CN101819202B

CN101819202B - D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)

Info

Publication number: CN101819202B
Application number: CN 201010167882
Authority: CN
Inventors: 谢永华; 朱美萍; 许付
Original assignee: SHANGHAI SUN BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI SUN BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2010-05-06
Filing date: 2010-05-06
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2030-05-06
Also published as: CN101819202A

Abstract

本发明涉及一种胶乳免疫比浊法测定D-二聚体含量的试剂盒。它是由D-二聚体R₁试剂、D-二聚体R₂试剂、D-二聚体稀释液和D-二聚体校准品组成；所述D-二聚体R₁试剂包括缓冲液、稳定剂①、促凝剂和防腐剂；所述D-二聚体R₂试剂包括含鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳增强颗粒、缓冲液、稳定剂②和防腐剂；所述D-二聚体稀释液包括缓冲液和防腐剂；所述D-二聚体校准品是由纤维蛋白降解产物D-二聚体、缓冲液、稳定剂③、赋形剂和防腐剂组成的溶液经分装冻干而成。本发明试剂盒的优点在于操作简单、快速、定量准确、敏感度高、特异性强、检测成本低、仪器兼容性强，适合在各大中小型医院推广使用。

Description

D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)

技术领域

本发明涉及一种测定样本中D-二聚体(D-Dimer)含量的试剂盒，具体涉及一种胶乳免疫比浊法测定D-二聚体(D-Dimer)含量的试剂盒，属于医学免疫体外诊断领域。

背景技术

纤维蛋白溶解系统(fibrinolysis system)是人体最重要的抗凝系统，它对保持血管壁的正常通透性，维持血液的流动状态和组织修复起着重要作用，该系统由4种主要部分组成：纤溶酶原(plasminogen)、纤溶酶原激活剂(plasminogen activator，如t-PA、u-PA)、纤溶酶(plasmin)、纤溶酶抑制物(plasmin inhibitor，如PAI-1、PAI-2、α2-AP)。当纤维蛋白凝结块(fibrin clot)形成时，在t-PA的存在下，纤溶酶原激活转化为纤溶酶，纤维蛋白溶解过程开始，纤溶酶降解纤维蛋白原和交联纤维蛋白形成各种可溶片段，统称纤维蛋白(原)降解产物(FDP)。其中，D-二聚体则是降解产物中最小片段，是交联纤维蛋白的特异性降解产物。

在生理状态下，人体正常D-二聚体的水平一般在200μg/L以下，机体内保持着凝血与纤溶动态平衡，以保证纤维蛋白及时形成和及时清除。若这一平衡遭到破坏，血管内凝血倾向增强，纤维蛋白聚集，纤维蛋白降解产物增加，D-二聚体含量增加。因此，D-二聚体水平的升高反映体内凝血和纤溶系统的双重激活，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。其反映出的特异性并不是指在某一特定的具体疾病中的表现，而是针对有凝血和纤溶过程的这一大类疾病的共同病理特点，因此D-二聚体检测临床应用十分广泛。D-二聚体含量升高可检测多种疾病的病程，如深静脉血栓(DVT)、弥漫性血管内凝血(DIC)、心肌梗死、重症肝炎、肺栓塞(PE)等疾病；对先兆子痫和妊高危征产妇可能发生的并发症有一定的监测作用。另外，D-二聚体水平的变化可作为监测溶栓治疗，指导溶栓药物用量的指标。由此可见，血液中D-二聚体含量检测对血栓性疾病的早期诊断、病程监测及对溶栓药物的治疗监测等方面具有重要的临床意义。

近几年来，已建立了多种有价值的D-二聚体检测方法，主要包括：乳胶凝集法、酶联免疫吸附(ELISA)法、荧光抗体检测法、免疫金标法和胶乳免疫比浊法等。

乳胶凝集法操作简便、快速，适用于急诊检测，但其只能用于定性或半定量测定，常作为筛查用；酶联免疫吸附(ELISA)法精确、定量，有很高的敏感性，但操作要求严格且费时，不适用于急诊和临床病人及时诊断及治疗的需要；荧光抗体检测法是在ELISA基础上与荧光检测相结合，敏感性高，与ELISA法有很好的一致性，但是仪器价格昂贵，难以在中小医院推广；免疫金标法具有乳胶凝集法的操作简单、快速，又具有ELISA法准确、定量的特点，但类风湿因子、肝素及血脂等对其测定有一定的干扰；胶乳免疫比浊法具有操作简便、快速、定量准确、敏感度高、特异等优点，可满足门急诊等需要，在临床研究中应用越来越广泛。但现有市售用此法制备的商品化D-二聚体测定试剂盒总体灵敏度不高、开瓶后稳定性欠佳；而进口试剂盒价格昂贵，检测成本较高，从而限制了该检测项目的常规开展。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种定量检测D-二聚体含量，且操作简单、快速、准确、敏感度高、特异性强、检测成本低，适用于门急诊检测且仪器适用面广的D-二聚体测定试剂盒。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：一种胶乳免疫比浊法测定D-二聚体含量的试剂盒，其特征在于，包括D-二聚体R₁试剂、D-二聚体R₂试剂、D-二聚体稀释液和D-二聚体校准品；

