CN111896748A - 一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒 - Google Patents

一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种抗链球菌溶血素O测定试剂盒。本发明的抗链球菌溶血素O测定试剂盒，包括试剂R1、试剂R2；其中试剂R1包括：表面活性剂5～30g/L、无机盐5～30g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为5～9；试剂R2包括：稳定剂5～100g/L、促凝剂5～15g/L、抗人ASO‑IgG抗体的致敏乳胶颗粒0.1～2g/L、抗冻剂1～10g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为5～9。本发明的测定试剂盒检测灵敏度高、特异性强、精密度好、成本较低，可以实现对ASO的准确检测。

Description

一种抗链球菌溶血素O测定试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种抗链球菌溶血素O测定试剂盒。
背景技术
抗链球菌溶血素O(Anti-Streptolysin O，简称ASO)亦称抗链球菌溶血素“O”(ASO)，链球菌溶血素是A群链球菌产生的一种外毒素，简称抗“O”或ASO。ASO能溶解红细胞，并对机体多种细胞有毒性作用。人体感染溶血性链球菌后，血清中可出现大量抗链球菌溶血素O(抗“O”)抗体。
溶血性链球菌产生的一种代谢产物能溶解红细胞，所以这种产物被取名为“O”溶血素。人体感染了A组溶血性链球菌后，“O”溶血素在体内作为一种抗原物质存在。抗“O”的数值以单位计算，有100、125、166、250、333、500、625、833、1250、2500等数档。正常人一般在500单位以下，若高于500单位，说明最近有过溶血性链球菌感染。
ASO测定对于诊断A族链球菌感染很有价值，其存在及含量可反映感染的严重程度。A族链球菌感染后1周，ASO即开始升高，4～6周可达高峰，并能持续数月，当感染减退时，ASO值下降并在6个月内回到正常值，如果ASO滴度不下降，提示可能存在复发性感染或慢性感染。多次测定，抗体效价逐渐升高对诊断有重要意义，抗体效价逐渐下降，说明病情缓解。
健康成人ASO正常参考值一般为0～200IU/ml，其中少于15-20％的健康人血清中的ASO含量高于200IU/ml，儿童正常值为<250U。ASO正常值因年龄、季节、气候、链球菌流行情况，尤其地区而有所差别。风湿热、急性肾小球肾炎、结节性红斑、猩红热、急性扁桃体炎等ASO明显升高。同时少数肝炎、结缔组织病、结核病及多发性骨髓瘤病人亦可使ASO增高。类风湿时部分病人ASO升高在400单位以上，但除了急性阶段外，类风湿关节炎患者的血清中通常检测不到ASO值的升高。
目前临床上常规的ASO检测方法包括胶乳凝集法、溶血抑制法、酶联免疫法、免疫比浊法等。胶乳凝集法采用血清和胶乳试剂相混合，根据有无凝集肉眼判断结果，此法易受人为因素和外界影响；溶血抑制法由于人或动物红细胞不稳定，对溶血素敏感性也不相同，故误差较大且操作步骤繁杂；酶联免疫法操作繁琐且耗时长，不利于临床的推广应用且不适合急诊样本及大数量样本的筛查检测；近年来应用最多的是胶乳免疫比浊法，此方法为均相测定，具有检测快速精准、灵敏度高、特异性强、精密度好、成本较低，且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定等优点。其基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。
现有胶乳免疫比浊法，部分采用化学偶联法将特异性抗体结合于多种粒径组合的复合胶乳上，虽可兼顾检测灵敏度和线性范围，但胶乳试剂制备操作繁琐，易导致复合胶乳重复性差、稳定性差等。且胶乳试剂制备过程中，多采用超声波处理技术及离心与重悬，操作繁琐，制备时间较长，试剂均一性和稳定性较难控制。
而且抗链球菌溶血素“O”测定试剂盒，属于临床生化诊断试剂盒，需要在低温(2～8℃)状态下贮存及运输，否则会破坏试剂的稳定性影响检测精度。目前体外诊断试剂大部分需要在2-8℃间低温冷藏保存，少数品种需-18℃冷冻保存，也有部分品种常温保存即可。
目前市场上用于比浊法检测的试剂绝大部分为液态的双试剂，且体外诊断试剂常用的运输手段主要为冷藏车和冷藏(保温)箱。但由于试剂供应商众多且品种供应分散以及运输成本等问题，绝大多数采用冷藏(保温)箱加冷冻冰袋配送。且在实际工作中，使用的冷藏(保温)箱大小不一，冷藏(保温)箱厚薄不均，密封性能也各有差异。在冰袋的使用上，也没有明确规定，随意性很大。冷藏(保温)箱中，试剂盒和冰袋的摆放，毫无规律，需冷藏保存的试剂如果裸露与冰袋混装，可能存在试剂冻融致使试剂中的某些因子失活的风险，从而影响测定结果，因此解决试剂在运输过程中的冻融问题就成了较大的难题。
