CN106153887A - 一种测定抗链球菌溶血素“o”的试剂盒 - Google Patents

一种测定抗链球菌溶血素“o”的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒。本发明的目的在于解决现有技术中抗链球菌溶血素“O”检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题。本发明为解决上述技术问题采用彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，在试剂R1液中添加了聚乙二醇‑2000，能够加速反应；在试剂R2中采用乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体，对抗链球菌溶血素“O”的检测灵敏度更高，检测准确性更好，因此检测准确度高，另外检测也比较方便。

Description

一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒。
背景技术
抗链球菌溶血素“O”，简称抗“O”或ASO，是A群链球菌产生的一种外毒素，能溶解红细胞，并对机体多种细胞有毒性作用。人体感染溶血性链球菌后，血清中可出现大量抗链球菌溶血素“O”抗体。检测抗链球菌溶血素“O”可作为链球菌感染后变态反应性疾病的辅助诊断。
人体感染了A组溶血性链球菌后，“O”溶血素在体内作为一种抗原物质存在。为了测定这种能中和链球菌溶血素“O”的抗体含量，就称为抗链球菌溶血素“O”试验。抗“O”的数值以单位计算，有100、125、166、250、333、500、625、833、1250、2500等数档。正常人一般在500单位以下，若高于500单位，说明最近有过溶血性链球菌感染。有些病人抗“O”升高，但是没有关节酸痛等症状，不能认为就是患了风湿关节炎，只能说明近期曾有过溶血性链球菌感染，患了扁桃体炎、咽炎、猩红热等一类疾病。但是，风湿性关节炎的发病原因确实与链球菌的感染有关，所以，风湿性关节炎活动期，抗“O”是会升高的。
据研究，柯萨奇B病毒、高胆固醇血症、溶血、肝炎、肾病综合症等疾病，均可呈现非特异性的抗“O”增高，但是滴度不是很高，类风湿关节炎也是如此。一般认为，类风湿关节炎的发病可能与某些微生物的感染有关，感染后引起异常免疫反应。链球菌也可能混杂在其间，部分参与了感染，因而出现了抗“O”。另外，类风湿关节炎病人“久病体虚”，抵抗力较差，容易收到链球菌的侵袭，我们在临床上常见到类风湿关节炎病人患有咽炎。还有部分关节炎病人应用肾上腺皮质激素或免疫抑制剂治疗之后，抗感染能力明显下降，这也是合并链球菌感染的原因。
目前测定抗链球菌溶血素“O”的方法主要为酶联免疫法。但酶联免疫吸附法测定耗时长，操作复杂，对操作者有较高的专业技能要求，且只能定性或者半定量检测。胶乳凝集实验只可定性检测。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中抗链球菌溶血素“O”检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，提供一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris缓冲液 20~100 mmol/L
聚乙二醇-2000 5~25 g/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
EDTA 20~70 mmol/L
海藻糖 20~50 mmol/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Tris缓冲液 20~100 mmol/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
甘油 5~25 mmol/L
乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体 0.2~2 %
其溶剂为纯化水。
作为优选，本试剂盒中独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris缓冲液 60 mmol/L
聚乙二醇-2000 15 g/L
Proclin-300 1.5g/L
EDTA 45 mmol/L
海藻糖 35 mmol/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Tris缓冲液 60 mmol/L
Proclin-300 1.5 g/L
甘油 15 mmol/L
乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体 1.1 %
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体为含有能与抗链球菌溶血素“O”抗体特异性结合的Fab功能部位的完整抗体或抗体片段。
作为优选，所述的包被抗链球菌溶血素“O”抗体的粒径在40~500nm之间。
作为优选，该测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒的制备方法和使用方法包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好R1试剂：
Tris缓冲液 20~100 mmol/L
聚乙二醇-2000 5~25 g/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
EDTA 20~70 mmol/L
海藻糖 20~50 mmol/L
其溶剂为纯化水。
（b）按照下列组分含量配制好R2试剂：
Tris缓冲液 20~100 mmol/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
甘油 5~25 mmol/L
包被抗链球菌溶血素“O”抗体 0.2~2 %
其溶剂为纯化水。
（c）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应进一步优选的，试剂R1与试剂R2的体积比为4：1，待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1：20到1：70之间。
（d）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（e）根据吸光度变化值计算出样本中的抗链球菌溶血素“O”的值。
作为优选，所述的乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体制备步骤如下：
（a）将粒径为120nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到1%，每mL溶液中加入EDAC 0.5 mg，室温反应2小时，在离心机内15000 rpm转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散；
（b）将步骤（a）的产物在离心机内15000 rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为2%，超声分散，边搅拌边加入等体积的含抗链球菌溶血素“O”抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时；
（c）将步骤（b）的产物在离心机内15000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50mmol/L的MES缓冲液中超声分散，加入BSA，4℃封闭过夜；离心去上清，用步骤（b）制得的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为1.1%，超声分散，制得乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体。
本发明所采用的胶乳增强免疫比浊法的反应原理是抗原抗体反应：样品中抗链球菌溶血素“O”（ASO）可与试剂中乳胶包被抗链球菌溶血素“O” 乳胶结合发生凝集反应，产生一定浊度。该浊度高低ASO的含量成正比。在一定波长下测定浊度并通过多点定标曲线可进行抗链球菌溶血素“O”的定量测定。
样本中抗链球菌溶血素“O”（ ASO）的活性（U/mL）= CS ×（U/mL）
式中：ΔAT 以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS 以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS 校准液中ASO的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明在试剂R1液中添加了聚乙二醇-2000，能够加速反应；在试剂R2中采用乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体，对抗链球菌溶血素“O”的检测灵敏度更高，检测准确性更好，因此检测准确度高，另外检测也比较方便。
附图说明：
图1为本试剂盒与化学发光法的检测结果对比。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Tris缓冲液 60 mmol/L
聚乙二醇-2000 15 g/L
Proclin-300 1.5g/L
EDTA 45 mmol/L
海藻糖 35 mmol/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
Tris缓冲液 60 mmol/L
Proclin-300 1.5 g/L
甘油 15 mmol/L
乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体 1.1 %
其溶剂为纯化水。
实施例2
试剂盒的制备和使用方法
1、乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体的制备：
（a）将粒径为120nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到1%，每mL溶液中加入EDAC 0.5 mg，室温反应2小时，在离心机内15000 rpm转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散；
（b）将步骤（a）的产物在离心机内15000 rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为2%，超声分散，边搅拌边加入等体积的含抗链球菌溶血素“O”抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时；
（c）将步骤（b）的产物在离心机内15000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50mmol/L的MES缓冲液中超声分散，加入BSA，4℃封闭过夜；离心去上清，用步骤（b）制得的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为1.1%，超声分散，制得乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体。
2、按照下列组分含量配制好试剂：
（a）按照下列组分含量配制好R1试剂：
Tris缓冲液 60 mmol/L
聚乙二醇-2000 15 g/L
Proclin-300 1.5g/L
EDTA 45 mmol/L
海藻糖 35 mmol/L
其溶剂为纯化水。
（b）按照下列组分含量配制好R2试剂：
Tris缓冲液 60 mmol/L
Proclin-300 1.5 g/L
甘油 15 mmol/L
乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体 1.1 %
其溶剂为纯化水。
3、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长600nm；
（c）反应时间 ：10min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：正反应；
4、检测步骤
（a）取200μl试剂R1与4μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 样本中抗链球菌溶血素“O”（ ASO）的活性（U/mL）= CS × （U/mL），计算出样本中的抗链球菌溶血素“O”的活度。
参照附图1，附图1为用实施例1所制得的一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒多次测定不同样本中抗链球菌溶血素“O”的测定结果，以及在同等条件下与化学发光法测定结果的对比分析。从相关性实验结果可见，本试剂盒与化学发光检测结果相关性很好，相关方程 y=0.9854x+0.5203，R2=0.9906，从结果可以看出本试剂盒结果准确性可靠，相关性良好，可以应用于抗链球菌溶血素“O”的检测。