所述D-二聚体R₁试剂包括缓冲液、稳定剂①、促凝剂和防腐剂；

所述D-二聚体R₂试剂包括鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂②和防腐剂；

所述D-二聚体稀释液包括缓冲液和防腐剂；

所述D-二聚体校准品是由纤维蛋白降解产物D-二聚体、缓冲液、稳定剂③、赋形剂和防腐剂组成的溶液经分装冻干而成。

所述的稳定剂①选自无机盐；

所述的稳定剂②选自蛋白质、无机盐、金属络合剂、表面活性剂、助悬剂和抗氧剂中的一种或两种以上；

所述的稳定剂③选自蛋白质和无机盐。

所述的蛋白质选自牛血清白蛋白或明胶；

所述的无机盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾中的一种；

所述的金属络合剂选自甘氨酸、丝氨酸、精氨酸和乙二胺四乙酸(EDTA)中的一种或两种以上；

所述的表面活性剂选自吐温20、吐温40、司盘40和司盘60中的一种或两种以上；

所述的助悬剂选自乙二醇、丙三醇、乳糖和麦芽糖中的一种或两种以上；

所述的抗氧剂选自2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)、叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、棓酸丙酯(PG)中的一种或两种以上；

所述缓冲液选自3-[N，N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠(DIPSO-NaOH)缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸-氢氧化钠(HEPPS-NaOH)缓冲液、N-2-羟乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸-氢氧化钠(HEPES-NaOH)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、甘氨酸缓冲液和巴比妥缓冲液中的一种或两种以上；

所述的促凝剂选自聚乙二醇6000(PEG6000)或聚乙二醇8000(PEG8000)；

所述的防腐剂选自叠氮钠、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)、硫柳汞、苯酚和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或两种以上；

所述的赋形剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖和麦芽糖中的一种或两种以上。

所述D-二聚体R₁试剂中包括缓冲液，要求该缓冲液的缓冲能力为调节pH范围在7.0～9.0之间，可以选择上述一种缓冲液，优选DIPSO-NaOH、HEPPS-NaOH、HEPES-NaOH等双性离子缓冲液，与其它缓冲液相比，其具有缓冲能力强、溶解度高、很好的生物适应性和反应惰性，且pH随温度和稀释度的改变而改变很小的优点。其中DIPSO-NaOH缓冲液，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，因此更优选DIPSO-NaOH缓冲液，其浓度范围为10～70mmol/L，用氢氧化钠调节后pH值的范围为7.0～8.0。促凝剂选择PEG-8000，可以加快免疫反应速度，缩短检测时间，其终浓度为2～6％。再选择添加适当浓度的无机盐和防腐剂，如氯化钠浓度0.7～0.9％，叠氮钠浓度0.1％。

所述D-二聚体R₂试剂是由鼠抗人D-二聚体单克隆抗体与羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒在磷酸盐缓冲液中通过化学交联法致敏，再经离心、洗涤后，在含有稳定剂和防腐剂的DIPSO-NaOH缓冲液中分散而成，所述DIPSO-NaOH缓冲液终浓度为20～40mmol/L，pH值范围为7.0～9.0，其致敏的抗体胶乳颗粒终浓度为1～5mg/ml。

所述羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒是一种核壳形式的胶乳，乳核是苯乙烯聚合物，乳壳是苯乙烯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸形成的共聚物。

所述乳核的粒径在100nm-150nm，所述羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为180nm-220nm，所述乳壳中苯乙烯与丙烯酸正丁酯重量比为1∶1，壳的重量为胶乳颗粒总重的10％-30％，甲基丙烯酸的重量为胶乳颗粒总重的1.0-5.0％。

所述D-二聚体R₂试剂中，用于洗涤和分散的DIPSO-NaOH缓冲液中的稳定剂及其浓度为：氯化钠浓度为0.7％～0.9％、乙二胺四乙酸浓度为5～20mmol/L、牛血清白蛋白浓度为0.1～0.5％、吐温20体积百分比浓度为0.1～0.6％、丙三醇体积百分比浓度为1～10％、BHT浓度为0.01％。

所述在磷酸盐缓冲液中的化学交联是在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)的催化下，将氨基己酸交联到羧化聚苯乙烯胶乳颗粒表面，再通过氨基己酸的羧基与抗体的氨基基团以共价键结合形成交联。

所述D-二聚体稀释液为添加防腐剂的缓冲液，pH值范围为7.0-9.0，优选磷酸盐缓冲生理盐水，pH为7.4。

所述D-二聚体校准品是将人纤维蛋白原在凝血酶和凝血因子XIII的作用下形成交联纤维蛋白块，或直接采用市售人纤维蛋白，用纤溶酶在Tris-HCl缓冲液中降解形成纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液，用DIPSO-NaOH缓冲液稀释成D-二聚体浓度为5.5～6.5μg/ml的溶液，再添加稳定剂牛血清白蛋白、赋形剂甘露醇、防腐剂叠氮钠后通过冻干制成；所述DIPSO-NaOH缓冲液的浓度30～70mmol/L，pH为7.0～9.0；BSA的终浓度为20～60mg/ml；甘露醇的终浓度为10～30mg/ml；叠氮钠的终浓度为0.1％。

