CN105203479A - 用血凝仪测定肝素或低分子量肝素效价的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法，所述方法包括以下步骤：（1）标准系列溶液的配置，（2）绘制标准曲线，（3）样品的处理及检测，（4）计算。本方法用血凝仪自动稀释成4个标准溶液的浓度，人为误差小，所有的操作步骤都自动完成，杜绝了时间、温度，搅拌的人为影响，实验精度高；所用试剂的反应由半微量反应变为了微量反应，节省了昂贵的试剂；本方法为线性方程法，直观。
Description
技术领域
本发明涉及一种肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）效价的检测方法，尤其涉及一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法。
背景技术
肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）是一种抗凝血和抗血栓形成的药物。肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）可分离抗血栓活性，即抗Xa效价。人体血浆中Xa活性与血栓形成关系较密切，也就是说，因子Xa活性偏高，会出现临床上形成血栓状况，故在临床上常常使用肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）的抗Xa效价活性。
现在中国药典、欧洲药典均采用发色底物法检测肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）的抗Xa效价，这种方法需要测定16管样本，其中8个为标准品的反应数据，8个为试样的反应数据，这些反应均为体外模拟抗栓的酶反应。由于体外模拟的酶反应的影响因素较多，人为控制反应的准确性很难，往往得不到准确的数据，经常出现数据波动性大的问题；且这种方法为半微量酶反应，反应所用试剂很贵，实验成本很高。
所以，开发一种精确、简便的抗Xa的测定方法，来指导肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）低分子量肝素生产厂家的质量控制，也可以为医院临床提供精准的剂量控制是非常有益的和十分必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：发色底物法繁琐、误差大、成本高。针对现有技术存在的不足，提供一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）标准系列溶液的配置
准确配制标准品溶液、ATⅢ溶液、Xa因子溶液、发色底物S-2765溶液；
（2）绘制标准曲线
利用血凝仪自动配制标准品溶液进行稀释，得到4个梯度浓度的标准品溶液，依次加入ATⅢ溶液、Xa因子溶液、发色底物S-2765溶液，在血凝仪内进行反应，反应结束后，自动在测定吸光度；然后以标准品溶液稀释浓度的对数值为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性方程，Y=kX+b，计算相关系数R2；
（3）样品的处理及检测
配制一定浓度的供试品溶液，溶液浓度预估在标准品稀释浓度范围之内，然后依次加入ATⅢ溶液、Xa因子溶液、发色底物S-2765溶液，在血凝仪内进行反应，反应结束后，自动测定吸光度；
（4）计算（计算方法，公式）
根据供试品溶液的吸光度在标准曲线上求出浓度对数，根据浓度对数计算出其稀释后的浓度，根据稀释倍数计算出其原始浓度，即浓度以效价计。
如上述的一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述的标准曲线，线性相关系数R2值大于或等于0.95。
如上述的一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中所述的测定吸光度时光波长为405nm。
如上述的一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述的血凝仪内反应在37度温育区。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本说明书所阐述的抗Xa的测定方法，利用血凝仪代替人工进行测定，从而减少了人为操作误差特别是人为多次稀释试剂造成的实验误差，提高了实验准确性；还使实验由半微量法反应变成了微量反应，从而节省了大量昂贵的试剂，降低了实验成本；数据计算方法由4×4生物统计法变为直线方程法，处理数据更加直观方便，并且所需实验数据更少即可得到准确结果。相比原方法具有成本低、速度快、准确度高的优点。
附图说明
图1是标准品在405nm光波下的吸光度和标准品浓度对数的标准曲线图（稀释比例0.8）；
图2是浓度为0.2IU/ml样品在405nm光波下的吸光度和浓度为0.2IU/ml样品浓度对数的标准曲线图（稀释比例0.8）；
图3是浓度为0.15IU/ml样品在405nm光波下的吸光度和浓度为0.15IU/ml样品浓度对数的标准曲线图（稀释比例0.5）。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
所用试剂批号及仪器型号如下：
血凝仪的型号：SYSMEXCA530；
三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和乙二胺四醋酸二钠均为分析纯试剂；
发色底物S-2765：chromogenix公司批号NO11434542017-11；
抗凝血酶（ATIII）：Antithrombin10IU，批号NO2548372017-08；
Xa因子（FXa）：FactorXa71NKAT，批号NO2546812017-08；
LMWH（低分子量肝素）标准品：欧洲药典标准品EP,code:H0185000。
实施例1
（1）标准系列溶液的配置
1.1三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液（PH7.4）
取三羟甲基氨基甲烷6.08g和氯化钠8.77g，加水500ml使溶解，加牛血清白蛋白10g，用盐酸调节PH值至7.4，加水稀释至1000ml。
1.2三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四醋酸二钠缓冲液（PH8.4）
取氯化钠5.12g、三羟甲基氨基甲烷3.03g和乙二胺四醋酸二钠1.4g，加水250ml使溶解，用盐酸调节PH值至8.4，加水稀释至500ml。
1.3抗凝血酶（ATIII）溶液