Claims (8)

1.一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其特征在于：所述的彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris缓冲液 20~100 mmol/L
聚乙二醇-2000 5~25 g/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
EDTA 20~70 mmol/L
海藻糖 20~50 mmol/L
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
Tris缓冲液 20~100 mmol/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
甘油 5~25 mmol/L
乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体 0.2~2 %
其溶剂为纯化水。
2.一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Tris缓冲液 60 mmol/L
聚乙二醇-2000 15 g/L
Proclin-300 1.5g/L
EDTA 45 mmol/L
海藻糖 35 mmol/L
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
Tris缓冲液 60 mmol/L
Proclin-300 1.5 g/L
甘油 15 mmol/L
乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体 1.1 %
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1所述的一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒，其特征在于：所述的乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体为含有能与抗链球菌溶血素“O”抗体特异性结合的Fab功能部位的完整抗体或抗体片段。
4.根据权利要求1所述的一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒，其特征在于：所述的包被抗链球菌溶血素“O”抗体的粒径在40~500nm之间。
5.根据权利要求1所述的一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好R1试剂：
Tris缓冲液 20~100 mmol/L
聚乙二醇-2000 5~25 g/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
EDTA 20~70 mmol/L
海藻糖 20~50 mmol/L
其溶剂为纯化水；
（b）按照下列组分含量配制好R2试剂：
Tris缓冲液 20~100 mmol/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
甘油 5~25 mmol/L
包被抗链球菌溶血素“O”抗体 0.2~2 %
其溶剂为纯化水；
（c）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（d）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（e）根据吸光度变化值计算出样本中的抗链球菌溶血素“O”的值。
6.根据权利要求1所述的一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒，其特征在于：所述的乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体制备步骤如下：
（a）将粒径为120nm的胶乳颗粒，用50 mmol/L的MES缓冲液稀释胶乳颗粒到1%，每mL溶液中加入EDAC 0.5 mg，室温反应2小时，在离心机内15000 rpm转速下离心30分钟，去上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，超声分散；
（b）将步骤（a）的产物在离心机内15000 rpm转速下离心30分钟，弃上清，将沉淀悬浮于50 mmol/L的MES缓冲液中，使得胶乳颗粒最终浓度为2%，超声分散，边搅拌边加入等体积的含抗链球菌溶血素“O”抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时；
（c）将步骤（b）的产物在离心机内15000 rpm转速离心30分钟，弃上清，沉淀悬浮于50mmol/L的MES缓冲液中超声分散，加入BSA，4℃封闭过夜；离心去上清，用步骤（b）制得的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为1.1%，超声分散，制得乳胶包被抗链球菌溶血素“O”抗体。
7.根据权利要求5所述的一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（c）中,所述的试剂R1与试剂R2的体积比为4：1。
8.根据权利要求5所述的一种测定抗链球菌溶血素“O”的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（c）中,所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1：20到1：70之间。
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