采用所述试剂盒测定的反应体系液适用于血凝分析仪和生化分析仪的检测。

本发明D-二聚体R₂试剂为胶乳试剂，苯乙烯聚合物形成的胶乳微球，具有较高的折光系数和化学惰性，在其表面吸附或交联抗体或抗原后，用免疫比浊技术原理检测样本中抗原或抗体浓度，可以增加散射光或透射光的变化强度，从而提高检测灵敏度。

本发明提出了一种核壳形式的羧化改性聚苯乙烯胶乳，其乳核是苯乙烯聚合物；乳壳是苯乙烯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸共聚物。通过调节乳化剂的用量，胶乳颗粒的平均粒径控制在180nm-220nm。

通过在胶乳壳聚合过程中引入丙烯酸正丁酯，使胶乳颗粒表面形成一层疏松的表面层，能够有效地降低血浆或血清中的成分对凝集反应的干扰影响，提高分析的准确性。胶乳壳中的甲基丙烯酸，其羧酸基团分布在胶乳颗粒表面，使胶乳颗粒成为一种亲水性胶乳；羧酸基团使胶乳颗粒的表面带有一定的负电荷，能够防止胶乳颗粒的絮凝，从而可以提高胶乳颗粒的稳定性。羧化改性聚苯乙烯胶乳可以通过物理吸附或化学交联的方法将抗原或抗体结合到胶乳颗粒的表面。物理吸附的抗体在长时间放置后，抗体蛋白容易脱落，导致检测的敏感度降低，重复性较差。一般优选化学交联法，能够使结合的抗体更加稳定。在胶乳表面的羧基通过连接化学交联剂6-氨基己酸，相当于在胶乳表面连接上一个手臂，再与抗体结合时可以减轻空间构型对共价键形成的阻碍，使得抗体更易交联到胶乳颗粒上，抗体的活性更高，能够显著提高分析灵敏度。

用于分散抗体胶乳的DIPSO-NaOH缓冲液中的稳定剂根据其所起的稳定作用原理需选择多种试剂进行组合，其中下述6种优选的稳定剂的组合为最佳的组合：牛血清白蛋白(BSA)和明胶，能够对胶乳颗粒表面交联的抗体起到很好的胶体保护稳定作用，优选BSA，其终浓度为0.1～0.5％；乙二醇、丙三醇作为一种助悬剂，可以提高溶液的粘度，使胶乳颗粒能够长期悬浮在溶液中不会沉降而起到很好的稳定作用，优选丙三醇，其终浓度体积百分比为1～10％；金属络合剂能够与金属离子形成稳定的配合物，可以防止溶液中进入金属离子的干扰，常用甘氨酸、丝氨酸、精氨酸等氨基酸物质和EDTA，优选EDTA，其终浓度为5～20mmol/L；表面活性剂选择吐温20，能够吸附在胶乳颗粒的表面，降低胶乳颗粒表面张力，使胶乳颗粒不易聚集，有效地提高胶乳颗粒在溶液中稳定性，其终浓度体积百分比为0.1～0.6％；抗氧剂选择BHT，终浓度为0.01％；适当浓度的无机盐能够维持溶液的渗透压，且有利于保持溶液中蛋白质的稳定性，如氯化钠0.7～0.9％。

本发明中所述的百分比浓度如未进行特别说明，均为质量体积百分比浓度，即100ml溶液中所含溶质的克数。

样本中D-二聚体与鼠抗人D-二聚体单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体凝集反应后，产生凝集以致浊度上升，反应体系的透光率降低，其变化速率与样本中D-二聚体的浓度呈下比，采用血凝分析仪或生化分析仪测定透光率的变化率从而可以计算出样本中D-二聚体的含量。用本发明所述试剂盒在血凝分析仪或生化分析仪上测定D-二聚体校准品透光率的变化率，与D-二聚体校准品浓度建立校准曲线。取待测样本同法测定其透光率的变化率，即可在校准曲线上求得待测样本中D-二聚体的含量。

本发明与现有技术相比，具有如下特点：

(1)本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度，最低检测限可达到0.010μg/ml；操作简单、快速，从检测到出结果仅需5～10分钟；

(2)本发明试剂盒特异性更强，不易受干扰。

(3)本发明试剂盒稳定性好，+2～+8℃至少可保存18个月，各试剂开瓶后至少可以保存30天；而市售的试剂盒开瓶后一般只能保存15天，久置后准确度明显降低。

(4)本发明试剂盒与进口试剂盒对样本中D-二聚体含量检测的数据经统计分析，无显著性差异，结果一致性好，检测数据准确可靠，在临床可以替代进口产品使用，大幅降低检测成本。

附图说明

图1为本发明实施例1的校准曲线；

图2为本发明实施例1的线性范围相关性；

图3为本发明实施例1的试剂盒与进口Dade Behring公司试剂盒检测结果相关性比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1

一、检测试剂盒的制备：

1、D-二聚体R₁试剂配制：DIPSO浓度为50mmol/L，用氢氧化钠调节后pH值为7.4。再加入氯化钠、PEG-8000、叠氮钠，其终浓度分别为：氯化钠0.85％、PEG-80005％、叠氮钠0.1％。

