CN104049089A - 一种检测纤维蛋白原的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检测技术领域，公开了一种检测纤维蛋白原的方法及试剂盒。本发明所述检测纤维蛋白原的方法以亚硫酸钠作为沉淀剂，通过与纤维蛋白原特异性的反应形成沉淀，可以直接应用在半/自动生化分析仪上，而不用事先稀释血浆样本，操作简单，检测结果准确。实验表明，本发明所述检测纤维蛋白原的方法检测结果准确性高、灵敏度好，精密度好，线性范围宽。本发明所述试剂盒稳定性好，保存期长，方便在全自动生化分析仪上检测，适用范围广，便于推广使用，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清中纤维蛋白原浓度。

Description

一种检测纤维蛋白原的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检验测定技术领域，具体的说是涉及一种检测纤维蛋白原的方法及试剂盒。
背景技术
纤维蛋白原(FBG/FIB)即凝血因子I，是血液中含量最高的凝血因子，纤维蛋白原具有双重生物活性，既是凝血酶作用的底物又是高浓度纤溶酶的靶物质，因此纤维蛋白原在凝血系统和纤溶系统同时发挥作用，是体内重要的凝血因子。
临床研究发现血浆纤维蛋白原的水平变化与凝血障碍、出血性疾病、弥漫性血管凝血以及炎症反应有密切关系。健康成年人纤维蛋白原的含量范围约在2-4g/L，减少常见于肝损伤、结核病、烧伤等；增高常见于动脉硬化、糖尿病、肾病综合症等。同时，近年来发现纤维蛋白原是心脑血管疾病的重要危险因素之一，因此在临床上倍受重视。纤维蛋白原的检测已成为出血和血栓检查的常规检测项目，具有重要的临床诊断意义。
目前，纤维蛋白原的测定方法主要分为功能测定法、物理化学测定法和免疫测定法。功能测定法又称为凝固蛋白法，利用其特异的2种生化反应，即凝血酶的蛋白水解作用和随后的纤维蛋白单体聚集为纤维蛋白多聚体，在这些方法中，通过加入凝血酶形成纤维蛋白凝块后的检测不同，又可分为重量测定法、酚试剂法，凝血酶凝固时间法等。物理化学测定法可分为盐析法、热沉淀法和电泳法等。免疫学测定法是将纯FBG作为抗原免疫动物，制成多克隆抗体或单克隆抗体，然后用其致敏乳胶或者以被动或反向血凝、免疫比浊、单向免疫扩散及ELISA等技术测定FBG。以上方法中，从理论上分析功能法准确特异，是WHO推荐的参考方法，但因其测定的是纤维蛋白而不是纤维蛋白原，而且纤维蛋白一旦形成就会吸附一些凝血因子或纤溶因子，这会引起测定误差，此外，在获得纤维蛋白和洗涤时比较麻烦且难以做到完全彻底，还容易造成污染，即使现已有自动凝血分析仪，但是此方法的操作仍有不简便之处，前期处理过程较多。物理化学法测定应用最广，快速简单，但影响测定的因素多。免疫学方法其所针对的抗原决定簇也存在二纤维蛋白质单体、纤维蛋白原降解产物和异常纤维蛋中，因此特异性比较差。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是针对现检测纤维蛋白原的方法准确度低、特异性差等问题，提供了一种准确度高、特异性好的检测纤维蛋白原的方法及试剂盒。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测纤维蛋白原的方法，待测样品与亚硫酸盐和强碱性缓冲液混合，然后加入中性分散剂，在620-630nm波长下检测吸光度，与经上述相同处理的标准溶液比浊，计算待测样品的纤维蛋白原浓度。
作为优选，所述中性分散剂为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、纳米银溶胶、明胶或琼脂中的一种或两种以上。
作为优选，所述强碱性缓冲液为2氨基-2甲基-1丙醇缓冲液。
本发明还提供了一种检测纤维蛋白原的试剂盒，包括亚硫酸盐、强碱性缓冲液、中性分散剂。
作为优选，所述亚硫酸盐为亚硫酸钠。
作为优选，所述强碱性缓冲液为2氨基-2甲基-1丙醇缓冲液。
作为优选，所述中性分散剂为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、纳米银溶胶、明胶或琼脂中的一种或两种以上。
作为优选，还包括氯化钠。
作为优选，所述氯化钠的工作浓度为0.9％。