发明内容
因此，针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗链球菌溶血素O测定试剂盒及其使用方法，可以实现对ASO的准确检测。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种抗链球菌溶血素O测定试剂盒，其包括试剂R1、试剂R2；
所述试剂R1中包括：表面活性剂5～30g/L、无机盐5～30g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为5～9；
所述试剂R2包括：稳定剂5～100g/L、促凝剂5～15g/L、抗人ASO-IgG抗体的致敏乳胶颗粒0.1～2g/L、抗冻剂1～10g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为5～9。
本发明的抗链球菌溶血素O测定试剂盒基于胶乳免疫透射比浊法(PETIA)，其原理是采用化学偶联法将特异性抗体结合于一定粒径的胶乳颗粒表面，当交联有抗体的微球与抗原结合后，短时间内迅速聚集在一起，从而改变反应液的吸光度。根据吸光度增加量，即可在波长600nm处测定免疫复合物浊度，定量检测血清中的抗链球菌溶血素O含量。
PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等繁琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。胶乳免疫透射比浊法由于其适用性强、测试方便等特性，已广泛应用于临床检测中。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液、Tris-HCl缓冲液、DIPSO缓冲液中的任意一种。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述试剂R1中，表面活性剂为PEG2000、PEG6000、Brij-35、乙二胺四乙酸二钠中的任意一种。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述试剂R1中，表面活性剂优选为PEG6000。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述试剂R1中，无机盐为KCl、CaCl2、NaCl、BaCl2、MgCl2、AlCl3中的任意一种。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述试剂R1中，无机盐优选为NaCl。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述试剂R2中，稳定剂为曲拉通X-100、海藻酸钠、甘油、吐温-20中任意一种。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述试剂R2中，稳定剂优选为甘油。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述试剂R2中，促凝剂为PEG8000。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述试剂R2中，抗冻剂为赤藓糖醇。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的任意一种。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述防腐剂优选为Proclin300。
作为本发明所述的测定试剂盒的优选实施方式，所述试剂R2中，抗人ASO-IgG抗体为单克隆抗体，所述抗人ASO-IgG抗体的致敏乳胶颗粒平均粒径为120nm。
本发明还提供所述的测定试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：向血清样品中加入试剂R1混匀孵育后，加入R2混匀孵育20s后，于600nm波长下检测吸光度值，5min后，于600nm波长下检测吸光度值，通过血清标准品数据计算ASO的含量。
本发明的有益效果：
(1)本发明的抗链球菌溶血素O测定试剂盒及其检测方法，采用胶乳免疫比浊法，用化学偶联法将特异性抗体结合于一定粒径的胶乳颗粒表面，通过特定的制备方法和优化反应体系，无需多次离心和重悬，无需超声波处理，即可获得稳定的胶乳试剂，同时兼顾了检测灵敏度和线性范围，显著提高了测定试剂的灵敏度和稳定性，可适用于各类全自动生化分析仪进行分析；
(2)本发明试剂盒特地添加了促凝剂聚乙二醇8000，并调整其用量为8g/L，避免了因聚合物过多造成的非特异性反应和因聚合物太少导致的灵敏度过低。合适的聚合物用量有利于提高灵敏度和特异性；