2、D-二聚体R₂试剂配制：

(1)羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备

a.在装有搅拌器、回流冷凝管和温度计的250mL三口磨口烧瓶中加入去离子水150mL，乳化剂十二烷基硫酸钠(SDS)0.2g、壬基酚聚氧乙烯基醚(OP-10)1.0g，用氩气吹扫0.5小时。水浴加热至50～60℃，搅拌，当乳化剂完全溶解后加入20g苯乙烯核单体，使单体乳化30～40min。将溶液升温至80℃，并在此温度下搅拌平衡10min，加入10mL引发剂溶液(0.2g过硫酸钾溶于10mL去离子水)，搅拌反应5小时，得到聚苯乙烯核胶乳溶液。将反应后的聚苯乙烯核胶乳溶液冷却，形成的胶乳颗粒通过TSM超细颗粒粒径分析仪分析，平均粒径为120nm。

b.在上述得到的聚苯乙烯核胶乳溶液中补加2ml 2％过硫酸钾引发剂溶液和5ml 1％碳酸氢钠溶液，在氩气保护下加热到80℃，向溶液中缓慢滴加壳单体混合物(2.5g苯乙烯+2.5g丙烯酸正丁酯+1.0g甲基丙烯酸)，滴加完毕后在80℃搅拌反应5小时，再升温至90℃反应1小时使聚合反应完毕，得到聚苯乙烯核壳胶乳溶液。将聚苯乙烯核壳胶乳溶液冷却，得到核壳胶乳颗粒，测定粒径平均为185nm。

c.将聚苯乙烯核壳胶乳溶液通过布氏漏斗过滤，并用蒸馏水反复洗涤，至pH值为中性，再用乙醇洗涤抽干，放于50～60℃烘箱中干燥。称取1.0g聚苯乙烯胶乳颗粒干燥物，加入10ml 0.12M磷酸盐缓冲液(pH7.4)分散，配置成10％的聚苯乙烯胶乳溶液备用。

d.取0.5ml 10％聚苯乙烯胶乳溶液，加入4.5ml 0.12mol/L磷酸盐(PBS)缓冲液(pH 7.4)稀释，加入1.0ml的0.02mol/L的6-氨基己酸溶液，再加入2mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，在室温下搅拌2小时，离心倾去上清液，制成接有氨基己酸手臂的羧化聚苯乙烯胶乳，用5ml 0.12mol/L PBS缓冲液(pH 7.4)稀释分散沉淀胶乳，最终得到羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液。

(2)抗体胶乳的结合

将含有250μg鼠抗人D-二聚体单克隆抗体(购自American Diagnostica Inc.，产品货号ADI No.300，克隆号DD-3B6/22)冻干品，加入0.5ml去离子蒸馏水复溶。取100μl溶液，用5ml 0.12M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释后，加入羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液，再加入2mg EDC，在4℃搅拌反应6小时，加入0.2ml 0.1mol/L的甘氨酸缓冲液(pH 8.2)搅拌30分钟终止反应，离心弃去上清，用20ml 30mmol/L DIPSO-NaOH缓冲液洗涤1次，DIPSO-NaOH缓冲液pH为7.4，DIPSO-NaOH缓冲液中含0.8％氯化钠、10mmol/L EDTA、0.2％BSA、0.1％吐温20、2％丙三醇、0.01％BHT，再以同样20ml DIPSO-NaOH缓冲液分散成乳白色混悬液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为2.5mg/ml，最后再加入防腐剂叠氮钠，终浓度为0.1％。

3、D-二聚体稀释液：添加防腐剂的磷酸盐缓冲生理盐水，pH＝7.4，其组成为Na₂HPO₄10mmol/L，NaH₂PO₄2mmol/L，NaCl 135mmol/L，KCl 4.7mmol/L，叠氮钠0.1％。

4、D-二聚体校准品：

将市售纤维蛋白原溶于50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(Tris 50mM、NaCl 0.15mM、pH值7.4)中，使浓度达到5mg/ml，加入氯化钙(终浓度为25mmol/L)和凝血因子XIII(终浓度为10μg/ml)后，添加人凝血酶(终浓度为3U/ml)。将此混合物在37℃温育18小时，得到块状交联纤维蛋白，用Tris-HCl缓冲液洗涤后，冷冻干燥、粉碎，得到纤维蛋白粉末。

将纤维蛋白加入到上述的50mmol/L Tris-HCl缓冲液中，使其浓度为25mg/ml，向溶液中加入纤溶酶(终浓度为20mU/ml)，在37℃搅拌4小时。再在56℃水浴温育2小时，将纤溶酶灭活终止反应。以每分钟3000转离心10分钟，得到的上清液即为纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液。以进口的日本积水医疗株式会社生产D-二聚体校准品为原始标准，采用其D-二聚体检测试剂盒(胶乳免疫比浊法)进行测定20次，求出均值，得到纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液的初始浓度。再将纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液用50mmol/L DIPSO-NaOH缓冲液稀释成D-二聚体浓度在5.5～6.5μg/ml的溶液，然后再加入终浓度分别为：50mg/ml、20mg/ml、0.85％、0.1％的牛血清白蛋白(BSA)、甘露醇、氯化钠、叠氮钠，混合均匀。以0.5ml/瓶分装后进行冷冻干燥，即得到D-二聚体校准品的冻干疏松固体。取校准品10瓶，分别用0.5ml蒸馏水复溶，作为样本用日本积水D-二聚体试剂盒每瓶重复测定2次，计算总均值即为标示值，浓度为6.080μg/ml。