与现有技术相比，本发明所述检测纤维蛋白原的方法以亚硫酸钠作为沉淀剂，通过与纤维蛋白原特异性的反应形成沉淀，可以直接应用在半/自动生化分析仪上，而不用事先稀释血浆样本，操作简单，检测结果准确。实验表明，本发明所述检测纤维蛋白原的方法检测结果准确性高、灵敏度好，精密度好，线性范围宽。本发明所述试剂盒稳定性好，保存期长，方便在全自动生化分析仪上检测，适用范围广，便于推广使用，可广泛应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清中纤维蛋白原浓度。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种检测纤维蛋白原的方法及试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测纤维蛋白原的方法待测样品与亚硫酸盐和强碱性缓冲液混合，然后加入中性分散剂，在620-630nm波长下检测吸光度，与经上述相同处理的标准溶液比浊，计算待测样品的纤维蛋白原浓度。
本发明所述检测纤维蛋白原的方法，以亚硫酸盐作为沉淀剂，通过与待测样品中的纤维蛋白原与亚硫酸盐发生反应形成沉淀，反应产生的悬浊液吸光度与纤维蛋白原的浓度呈正比，然后通过与标准溶液比浊检测待测样品中的纤维蛋白原的浓度。由于纤维蛋白原与亚硫酸盐发应具有特异性，因此本发明所述检测纤维蛋白原的方法可以直接应用在半/自动生化分析仪上，而不用事先稀释血浆样本，操作简单，检测结果准确。
其中，待测样品中纤维蛋白原的浓度按如下公式计算：
纤维蛋白原浓度(g/L)＝标准液浓度×待测样品吸光度/标准液吸光度。
本发明所述检测纤维蛋白原的方法在检测时还加入中性分散剂，所述中性分散剂能够促使反应生成的沉淀颗粒均匀分散于溶液中，防止产生大颗粒沉淀。
作为优选，所述中性分散剂为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、纳米银溶胶、明胶或琼脂中的一种或两种以上。
其中，所述聚乙二醇优选为聚乙二醇400、聚乙二醇600或聚乙二醇6000；所述聚乙烯吡咯烷酮优选为聚乙烯吡咯烷酮50、聚乙烯吡咯烷酮70或聚乙烯吡咯烷酮90。
更优选的，所述中性分散剂为聚乙二醇。聚乙二醇除了能够促使反应生成的沉淀颗粒均匀分散于溶液中外还具有协同沉淀的作用，因此使检测结果更加准确。
作为优选，本发明所述检测纤维蛋白原的方法中，所述强碱性缓冲液为2氨基-2甲基-1丙醇(AMP)缓冲液。
作为优选，本发明所述检测纤维蛋白原的方法中，所述强碱性缓冲液的pH值为10.0-12.0，更优选为11.0。
进一步的，作为优选，所述缓冲液的浓度为40mmol/L-200mmol/L。
为了保证待测样品中纤维蛋白原充分反应，本发明所述检测纤维蛋白原的方法中所述亚硫酸盐、中性分散剂均过量或适量。
本发明还提供了一种检测纤维蛋白原的试剂盒包括亚硫酸盐、强碱性缓冲液、中性分散剂。
其中，作为优选，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒中，所述亚硫酸盐为亚硫酸钠。其中，所述亚硫酸钠浓度优选为400mmol/L-800mmol/L。
作为优选，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒中，所述强碱性缓冲液为2氨基-2甲基-1丙醇(AMP)缓冲液。
作为优选，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒中，所述强碱性缓冲液的pH值为10.0-12.0，更优选为11.0。
进一步的，作为优选，所述缓冲液的浓度为40mmol/L-200mmol/L。
作为优选，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒中，作为优选，所述中性分散剂为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、纳米银溶胶、明胶或琼脂中的一种或两种以上。
其中，所述聚乙二醇优选为聚乙二醇400、聚乙二醇600或聚乙二醇6000；所述聚乙烯吡咯烷酮优选为聚乙烯吡咯烷酮50、聚乙烯吡咯烷酮70或聚乙烯吡咯烷酮90。
在一些实施例中，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒中，所述中性分散剂为聚乙二醇。所述聚乙二醇的浓度优选为2g/L-5g/L。