(3)本发明试剂盒特地添加了抗冻剂赤藓糖醇，并调整其用量为10g/L，有效提高了试剂的稳定性。即使抗链球菌溶血素O测定试剂盒的温度低于0℃，甚至在低至-20℃贮存1周，也能有效保证其试剂的稳定性，同时其检测灵敏度高、特异性强、精密度好、成本较低，可以实现对ASO的准确检测；
(4)本发明试剂盒可在具备有400-800nm波长的全自动生化分析仪上检测血液中抗链球菌溶血素O的含量，直接上机使用，快速精准，自动化程度高，大大提高工作效率。且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1
本实施例的抗链球菌溶血素O测定试剂盒中加入了抗冻剂赤藓糖醇。
R1：聚乙二醇6000(PEG6000)20g/L、NaCl 30g/L、防腐剂Proclinc 300 0.5g/L；并利用100mmoL/L的磷酸盐缓冲液调节pH为6。
R2：甘油80g/L、PEG8000 8g/L、抗人ASO-IgG的致敏乳胶颗粒0.5g/L、赤藓糖醇10g/L、防腐剂Proclinc 300 0.5g/L；并利用100mmoL/L的磷酸盐缓冲液调节pH为6。
其中，抗人ASO-IgG的致敏乳胶颗粒悬液的制备方法为：
(1)取1mL羧基化聚苯乙烯乳胶微球(120nm，10％固含量)，加入浓度为120mmol/L，pH8.5的甘氨酸缓冲液至5mL。
(2)加入1ml 22g/L的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1ml 8.5g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)进行活化，搅拌均匀后37℃孵育20min。
(3)加入3mL浓度为100mmoL/L，pH6.0的磷酸盐缓冲液，300r/min，室温搅拌均匀。
(4)抗人ASO单克隆抗体(购买于北京希凯创新科技有限公司，产品批号20190304)的加入浓度以与羧基化聚苯乙烯乳胶微球颗粒的质量比为0.2：1的比例加入，37℃孵育4小时。
(5)加入3mL终止液终止反应，室温下搅拌3小时后，4℃保存备用。终止液为含20％BSA的磷酸盐缓冲液。
实施例2
本实施例的测定试剂盒与实施例1中的试剂盒制备方法相同，区别之处仅在于试剂R1和试剂R2的组分不同，具体为：
R1：PEG2000 30g/L、MgCl2 10g/L、叠氮化钠0.05g/L；并利用100mmol/L的甘氨酸缓冲液调节pH为7。
R2：吐温-20 5g/L、PEG8000 5g/L、抗人ASO-IgG的致敏乳胶颗粒0.1g/L、赤藓糖醇5g/L、防腐剂叠氮化钠0.05g/L；并利用100mmol/L的甘氨酸缓冲液调节pH为7。
实施例3
本实施例的测定试剂盒与实施例1中的试剂盒制备方法相同，区别之处仅在于试剂R1和试剂R2的组分不同，具体为：
R1：乙二胺四乙酸二钠5g/L、KCl 5g/L、庆大霉素2g/L；并利用100mmol/L的Tris-HCl缓冲液调节pH为6。
R2：曲拉通X-100 100g/L、PEG8000 15g/L、抗人ASO-IgG的致敏乳胶颗粒2g/L、赤藓糖醇1g/L、庆大霉素2g/L；并利用100mmol/L的Tris-HCl缓冲液调节pH为7。
对比例1
对比例1的测定试剂盒与实施例1中的试剂盒制备方法相同，区别之处仅在于对比例1的测定试剂盒试剂R2中不加抗冻剂赤藓糖醇。
测试例1抗链球菌溶血素O测定试剂盒的抗冻能力分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪。
检测样本：40例随机血清样本和一份ASO血清样本(靶值为585.5IU/mL)。
对照试剂盒：国家食品药品监督管理局已批准上市的某厂家抗链球菌溶血素“O”(ASO)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)(包括试剂R1和R2，但成分与本发明不同，以下简称为对照试剂)。
将本发明实施例1、对比例1检测试剂同时放入2～8℃(正常存放条件为2～8℃)、-20℃冷冻1天(24h)、-20℃冷冻7天进行抗冻试验，分别同时定标后测定40例血清样品，以考察其组分的稳定性，结果如表1所示。
本发明抗链球菌溶血素“O”(ASO)测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
①打开仪器预热15分钟，在全自动生化仪上添加项目，设置项目参数，登记试剂位，把试剂R1和试剂R2放入试剂盘中，并测试试剂余量。
②分离血清样品，向血清样品中加入试剂R1，混匀，孵育3～5min后，加入R2混匀孵育20s后，于600nm波长下检测吸光度值A1，5min后，于600nm波长下检测吸光度值A2，通过血清标准品数据即可计算ASO的含量。
ASO的含量计算方法为：分别计算校准品的吸光度变化值△A，并绘制校准曲线，校准曲线使用多点非线性拟合；将样本测定的吸光度变化值A1按拟合的公式进行计算，即可得出样本中ASO的浓度，其中△A＝A2-A1。