二、用试剂盒检测样品的方法

将试剂盒中D-二聚体校准品，精确加入0.5ml蒸馏水溶解，用生理盐水配制成6个不同浓度的校准品溶液，浓度分别为6.080、3.040、1.520、0.760、0.380、0.190μg/ml。以日本东亚CA550血凝仪操作为例：测定波长为575nm，分别取不同浓度的校准品溶液(20μl)，加入D-二聚体稀释液(5μl)，在37℃反应30秒后加入D-二聚体R₁(100μl)，再反应60秒后加入D-二聚体R₂(100μl)，测定反应第10秒、第90秒的吸光度值(A₁、A₂)，计算吸光度差值ΔA＝A₂-A₁，每管重复测定3次，将各校准管3次测得的吸光度差值ΔA的均值为纵坐标，对应的浓度为横坐标，制作“浓度-吸光度差值”校准曲线：y＝0.20149x-0.01327，相关系数r＝0.99955(见附图1)。

取待测样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中D-二聚体的含量。如果样本中D-二聚体的浓度超出校准曲线范围，为了保证检测的准确性，需要对样本进行适当稀释后再行检测。

本试剂盒不仅适用于日本东亚CA550血凝仪，而且还适用于其它品牌、型号的血凝分析仪和生化分析仪，具体参数可根据仪器不同进行调整。

三、检测试剂盒的分析性能评估

1.线性范围

将接近线性范围上限的D-二聚体高浓度样本(6.040μg/ml)，用生理盐水将其按1/2，1/10，1/30，1/60，1/120稀释，共配制成6个不同浓度的溶液，用实施例1中第二步用试剂盒检测样品所述方法检测各浓度，每浓度重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程为Y＝1.00465X+0.00623，相关系数为r＝0.99995，表明本发明试剂盒在0.05μg/ml～6.0μg/ml线性范围内相关性较好(见附图2)。

2.灵敏度(最低检测限)

以5％人血清白蛋白为空白样本，按实施例1中第二步用试剂盒检测样品所述方法测定，重复测定20次，计算结果均值为0.0006，标准差S为0.00023，根据以空白均值加两倍标准差报告方法计算吸光度变化量为0.00106，用稀释后浓度分别为0.005μg/ml、0.010μg/ml和0.015μg/ml D-二聚体校准品溶液测定，吸光度变化值分别为0.0007、0.0014、0.0022，其中浓度为0.010μg/mlD-二聚体校准品ΔA略高于

的计算值，因此本发明试剂盒检测D-二聚体的灵敏度可达0.010μg/ml。

以5％人血清白蛋白为空白样本，用市售A公司试剂盒进行测定，重复测定20次，计算结果均值为0.0008，标准差SD为0.00025，根据以空白均值加两倍标准差报告方法计算吸光度变化量为0.0013，用稀释后浓度分别为0.01μg/ml、0.05μg/ml和0.10μg/ml D-二聚体校准品溶液测定吸光度变化值分别为0.0007、0.0015、0.0024，因此市售A公司试剂盒检测D-二聚体的灵敏度为0.05μg/ml。本发明试剂盒与市售A公司试剂盒相比，灵敏度显著提高。

3.重复性和准确度

用德国Dade Behring公司标示值分别为0.206μg/ml和4.110μg/ml的D-二聚体校准品作为样本，按实施例1中第二步用试剂盒检测样品所述方法测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值

和标准差(S)，以计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为1.87％和1.27％；以

计算相对偏差进行准确度考察，其相对偏差分别为1.36％和1.26％。

表1D-二聚体试剂盒的重复性和准确度考察

4.批间精密度(批间差)

按本发明试剂盒组成制备3批产品，用3个批号的试剂盒分别测定同一份血浆样本各3次，分别计算每个批号3次的测定均值

和3个批号的总均值以

进行批间精密度计算，结果显示批间精密度为2.54％。

表2D-二聚体试剂盒的批间差考察

5.干扰物质的影响

将浓度为3.040μg/ml D-二聚体校准品溶液，分别加入相同体积的各干扰物质溶液，加入后的浓度分别为游离型胆红素(17mg/L)、结合型胆红素(21mg/L)、血红蛋白(500mg/L)，乳糜(福尔马肼)浊度为1960和类风湿因子(RF)(500IU/ml)。用本发明试剂盒与市售A公司试剂盒分别对每个样本重复测定3次，取平均值，与加入同体积的蒸馏水比较，观察加入干扰物质与加入蒸馏水后D-二聚体测定值的相对误差。结果表明：本发明试剂盒对加入以上浓度干扰物质的与加入同体积蒸馏水后测定值的相对误差不超过3％，可以认为在中轻度溶血、黄疸或乳糜时，此测定方法的检测结果基本不受干扰；而市售A公司试剂盒相对偏差较大，易受胆红素、类风湿因子等干扰物质的影响。

表3干扰物质影响实验

四、检测试剂盒的稳定性

将本发明试剂盒和市售A公司试剂盒，分别开瓶后置于+2～+8℃保存30天后，取出按各自方法测定德国Dade Behring公司标示值分别为0.206μg/ml和4.110μg/ml两个不同浓度的校准品，各重复测定3次，计算平均值及与标示值的相对偏差。实验结果表明，开瓶30天后本发明试剂盒检测值与标示值的相对偏差都小于3％，开瓶稳定性较好；而市售A公司试剂盒的检测值相对偏差较大。

