CN111337385A - 一种含肝素血样检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含肝素血样检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括试剂1、试剂2、普通杯和肝素酶杯。其中试剂1中含有高岭土、氯化钠和纯化水；试剂2中含氯化钙、氯化钠和纯化水；肝素酶杯包被有肝素酶和冻干保护剂；普通杯为空的测试杯。本发明充分考虑诊断试剂对含肝素类药物血液的不同反应性，对目前临床上常用的肝素类药物，包括普通肝素、达肝素、依诺肝素、那曲肝素、帕肝素、亭扎肝素等均有较好的灵敏度。本发明含肝素血样检测试剂盒用于含肝素血液检验，其检验结果准确性好，批内和批间精密度高。
Description
技术领域
本发明涉及凝血检测领域，特别涉及一种含肝素血样检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
血栓弹力图（TEG）是一种对血小板聚集、凝血、纤溶等整个过程实施实时、动态、连续监测的凝血功能分析仪，对病人凝血状况做出定性或定量分析。
血栓弹力图仪于1948年由德国人Harter发明，应用于指导临床术中输血，目前已成为检测凝血功能最重要的手段之一。血栓弹力图检测血液凝血功能的原理是将传感器探头浸入血液标本中，血液标本与传感器探头间存在粘滞力，该粘滞力随着血小板聚集、凝血、纤溶等变化而改变，传感器的悬垂丝在这种粘滞力的作用下发生扭转形变，这种扭转形变被检测单元检测到并转化为电信号反馈给控制系统，控制系统接收到变化的信号后进行运算，并将运算结果以曲线图形和实时数据的形式显示在计算机屏幕上。
血栓弹力图（TEG）使用经抗凝处理的全血，从内外源性凝血途径激活凝血、纤溶系统系统，从而更全面、更真实地反映人体凝血因子、血小板、纤维蛋白及纤维蛋白溶解的整个过程。
肝素是一种糖胺聚糖类药物，具有强抗凝作用，是目前应用最广泛一类的抗凝血药物，广泛应用于栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等。目前血栓弹力图（TEG）在检测含肝素血样时有时会缺乏足够的灵敏度，即对普通肝素、某些低分子肝素等能够很好地检测，但对达肝素等检出能力较差。
发明内容
鉴于此，本发明针对目前市场上含肝素血样检测试剂盒对达肝素等部分抗凝药物检出灵敏度较差的现状，提供一种既能对普通肝素、某些低分子肝素等检测有较好的灵敏度，同时对达肝素等也有较好的灵敏度的试剂盒。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种含肝素血样检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括试剂1、试剂2、普通杯和肝素酶杯；试剂1中含有高岭土、氯化钠和纯化水；试剂2中含氯化钙、氯化钠和纯化水；肝素酶杯包被有肝素酶和冻干保护剂；普通杯为空的测试杯。
作为本发明一个实施例的一种一般优选方案，肝素酶杯包括如下组分：肝素酶0.1~10U，牛血清白蛋白0.1~5.0%，海藻糖0.1~5.0%，余量为生理盐水；
作为本发明一个实施例的一种较优选方案，肝素酶杯包括如下组分：肝素酶0.5~5.0U，牛血清白蛋白0.1~3.0%，海藻糖0.1~3.0%，余量为生理盐水；
作为本发明一个实施例的一种更优选方案，肝素酶杯包括如下组分：肝素酶1.0~4.0U，牛血清白蛋白0.5~2.5%，海藻糖0.5~2.5%，余量为生理盐水；
作为本发明一个实施例的一种最优选方案，肝素酶杯包括如下组分：肝素酶3.0U，牛血清白蛋白1.0 %，海藻糖1.0 %，余量为生理盐水；
以上各组分中，肝素酶为活性单位，牛血清白蛋白和海藻糖为质量体积浓度。