表1实施例1的样品检测结果(单位：IU/mL)
Figure BDA0002619422260000071
Figure BDA0002619422260000081
表2对比例1的样品检测结果(单位：IU/mL)
Figure BDA0002619422260000082
从表1、表2可知，未冷冻时，实施例1、对比例1的40例样品检测结果平均值分别为350.24IU/mL、349.90IU/mL，二者检测结果基本相当；经-20℃冷冻处理1天后，实施例1的检测结果平均值为346.72IU/mL，对比例1的检测结果平均值为185.51IU/mL；经-20℃冷冻处理7天后，实施例1的检测结果平均值为344.92IU/mL，对比例1的检测结果平均值为180.95IU/mL。
对比例1经-20℃冷冻处理1天后的样品检测结果均显著下降，平均下降幅度达到了46.98％，而实施例1由于含有一定量的赤藓糖醇作为抗冻剂，经-20℃冷冻处理1天后的样品检测结果平均下降幅度仅为1.01％，属于合理范围，且较对比例1有明显改善；经-20℃冷冻处理7天后的实施例1、对比例1的样品检测结果平均下降幅度分别为1.52％和48.28％，与经-20℃冷冻处理1天后的样品检测结果无明显差异，可能原因：试剂在-20℃冷冻处理1-7天，试剂均处于稳定状态，试剂组分变化小。平均下降幅度＝(未冷冻时的均值－冷冻一定天数的均值)/未冷冻时的均值。
以上结果表明，添加赤藓糖醇的实施例1试剂抗冻性能好于未添加赤藓糖醇的对比例1，可见，赤藓糖醇作为一种抗冻剂增强了试剂的抗冻能力，在试剂冷链运输过程中能有效保证试剂的稳定性。
测试例2抗链球菌溶血素O测定试剂盒的准确度分析
对照试剂盒：国家食品药品监督管理局已批准上市的某厂家抗链球菌溶血素“O”(ASO)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法)(包括试剂R1和R2，但成分与本发明不同，以下简称为对照试剂)。
用实施例1、对比例1制备得到的试剂盒和对照试剂盒按各自的检测方法分别同时定标后同时测定一份ASO血清样本(靶值为585.5U/mL)，结果如表3所示。
表3 ASO血清样本(靶值为585.5IU/mL)检测结果(单位：IU/mL)
Figure BDA0002619422260000091
结果显示，根据实施例1、对比例1检测结果计算出的相对偏差分别为0.74％、1.29％，表明本发明试剂盒检测结果与对照试剂盒结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)，而且实施例1为最优的选择。
测试例3试剂盒及方法的灵敏度分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪。
检测样本：1份纯化水、1份浓度为191.0IU/mL的ASO低值样本。
用实施例1的试剂和对照试剂(某厂家ASO测定试剂盒)用各自的检测方法同时定标同时对每份待测样本重复检测20次，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差(SD)；水的吸光度平均值加上2SD作为最低检出限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和191.0IU/mL样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度，即灵敏度，灵敏度＝(水吸光度差值平均值+2SD)*样本浓度/样本吸光度差值平均值。检测结果见表4。
表4实施例1试剂盒与对照试剂盒灵敏度分析结果(单位：IU/mL)
Figure BDA0002619422260000101
Figure BDA0002619422260000111
结果显示，本发明实施例1试剂盒的灵敏度为3.235IU/mL，对照试剂的灵敏度为4.787IU/mL，表明本发明的试剂盒具有较高的灵敏度。
测试例4试剂盒及方法的精密度分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪。
检测样本：1份临床血清样本(低值样本)、1份ASO血清样本(845.0IU/mL)(高值样本)。
用实施例1的试剂和检测方法对每份待测样本重复检测10次，检测结果见表5。
表5实施例1精密度分析结果(单位：IU/mL)
Figure BDA0002619422260000112
结果显示，本发明的试剂盒的精密度：CV低值为0.65、CV高值为0.17，均小于等于10％，而对照试剂CV低值为0.68、CV高值为0.14，表明本发明试剂盒具有较高的精密度。
测试例5本发明试剂盒及方法的线性分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪。
检测样本：高ASO血清样本(940.0IU/mL)。