将本发明试剂盒和市售A公司试剂盒分别置于+2～+8℃保存18个月后，检测德国DadeBehring公司标示值分别为0.215μg/ml和4.034μg/ml两个不同浓度的校准品，各重复测定3次，计算平均值及与标示值的相对偏差。实验结果表明，本发明试剂盒检测值与标示值的相对偏差都小于3％，在+2～+8℃保存18个月是比较稳定的；而市售A公司试剂盒放置18个月后的检测值相对偏差较大。

表4D-二聚体试剂盒的稳定性实验数据

五、本发明实施例的检测试剂盒与已上市产品的比较

1.对已知浓度校准品的检测比较

用本发明试剂盒和德国Dade Behring公司的D-二聚体试剂盒同时测定Dade Behring公司浓度为0.206μg/ml D-二聚体校准品，分别重复测定10次，计算均值

方差S²，进行统计分析，采用F检验和t检验比较两者的差异。

表5对浓度为0.206μg/ml校准品检测结果比较

对2组检测数据的总体方差显著性差异进行单侧F检验：查表α＝0.05，υ₁＝9，υ₂＝9，F_{α(υ1，υ2)}＝3.19，两组数据方差比的F值为1.1279，则P值大于0.05，两者的总体方差没有显著性差异。对2组检测数据总体均数显著性差异进行双侧t检验：查表可知α＝0.1，υ＝18，t_α(υ)＝1.734，根据统计学计算，两组数据的t＝1.1528，则P值大于0.1，两者的总体均数没有显著性差异。通过比较结果表明：本发明试剂盒与Dade Behring公司D-二聚体试剂盒在重复性和准确度的性能方面基本一致。

2.对医院正常人群和患者血浆样本检测的相关性比较

从上海市瑞金医院住院及门诊随机抽取正常人群和患者的血液样本共60份，其中男38例，女22例。血液按体积比为9∶1的比例与0.109mol/L枸橼酸钠抗凝液混匀后，3000r/min离心15分钟，分离得到血浆。用本发明试剂盒和德国Dade Behring公司D-二聚体检测试剂盒分别对样本重复测定2次，分别计算测定均值，计算两者的相关系数，并进行线性回归。

血浆D-二聚体的检测数据浓度在0μg/ml～80μg/ml，两种试剂盒的相关系数r＝0.9989，线性回归方程为y＝1.0044x-0.0289(见附图3)。根据美国临床实验室标准化组织(CLSI)文件的要求(r＞0.975)，本发明试剂盒和德国Dade Behring公司进口试剂盒的检测数据具有很好的一致性。由此可见两种试剂盒在临床上对于深静脉血栓(DVT)、弥漫性血管内凝血(DIC)及肺栓塞(PE)等疾病的诊断和病程检测具有等同作用，本发明的试剂盒在临床上可以替代进口试剂盒使用，降低检测成本，减轻患者的经济负担。

实施例2

一、检测试剂盒的组成及制备方法

1、D-二聚体R₁试剂配制：HEPES浓度为50mmol/L，用氢氧化钠调节后pH值为7.5。再加入氯化钾、PEG8000、Proclin300(购自SUPELCO公司，活性成分为MCI和CMCI)，其终浓度分别为：氯化钾0.8％、PEG80002％、Proclin3000.05％。

2、D-二聚体R₂试剂配制：

将含有250μg鼠抗人D-二聚体单克隆抗体(购自American Diagnostica Inc.，产品货号ADI No.300，克隆号DD-3B6/22)冻干品，加入0.5ml去离子蒸馏水复溶。取100μl溶液，用5ml 0.12M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释后，加入实施例1中制备的羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液，再加入2mg EDC，在4℃搅拌反应6小时，加入0.2ml 0.1mol/L的甘氨酸缓冲液(pH 8.2)搅拌30分钟终止反应，离心弃去上清，用20ml 30mmol/L HEPES-NaOH缓冲液洗涤1次，HEPES-NaOH缓冲液pH为7.5，HEPES-NaOH缓冲液中含0.7％氯化钾、15mmol/L甘氨酸、0.3％BSA、0.3％吐温40、1.5％乳糖，再以同样12.5ml HEPES-NaOH缓冲液分散成乳白色混悬液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为4mg/ml，最后再加入防腐剂Proclin300，终浓度为0.05％。

3、D-二聚体稀释液：添加防腐剂的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH＝7.5)，其组成为甘氨酸50mmol/L，氯化钾0.85％，Proclin3000.05％。

4、D-二聚体校准品：

将市售纤维蛋白原溶于30mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(Tris 30mM、NaCl 0.15mM、pH值7.5)中，使浓度达到5mg/ml，加入氯化钙(终浓度为25mmol/L)和凝血因子XIII(终浓度为10μg/ml)后，添加人凝血酶(终浓度为3U/ml)。将此混合物在37℃温育18小时，得到块状交联纤维蛋白，用Tris-HCl缓冲液洗涤后，冷冻干燥、粉碎，得到纤维蛋白粉末。