本发明另一方面提供上述凝血激活试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1）配制生理盐水：按配方量称取氯化钠，溶于水；
2）配制肝素酶冻干保护剂：按配方量称取牛血清白蛋白和海藻糖，加入步骤1）制得的生理盐水，充分溶解；
3）配制肝素酶母液：按配方量量取肝素酶加到步骤2）制得的冻干保护剂溶液中，混合均匀；
4）将步骤3）所得的肝素酶母液分装到肝素酶空杯中；
5）优选地，步骤1）中所述水为蒸馏水或纯化水；
6）更优选地，步骤1）中所述水为纯化水；
7）优选地，步骤4）中所述肝素酶母液分装到每个肝素酶杯中的量为20~60微升；
8）更优选地，步骤4）中所述肝素酶母液分装到每个肝素酶杯中的量为40微升；
9）步骤8）所述的肝素酶杯采用真空冷冻干燥的方式得到冻干品。
本发明第三方面提供上述含肝素血样检测试剂盒在全血检测中的用途。
本发明第四方面提供上述含肝素血样检测试剂盒在血栓弹力图（TEG）技术中用于抗凝全血检测。
如上所述，本发明的含肝素血样检测试剂盒，具有以下优点：本发明充分考虑诊断试剂对含肝素类药物血液的不同反应性，对目前临床上常用的肝素类药物，包括普通肝素、达肝素、依诺肝素、那曲肝素、帕肝素、亭扎肝素等均有较好的灵敏度。
附图说明
本发明无附图。
具体实施方法
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。本领域技术人员可在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。
血栓弹力图（TEG）检测特征量说明如下：
血凝时间R：凝血酶等凝血因子被充分激活，纤维蛋白凝血块形成开始，到血栓弹力图仪描计振幅达到2mm所需时间。R值延长，说明某些凝血因子缺乏；R值缩短，说明血液呈高凝状态。
血块成形时间K：从R值时间终点开始到血栓弹力图仪描计振幅达到20mm所需时间，反映纤维蛋白和血小板在凝血开始形成时的相互作用。K值的长短反映纤维蛋白原水平的高低。
血凝速率Angle：血栓弹力图仪描计振幅曲线弧度最大点的切线与水平线的夹角，反映血凝块形成的速率。当血液处于重度低凝状态时，描计振幅达不到20mm，此时K值无法确定。
血块强度MA：血栓弹力图仪最大描计振幅，是纤维蛋白和血小板GPⅡb/Ⅲa受体结合，表现纤维蛋白/血小板凝块的最大强度。
R1-R2<1.0min，普通杯和肝素酶杯的血凝时间相近，说明血液中无残存肝素或肝素低于检出限。
R1-R2≥1.0min，普通杯和肝素酶杯的血凝时间差别明显，说明血液内含有肝素可能性较大，存在抗凝效应。
本发明所述含肝素血样检测试剂盒直接检测经过枸橼酸、柠檬酸或EDTA等处理的抗凝全血，采集的抗凝全血室温放置不得超过24小时，最好在2小时内使用。
肝素酶杯制备：
牛血清白蛋生产厂家是BioRuler；
海藻糖生产厂家是上海源叶生物科技有限公司；
肝素酶生产厂家是IBEX Pharmaceuticals Inc；
称取配方规定量的氯化钠加到容量瓶中，加入纯化水，翻摇溶解，纯化水定容，得到生理盐水；
称取配方规定量的牛血清白蛋白和海藻糖加入到容量瓶中，再加入配制好的生理盐水，充分溶解，得到冻干保护剂溶液。
量取配方规定量的肝素酶加到上述冻干保护剂溶液中，用生理盐水定容。
肝素酶杯配方优化试验：
用牛血清白蛋白和海藻糖做冻干保护剂，肝素酶活性保持的效果最为理想。经初步预实验后，将各原材料用量暂定为：肝素酶选择5.0 U/杯、4.0 U/杯和3.0 U/杯三个水平；海藻糖选择0.5%、1.0%和1.5%三个水平；牛血清白蛋白选择0.5%、1.0%和1.5%三个水平。