将高ASO血清样本(940.0IU/mL)用校准品稀释液稀释成6个不同浓度，分别为0.0IU/mL、188.0IU/mL、376.0IU/mL、564.0IU/mL、752.0IU/mL、940.0IU/mL，采用实施例1的试剂盒及检测方法对上述样品的每个浓度进行检测，每个浓度检测三次，计算相关系数R值，检测结果见表6。
表6实施例1试剂盒线性分析结果(单位：IU/mL)
Figure BDA0002619422260000121
结果显示，根据实施例1检测结果得到的回归方程为y＝0.9902x-5.9794，相关系数R2＝0.9998，表明本发明试剂盒及检测方法在0.0IU/mL～940.0IU/mL范围内具有良好的线性度。
测试例6试剂盒及方法的稳定性分析
不同检测试剂的加速稳定性考察：
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪。
检测样本：40例随机血清样本。
将2～8℃、-20℃冷冻1天、-20℃冷冻7天的本发明实施例1检测试剂进行37℃加速破坏性实验，以考察其组分的稳定性，结果如表7所示。
表7实施例1试剂经加速破坏性实验1周后的样品检测结果(单位：IU/mL)
Figure BDA0002619422260000122
Figure BDA0002619422260000131
从表7可知，未加速时，2～8℃、-20℃冷冻1天、-20℃冷冻7天的实施例1的40例样品检测结果平均值分别为265.23IU/mL、263.2IU/mL、262.06IU/mL，三者结果无明显差异；经37℃加速破坏性实验1周后，2～8℃、-20℃冷冻1天、-20℃冷冻7天的实施例1的检测结果平均值分别为259.79IU/mL、258.84IU/mL、257.43IU/mL，较未加速时，检测结果平均值下降幅度分别为2.05％、1.66％、1.77％，均小于10％，属于合理范围。平均下降幅度＝(未加速时的均值－加速1周的均值)/未加速时的均值。
以上结果表明，实施例1由于含有一定量的赤藓糖醇作为抗冻剂，经-20℃冷冻1天、-20℃冷冻7天，再经破坏性实验1周后的样品检测结果均未发生明显变化，且与2～8℃的检测结果基本相当，属于合理范围。可见，赤藓糖醇的添加不仅增强了试剂的抗冻性，也能有效的保证试剂的稳定性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种抗链球菌溶血素O测定试剂盒，其特征在于，所述测定试剂盒包括试剂R1、试剂R2；
所述试剂R1包括：表面活性剂5～30g/L、无机盐5～30g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为5～9；
所述试剂R2包括：稳定剂5～100g/L、促凝剂5～15g/L、抗人ASO-IgG抗体的致敏乳胶颗粒0.1～2g/L、抗冻剂1～10g/L、防腐剂0.05～2g/L，并利用缓冲液调节pH为5～9。
2.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液、Tris-HCl缓冲液、DIPSO缓冲液中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，表面活性剂为PEG2000、PEG6000、Brij-35、乙二胺四乙酸二钠中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，无机盐为KCl、CaCl2、NaCl、BaCl2、MgCl2、AlCl3中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中，稳定剂为曲拉通X-100、海藻酸钠、甘油、吐温-20中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中，促凝剂为PEG8000。
7.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中，抗冻剂为赤藓糖醇。
8.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的任意一种。
9.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中，抗人ASO-IgG抗体为单克隆抗体，所述抗人ASO-IgG抗体的致敏乳胶颗粒平均粒径为120nm。
10.权利要求1-9任一所述的测定试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：向血清样品中加入试剂R1混匀孵育后，加入R2混匀孵育20s后，于600nm波长下检测吸光度值，5min后，于600nm波长下检测吸光度值，通过血清标准品数据计算ASO的含量。
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