将纤维蛋白加入到上述的30mmol/L Tris-HCl缓冲液中，使其浓度为25mg/ml，向溶液中加入纤溶酶(终浓度为20mU/ml)，在37℃搅拌4小时。再在56℃水浴温育2小时，将纤溶酶灭活终止反应。以每分钟3000转离心10分钟，得到的上清液即为纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液。以进口的日本积水医疗株式会社生产D-二聚体校准品为原始标准，采用其D-二聚体检测试剂盒(胶乳免疫比浊法)进行测定20次，求出均值，得到纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液的初始浓度，再将纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液用30mmol/LHEPES-NaOH缓冲液稀释成D-二聚体浓度在5.5～6.5μg/ml的溶液，然后再加入终浓度分别为70mg/ml、20mg/ml、0.8％、0.05％的明胶、葡萄糖、氯化钾、Proclin300，混合均匀。以0.5ml/瓶分装后进行冷冻干燥，即得到D-二聚体校准品的冻干疏松固体。取校准品10瓶，分别用0.5ml蒸馏水复溶，作为样本用日本积水D-二聚体试剂盒每瓶重复测定2次，计算总均值即为标示值，浓度为6.150μg/ml。

用试剂盒测定样品的方法同实施例1。

二、检测试剂盒的分析性能评估

1.重复性和准确度

用实施例1中德国Dade Behring公司标示值分别为0.206μg/ml和4.110μg/ml的D-二聚体校准品对本实施例中的试剂盒进行重复性和准确度考察，结果显示变异系数分别为2.67％和1.96％；相对偏差分别为1.41％和1.04％。

表6D-二聚体试剂盒的重复性和准确度考察

2.检测试剂盒的稳定性

用实施例1方法对本试剂盒进行开瓶稳定性和长期稳定性考察，实验结果表明，开瓶后在+2～+8℃放置30天后，本发明试剂盒检测值与标示值的相对偏差都小于3％，开瓶稳定性相对较好；在+2～+8℃长期放置18个月，检测值与标示值的相对偏差都小于3％，本发明试剂盒在+2～+8℃保存18个月是比较稳定的。

表7D-二聚体试剂盒的稳定性实验数据

实施例3

一、检测试剂盒的组成及制备方法

1、D-二聚体R₁试剂配制：Tris浓度为50mmol/L，用盐酸调节后pH值为8.5。再加入硫酸钠、PEG6000、硫柳汞，其终浓度分别为：硫酸钠0.7％、PEG60004％、硫柳汞0.01％。

2、D-二聚体R₂试剂为胶乳试剂：

将含有250μg鼠抗人D-二聚体单克隆抗体(购自American Diagnostica Inc.，产品货号ADI No.300，克隆号DD-3B6/22)冻干品，加入0.5ml去离子蒸馏水复溶。取100μl溶液，用5ml 0.12M PBS缓冲液(pH 7.4)稀释后，加入实施例1中制备的羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液，再加入2mg EDC，在4℃搅拌反应6小时，加入0.2ml 0.1mol/L的甘氨酸缓冲液(pH 8.2)搅拌30分钟终止反应，离心弃去上清，用20ml 30mmol/L Tris-HCl缓冲液洗涤1次，Tris-HCl缓冲液pH为8.5，Tris-HCl缓冲液中含0.9％氯化纳、10mmol/L丝氨酸、0.5％明胶、0.6％司盘60，再以同样25mlTris-HCl缓冲液分散成乳白色混悬液，使致敏的抗体胶乳颗粒浓度为2mg/ml，最后再加入防腐剂硫柳汞，终浓度为0.01％。

3、D-二聚体稀释液：添加防腐剂的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)，其组成为Tris 30mmol/L，硫酸钠0.8％，硫柳汞0.01％。

4、D-二聚体校准品：

将市售纤维蛋白原溶于60mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(Tris 60mM、NaCl 0.15mM、pH值8.5)中，使浓度达到5mg/ml，加入氯化钙(终浓度为25mmol/L)和凝血因子XIII(终浓度为10μg/ml)后，添加人凝血酶(终浓度为3U/ml)。将此混合物在37℃温育18小时，得到块状交联纤维蛋白，用Tris-HCl缓冲液洗涤后，冷冻干燥、粉碎，得到纤维蛋白粉末。

将纤维蛋白加入到上述的60mmol/L Tris-HCl缓冲液中，使其浓度为25mg/ml，向溶液中加入纤溶酶(终浓度为20mU/ml)，在37℃搅拌4小时。再在56℃水浴温育2小时，将纤溶酶灭活终止反应。以每分钟3000转离心10分钟，得到的上清液即为纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液。以进口的日本积水医疗株式会社生产D-二聚体校准品为原始标准，采用其D-二聚体检测试剂盒(胶乳免疫比浊法)进行测定20次，求出均值，得到纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液的初始浓度。再将纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液用60mmol/LTris-HCl缓冲液稀释成D-二聚体浓度在5.5～6.5μg/ml的溶液，然后再加入终浓度分别为：30mg/ml、20mg/ml、0.7％、0.01％的BSA、蔗糖、硫酸钠、硫柳汞，混合均匀。以0.5ml/瓶分装后进行冷冻干燥，即得到D-二聚体校准品的冻干疏松固体。取校准品10瓶，分别用0.5ml蒸馏水复溶，作为样本用日本积水D-二聚体试剂盒每瓶重复测定2次，计算总均值即为标示值，浓度为5.952μg/ml。

