀释为梯度浓度为0.1 IU/ml、0.075 IU/ml、0.05 IU/ml、0.025 IU/ml、0.0125 IU/ml、0.00625 IU/ml、0 IU/ml作为标准曲线制定溶液。

（3）取20μl标准曲线制定溶液和待测标准品A、B、C于微孔板不同孔中；

（4）每孔加入1 IU/ml 抗凝血酶-Ⅲ标准溶液20μl，混合均匀，37℃孵育3分钟；

（5）每孔加入10 nkat/ml牛FⅩa溶液20μl，混合均匀，37℃孵育1.5分钟；

（6）每孔加入2.5 mmol/L S-2765溶液20μl，混合均匀，37℃孵育3分钟；

（7）每孔加入50%（v/v）乙酸20μl，混合均匀终止反应；

（8）20μl对应的标准曲线制定溶液或待测标准品与80μl超纯水混合，分别作为空白对照；

（9）酶标仪405nm波长读取吸光值；

（10）依据标准曲线制定溶液浓度与对应的吸光值，采用线性方程绘制标准曲线。

（11）根据标准曲线及待测标准品A、B、C吸光值计算肝素活性含量。4次重复检测，求均值。

本实施例标准曲线见附图1，测定结果见表1。

表1. 标准品中肝素的活性测定

编号	标准品中实际肝素活性（IU/ml）	测定值（mean±SD）（IU/ml）
			A	0.05	0.0488±0.0025
B	0.02	0.0213±0.0033
			C	0.01	0.0097±0.0012

mean±SD含义为：平均数±标准差。标准差（Standard Deviation，SD），是各数据偏离平均数的距离的平均数，它是离均差平方和平均后的方根，能反映一个数据集的离散程度。在本实施例中标准差（Standard Deviation，SD）可表示实验重复性的优劣，标准差越大说明重复性越差，标准差越小说明重复性越好。

结果表明：采用本发明所设计的反应体系及时间，标准曲线直线方程相关系数R²=0.990（见附图1），拟合度高；不同肝素标准品测定结果均接近肝素活性实际值，且标准偏差小（见表1），能精确测定0.01IU/ml水平的肝素活性。

实施例2：人血浆中肝素活性的测定

（1）以分离的人新鲜枸橼酸钠抗凝血浆为供试品，分别将血浆与稀释10倍的血浆作为待测样品A、B；

（2）0.02mol/L Tris缓冲液（pH8.4）稀释EDQM肝素标准品至0.1 IU/ml、0.075 IU/ml、0.05 IU/ml、0.025 IU/ml、0.0125 IU/ml、0.00625 IU/ml、0 IU/ml梯度浓度，作标准曲线制定溶液。

（3）取40μl标准曲线制定溶液和待测样品A、B于微孔板不同孔中；

（4）每孔加入1 IU/ml 抗凝血酶溶液40μl，混合均匀，37℃孵育3分钟；

（5）每孔加入10 nkat/ml牛FⅩa溶液40μl，混合均匀，37℃孵育1.5分钟；

（6）每孔加入2.5 mmol/L S-2765溶液40μl，混合均匀，37℃孵育3分钟；

（7）每孔加入50%（v/v）乙酸40μl，混合均匀终止反应；

（8）40μl对应的测定溶液与160μl超纯水混合物分别作为空白对照；

（9）微孔板直接在酶标仪上于波长405nm处读取吸光值；

（10）依据标准曲线制定溶液浓度与对应的吸光值，采用线性方程绘制标准曲线；

（11）根据标准曲线及待测标准品A、B吸光值计算肝素活性含量。4次重复检测，求均值。

本实施测定结果见表2。

表2. 人血浆中肝素活性测定

结果表明，不经稀释的人血浆中肝素活性平均值为0.0417IU/ml，经10倍稀释的人血浆肝素活性平均值为0.00396 IU/ml，其实际肝素活性平均值为0.0396 IU/ml，与不经稀释的样品测定结果接近（表2）。说明本发明能测定较低肝素活性含量的样品，具有较好的精准度。同时，两种人血浆样品测定结果标准偏差分别为0.00158和0.00049（表2），说明本发明具有较好的重复性。

Claims

1.一种肝素活性的测定方法，其特征在于其操作过程、反应体系及时间具体为：

①标准品与样品的处理

0.02mol/L，pH8.4的Tris缓冲液梯度稀释肝素标准品至肝素活性浓度范围在0~0.1IU/ml之间；取4种或4种以上梯度活性浓度来制定标准曲线；待测样品如需稀释，同样用0.02mol/L，pH8.4的Tris缓冲液稀释至肝素活性浓度为0~0.1IU/ml；

②标准曲线制定及样品测定

a．10~40μl等体积的已稀释的标准曲线制定溶液及样品同时加入微孔板不同孔中；

b．每孔同时加入10~40μl等体积的1 IU/ml 抗凝血酶溶液，混合均匀，37℃孵育3分钟；

c．每孔同时加入10~40μl等体积活化的牛凝血因子Ⅹ溶液，其浓度为10 nkat/ml，混合均匀，37℃孵育1.5分钟；

d．每孔同时加入10~40μl等体积发色底物N-α-苄氧羰基- D-精氨酰- L-甘氨酰-L-精氨酸-P-硝基苯胺的盐酸盐，N-α-Z-D-Arg-gly-Arg-pNA?HCl 即S-2765溶液，其浓度为2.5 mmol/L，混合均匀，37℃孵育3分钟；

e．每孔同时加入10~40μl等体积的体积浓度为50%的乙酸，混合均匀终止反应；

f．10~40μl对应的标准曲线制定溶液或待测样品与4倍体积超纯水混合后作空白对照；

g．微孔板直接在酶标仪上于405nm波长读取吸光值；

h．根据肝素标准品梯度浓度与所对应吸光值，采用线性方程绘制标准曲线；

③样品肝素活性含量计算

2.根据权利要求1所述的一种肝素活性的测定方法，其特征在于：所述的10～40μl标准曲线制定溶液及样品、10～40μl浓度为1 IU/ml 的抗凝血酶溶液、10～40μl浓度为10 nkat/ml活化的牛凝血因子Ⅹ溶液、10～40μl浓度为2.5 mmol/L发色底物S-2765、10～40μl 体积浓度为50%的乙酸和10～40μl对应的标准曲线制定溶液或待测样品，在同一次测定中所加的μl量相同。