在一些实施例中，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒中，所述中性分散剂为聚乙烯吡咯烷酮。所述聚乙烯吡咯烷酮的浓度优选为0.8g/L-2.0g/L。
在一些实施例中，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒中，所述中性分散剂为聚乙烯醇。所述聚乙烯醇的浓度优选为0.3g/L-0.6g/L。
在一些实施例中，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒中，所述中性分散剂为纳米银溶胶。所述纳米银溶胶的浓度优选为0.5ml/L-2ml/L。
在一些实施例中，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒中，所述中性分散剂为明胶。所述明胶的浓度优选为0.2g/L-0.4g/L。
在一些实施例中，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒中，所述中性分散剂为琼脂。所述琼脂的浓度优选为0.2g/L-0.4g/L。
进一步的，本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒还包括氯化钠，以增加离子强度，使试剂盒保持与人体相同的生理盐水浓度，从而促进反应的进行。
作为优选，所述氯化钠的工作浓度为0.9％。
本发明提供的检测纤维蛋白原的试剂盒可以为单一试剂。如，将亚硫酸盐、强碱性缓冲液、中性分散剂制成单一试剂。
本发明提供的检测纤维蛋白原的试剂盒也可以为多试剂。如，将中性分散剂和强碱性缓冲液制成第一试剂，将亚硫酸盐和氯化钠制成第二试剂，在检测时，将第一试剂与第二试剂混合，从而检测待测样品中的纤维蛋白原。
其中，作为优选，在检测时，所述待测样品与第一试剂的体积比为1:15。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：本发明所述检测纤维蛋白原的方法
将AMP缓冲液与中性分散剂组成混合液(AMP浓度为80mmol/L，中性分散剂为1ml/L的钠米银胶体，pH11.0)，在浓度为9g/L的氯化钠和600mmol/L的亚硫酸钠溶液中，待测样品与混合液按体积比，待测样品：混合液＝1:15的比例混合，得到的悬浊液在630nm波长下检测吸光度A样，然后与经上述相同处理的标准溶液的吸光度A标比浊，计算待测样品的纤维蛋白原浓度，公式为样品FBG浓度(g/L)＝标准溶液浓度×A样/A标。
实施例2：本发明所述检测纤维蛋白原的方法
将AMP缓冲液与中性分散剂组成混合液(AMP浓度为60mmol/L，中性分散剂为3g/L的PEG6000和0.5ml/L的钠米银胶体，pH11.0)，在浓度为9g/L的氯化钠和600mmol/L的亚硫酸钠溶液中，待测样品与混合液按体积比，待测样品：混合液＝1:15的比例混合，得到的悬浊液在630nm波长下检测吸光度A样，然后与经上述相同处理的标准溶液的吸光度A标比浊，计算待测样品的纤维蛋白原浓度，公式为样品FBG浓度(g/L)＝标准溶液浓度×A样/A标。
实施例3：本发明所述检测纤维蛋白原的方法
将AMP缓冲液与中性分散剂组成混合液(AMP浓度为60mmol/L，中性分散剂为3g/L的PEG6000、0.3g/L的聚乙烯醇和1ml/L的钠米银胶体，pH11.0)，在浓度为9g/L的氯化钠和800mmol/L的亚硫酸钠溶液中，待测样品与混合液按体积比，待测样品：混合液＝1:15的比例混合，得到的悬浊液在630nm波长下检测吸光度A样，然后与经上述相同处理的标准溶液的吸光度A标比浊，计算待测样品的纤维蛋白原浓度，公式为样品FBG浓度(g/L)＝标准溶液浓度×A样/A标。
实施例4：本发明所述方法的准确度分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；
检测样品：20名体检者血样；
对比方法试剂盒：市售进口FIB试剂盒(免疫比浊法)；
采用实施例1至实施例3的检测方法分别待测20例样品，其中，实施例1检测方法的检测结果见表1。
表1分析结果(g/L)
结果显示，根据检测结果计算出的R2值为0.982，实施例2、3检测方法的R2值同样大于0.95，表明本发明所述方法检测结果与市售进口试剂盒检测结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)。