用试剂盒测定样品的方法同实施例1。

二、检测试剂盒的分析性能评估

1.重复性和准确度

用实施例1中德国Dade Behring公司标示值分别为0.206μg/ml和4.110μg/ml的D-二聚体校准品对本实施例中的试剂盒进行重复性和准确度考察，结果显示变异系数分别为3.29％和3.17％；相对偏差分别为3.98％和1.75％。

表8D-二聚体试剂盒的重复性和准确度考察

2.检测试剂盒的稳定性

用实施例1方法对本试剂盒进行开瓶稳定性和长期稳定性考察，实验结果表明，开瓶后在+2～+8℃放置30天后，本发明试剂盒检测值与标示值的相对偏差都小于5％，开瓶稳定性相对较好；在+2～+8℃长期放置18个月，检测值与标示值的相对偏差都小于5％，本发明试剂盒在+2～+8℃保存18个月是比较稳定的。

表9D-二聚体试剂盒的稳定性实验数据

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种胶乳免疫比浊法测定D-二聚体含量的试剂盒，其特征在于，包括D-二聚体R₁试剂、D-二聚体R₂试剂、D-二聚体稀释液和D-二聚体校准品；

所述D-二聚体R₂试剂包括鼠抗人D-二二聚体单克隆抗体胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂②和防腐剂；

所述D-二聚体R₂试剂是由鼠抗人D-二聚体单克隆抗体与羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒在磷酸盐缓冲液中通过采用6-氨基己酸化学交联法致敏，再经离心、洗涤后，在含有稳定剂②和防腐剂的3-[N，N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液中分散而成；

所述羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒是一种核壳形式的胶乳，乳核是苯乙烯聚合物，乳壳是苯乙烯、丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸共聚物；

所述D-二聚体稀释液包括缓冲液和防腐剂；

所述D-二聚体校准品是由纤维蛋白降解产物D-二聚体、缓冲液、稳定剂③、赋形剂和防腐剂组成的溶液经分装冻干而成；

所述的稳定剂①选自无机盐；

所述的稳定剂③选自蛋白质和无机盐；

所述乳核的粒径在100nm-150nm，所述羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为180nm-220nm，所述乳壳中苯乙烯与丙烯酸正丁酯重量比为1∶1，乳壳的重量为胶乳颗粒总重的10％-30％，甲基丙烯酸的重量为胶乳颗粒总重的1.0-5.0％。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的蛋白质选自牛血清白蛋白或明胶；

所述的金属络合剂选自甘氨酸、丝氨酸、精氨酸和乙二胺四乙酸中的一种或两种以上；

所述的抗氧剂选自2，6-二叔丁基对甲酚、叔丁基对羟基茴香醚、棓酸丙酯中的一种或两种以上；

所述缓冲液选自3-[N，N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、N-2-羟乙基呱嗪-N′-2-乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、甘氨酸缓冲液和巴比妥缓冲液中的一种或两种以上；

所述的促凝剂选自聚乙二醇6000或聚乙二醇8000；

所述的防腐剂选自叠氮钠、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、硫柳汞、苯酚和乙基汞硫代硫酸钠中的一种或两种以上；

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述D-二聚体R₁试剂中缓冲液为3-[N，N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液，其终浓度为10～70mmol/L，pH值范围为7.0～9.0；稳定剂①为氯化钠，质量体积百分比终浓度为0.7％～0.9％；促凝剂为聚乙二醇8000，质量体积百分比终浓度为2～6％；防腐剂为叠氮钠，质量体积百分比终浓度为0.1％。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述3-[N，N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液终浓度为20～40mmol/L，pH值范围为7.0～9.0，致敏的抗体胶乳颗粒终浓度为1～5mg/ml。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述D-二聚体R₂试剂中，用于洗涤和分散的3-[N，N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液中的稳定剂②及其浓度为：氯化钠质量体积百分比浓度为0.7％～0.9％、乙二胺四乙酸浓度为5～20mmol/L、牛血清白蛋白质量体积百分比浓度为0.1～0.5％、吐温20体积百分比浓度为0.1～0.6％、丙三醇体积百分比浓度为1～10％、2，6-二叔丁基对甲酚质量体积百分比浓度为0.01％。

6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述D-二聚体稀释液为添加防腐剂的磷酸盐缓冲生理盐水，pH值范围为7.0-9.0。

7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述D-二聚体校准品是将人纤维蛋白原在凝血酶和凝血因子XIII的作用下形成交联纤维蛋白块或直接采用市售人纤维蛋白，用纤溶酶在三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液中降解形成纤维蛋白降解产物D-二聚体溶液，用3-[N，N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液稀释成D-二聚体浓度为5.5～6.5μg/ml的溶液，再添加牛血清白蛋白、甘露醇、氯化钠、叠氮钠后通过冻干制成；所述3-[N，N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液的终浓度为30～70mmol/L，pH为7.0～9.0；牛血清白蛋白的终浓度为20～60mg/ml；甘露醇的终浓度为10～30mg/ml；氯化钠的质量体积百分比浓度为0.7-0.9％；叠氮钠的质量体积百分比终浓度为0.1％。