采用L9（34）正交表进行正交试验设计，肝素酶为因素1，占据正交表的第一列，0.30U为水平①、0.25U为水平②、0.20U为③；海藻糖为因素2，占据正交表的第二列，0.5%为水平①、1.0%为水平②、1.5%为水平③；牛血清白蛋白为因素3，占据正交表的第三列，0.5%为水平①、1.0%为水平②、1.5%为水平③；第四列为误差列。各试验水平、因素组合如下表1所示：
表1 肝素酶杯配方优化试验设计方案
参比试剂为某进口试剂，每个样本分别用本发明试剂和参比试剂平行做三次，检测结果如下表2所示
表2 肝素酶杯配方优化试验结果
注：
从表1中各数据可以看出，编号4试验组中R、K、Angle和MA与参比试剂测量结果的相对偏差最小，所以本发明试剂中肝素酶用量优选0.20U/杯、海藻糖用量优选1.5%、牛血清白蛋白用量优选1.5%。
上述含肝素血样检测试剂盒用于全血检测的方法如下：
1）打开应用软件，在患者信息界面输入患者姓名，选择测试类型，普通杯“CK-Citratedkaolin”，肝素酶杯“CKH-Citrated kaolin with heparinase”；
2）在血栓弹力图仪通道上装载普通杯和肝素酶杯；注意和测试类型对应！
3）用lml移液器从枸橼酸钠抗凝全血样本中移取1ml到试剂1瓶中，上下颠倒试剂1瓶5次充分混匀，静置4分钟激活血液；
4）分别移取20μl试剂2到普通杯、肝素酶杯杯底；
5）分别移取步骤3）中激活血液340μl加到普通杯、肝素酶杯中；
6）捏紧杯托，将普通杯、肝素酶杯推至顶端，测试杆拨至“测试”位；
7）点击软件界面“开始”或键盘F10；
8）凝血过程约30分钟结束；
9）测试完成后，在软件界面点击“停止”，卸去测试杯，按实验室管理规定处置；
10）如需获取普通杯和肝素酶杯间的直观区别，选择“复合”，系统自动将两者的两弹力图曲线叠加；
11）检测完毕，关闭仪器电源开关。
检验结果如下表3、4、5、6、7和8所示：
表3 正常人全血样本检测结果
表4 注射肝素类药物患者全血样本检测结果
表3对随机5例正常人血液样本检测结果（R1-R2）值均小于60s，表4对随机5例注射肝素类药物患者的检测结果（R1-R2）皆大于60s，本发明试剂盒检测结果和患者实际情况相一致。
表5 批内精密度（无肝素质控血浆）
表6 批内精密度（肝素钠终浓度20μg/ml质控血浆）
从表5和表6可以看出，肝素酶杯对无肝素质控血浆和含肝素钠质控血浆批内精密度检测结果的变异系数均小于10%，批内精密度较高。
表7 批间精密度（无肝素质控血浆）
表8 批间精密度（肝素钠终浓度20μg/ml质控血浆）
从表7和表8结果可知，各特征量批间精密度的检测结果相对偏差均小于10%，批间精密度较高。
Claims (7)
1.一种含肝素血样检测试剂盒，该试剂盒包括试剂1、试剂2、普通杯和肝素酶
杯。
2.根据权利要求1所述的含肝素血样检测试剂盒，其特征在于其试剂1中含有高岭土、氯化钠和纯化水。
3.根据权利要求1所述的含肝素血样检测试剂盒，其特征在于其试剂2中含氯化钙、氯化钠和纯化水。
4.根据权利要求1所述的含肝素血样检测试剂盒，其特征在于其肝素酶杯组分
为：肝素酶0.5~5.0 U，牛血清白蛋白0.1~3.0%，海藻糖0.1~3.0%，余量为生理盐水。
5.根据权利要求4所述的含肝素血样检测试剂盒，其特征在于其肝素酶杯组分为：肝素酶1.0~4.0U，牛血清白蛋白0.5~2.5%，海藻糖0.5~2.5%，余量为生理盐水。
6.根据权利要求5所述的含肝素血样检测试剂盒，其特征在于其肝素酶杯组分为：肝素酶3.0U，牛血清白蛋白1.0 %，海藻糖1.0 %，余量为生理盐水。
7.如权利要求1-7任一项所述的含肝素血样检测试剂盒在血栓弹力图（TEG）技术中用于抗凝全血检测。
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