实施例5：本发明所述方法的精密度分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；
检测样品：任意一血浆样品；
采用实施例1至实施例3的检测方法分别对同一待测样品重复检测10次，其中，实施例1检测方法的检测结果见表2。
表2检测样品FBG浓度(10次)及标准差率(变异系数)
结果显示，标准差率为2.16％，小于标准的5％，实施例2、3检测方法的检测结果的标准差率同样小于5％，表明本发明所述方法具有高精密度。
实施例6：本发明所述方法的线性分析
试验仪器：日立7080全自动生化分析仪；
检测样品：高FBG血浆样品(8g/L)；
将FBG血清样品稀释成5个不同的浓度，依次为1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L，采用实施例1至实施例3的检测方法对上述样品的每个浓度进行2次检测，计算相关系数R值，其中，实施例1检测方法的检测结果见表3。
表3线性试验结果
结果显示，根据实施例1检测结果计算出的R值为0.999，接近于1，实施例2、3检测方法的R值同样大于0.99，表明本发明所述方法在1-8g/L的范围内具有良好的线性度。
实施例7：本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒
试剂1：80mmol/L的AMP缓冲液和9g/L的氯化钠；
试剂2：3g/L的聚乙二醇400、1ml/L纳米银溶胶和600mmol/L的亚硫酸钠。
实施例8：本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒
单试剂：60mmol/L的AMP缓冲液、9g/L的氯化钠、2g/L的聚乙二醇6000、1ml/L纳米银溶胶和700mmol/L的亚硫酸钠。
实施例9：本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒
试剂1：80mmol/L的AMP缓冲液、9g/L的氯化钠；
试剂2：3g/L的聚乙二醇400、0.3g/L的聚乙烯醇、1ml/L纳米银溶胶和800mmol/L的亚硫酸钠。
实施例10：本发明所述检测纤维蛋白原的试剂盒
试剂1：100mmol/L的AMP缓冲液、9g/L的氯化钠、0.25g/L明胶溶液；
试剂2：3g/L的聚乙二醇6000、0.3g/L的聚乙烯醇、0.8ml/L纳米银溶胶和800mmol/L的亚硫酸钠。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测纤维蛋白原的方法，其特征在于，待测样品与亚硫酸盐和强碱性缓冲液混合，然后加入中性分散剂，在620-630nm波长下检测吸光度，与经上述相同处理的标准溶液比浊，计算待测样品的纤维蛋白原浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性分散剂为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、纳米银溶胶、明胶或琼脂中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述强碱性缓冲液为2氨基-2甲基-1丙醇缓冲液。
4.一种检测纤维蛋白原的试剂盒，其特征在于，包括亚硫酸盐、强碱性缓冲液、中性分散剂。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述亚硫酸盐为亚硫酸钠。
6.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述强碱性缓冲液为2氨基-2甲基-1丙醇(AMP)缓冲液。
7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述中性分散剂为聚乙二醇(400、600和6000)、聚乙烯吡咯烷酮(50、70和90)、聚乙烯醇、纳米银溶胶、明胶或琼脂中的一种或两种以上。
8.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，还包括氯化钠。
9.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述氯化钠的工作浓度为0.9％。
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