以水制成每1ml中含1IU的溶液。
1.4发色底物S-2765（或其他FXa特异性发色底物）溶液
用水制成0.003mol/L的溶液，临用前用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四醋酸二钠缓冲液（PH8.4）稀释至0.0005mol/L。
1.5Xa因子（FXa）溶液
单支加入10ml注射水溶解。
1.6LMWH（低分子量肝素）标准品溶液的配制（标准品：1281IU/支）
用水将标准品（S）稀释成12.81IU/ml，试验时取1ml，用三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液（PH7.4）稀释成1.281IU/ml贮备液。第一个试验浓度：精密量取1.0ml标准品贮备液，加入13.233ml三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液（PH7.4），即浓度为0.09IU/ml。
（2）绘制标准曲线
取测试管（此试管为血凝仪凝血测定专用试管，外购）5支，第一支管中加入标准品20ul，37℃平衡30s后，加入抗凝血酶溶液20ul，混匀，37℃平衡60s，加入FXa溶液60ul，37℃平衡120s，加入发色底物（S-2765）100ul，反应结束后，在405nm处读吸光度。按照预设的稀释比例（FXa加入量为60ul，稀释比例为0.8），依次完成第二个至第四个浓度的检测，绘制单对数直线（四个点的浓度依次为：0.15IU/ml，0.12IU/ml，0.09IU/ml，0.06IU/ml）。实验数据如下：
以此数据绘制单对数曲线，如图1，标准曲线回归方程为：y=-1.0142x-0.6228，线性相关系数R2=0.9998（x为浓度、y为吸光度）。
（3）样品的处理及检测
3.1样品溶液的配制
精密量取预估浓度为10000IU/ml的低分子量肝素钠注射液1.0ml，注入100ml容量瓶中，用注射用水定容至刻度，即浓度为100IU/ml的贮备液①；在贮备液①精密量取1.0ml，注入100ml容量瓶中，用注射用水定容至刻度，即浓度为1.0IU/ml贮备液②；
精密量取1.0ml贮备液②，加入5.667ml三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液（PH7.4），即浓度为0.15IU/ml。
精密量取2.0ml贮备液②，加入8.0ml三羟甲基氨基甲烷-氯化钠缓冲液（PH7.4），即浓度为0.2IU/ml。
3.2样品检测
估计供试品效价，将其配制浓度为0.15IU/ml的供试品溶液，按照标准品的方法，自动稀释至0.09IU/ml，检测吸光度，即其吸光度：0.438。
（4）计算
根据供试品溶液的吸光度在标准曲线上求出其效价。
将样品的吸光度Y=0.438带入步骤（2）中的标准曲线回归方程，得到其浓度对数X=-1.018。经计算X的反对数得到这个点的浓度为0.095IU/ml，即效价为：10000×0.095/0.09=10555IU/ml。
实施例2
试验中标准品浓度和其他试剂的浓度可以改变，只要几个点的吸光度和浓度的对数呈线性相关即可。使用第一个浓度为0.2IU/ml样品绘制标准曲线（FXa加入量为60ul稀释比例为0.8）。
实验数据如下：
以此数据绘制单对数曲线，如图2，标准曲线回归方程为：y=-0.9717x-0.5464，线性相关系数R2=0.9998（x为浓度对数、y为吸光度）。
将0.2IU/ml的样品作为待测样品，反应后检测吸光度，利用浓度对数-吸光度标准曲线，计算实际浓度。同一浓度（0.2IU/ml）做三次平行试验，其结果如下：
| 吸光度 | 0.134 | 0.132 | 0.135 |
得到的吸光度差异不大，均在可接受范围之内。经计算X的反对数得到这个点的浓度为0.1996IU/ml，即效价为：10000×0.1996/0.2=9979IU/ml。
实施例3
待测样品为肝素钠的效价测定：取待测样品估计效价后按照实施例1的低分子量肝素钠测定方法稀释和检测，只要吸光度在线性范围内即可用得到的线性方程计算效价。如由实施例1和实施例2的稀释比例0.8倍变成0.5倍，可得到结果如下：
以此数据绘制单对数曲线，如图3，标准曲线回归方程为：y=-0.7236x-0.3544，线性相关系数R2=0.9822（x为浓度对数、y为吸光度）。
即将稀释比例加大可使标准曲线涵盖的范围更大，进一步节省试剂。
实施例4
用实施例1的检测方法，检测系列样品，检测数据如下：
实施例4所得结果可知：该方法测定结果与样品标称效价偏差不大，即该方法可以较准确地测定肝素和低分子量肝素的效价。
上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域中普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）标准系列溶液的配置
准确配制标准品溶液、ATⅢ溶液、Xa因子溶液、发色底物S-2765溶液；
（2）绘制标准曲线
利用血凝仪自动配制标准品溶液进行稀释，得到4个梯度浓度的标准品溶液，依次加入ATⅢ溶液、Xa因子溶液、发色底物S-2765溶液，在血凝仪内进行反应，反应结束后，自动在测定吸光度；然后以标准品溶液稀释浓度的对数值为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性方程，Y=kX+b，计算相关系数R2；
（3）样品的处理及检测
配制一定浓度的供试品溶液，溶液浓度预估在标准品稀释浓度范围之内，然后依次加入ATⅢ溶液、Xa因子溶液、发色底物S-2765溶液，在血凝仪内进行反应，反应结束后，自动测定吸光度；
（4）计算
根据供试品溶液的吸光度在标准曲线上求出浓度对数，根据浓度对数计算出其稀释后的浓度，根据稀释倍数计算出其原始浓度，即浓度以效价计。
2.如权利要求1所述的一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（4）中所述的标准曲线，线性相关系数R2值大于或等于0.95。
3.如权利要求1所述的一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中所述的测定吸光度时，光波长为405nm。
4.如权利要求1所述的一种用血凝仪测定肝素（盐）或者低分子量肝素（盐）抗Xa效价的检测方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中所述的血凝仪内反应在37度温育区。
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