CN109061182B - 一种胱氨酸蛋白酶抑制剂c检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒及其检测方法，包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1包含如下组分：第一缓冲液、第一表面活性剂、无机盐、促凝剂、防腐剂；所述试剂R2包含如下浓度的组分：第二缓冲液、抗冻剂、稳定剂、第二表面活性剂、封闭剂、乳胶颗粒抗人CysC抗体结合乳液、防腐剂。本发明属于生物检测技术领域，本发明提供的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒在提高胶乳试剂稳定性的同时兼顾了检测灵敏度和线性范围，显著提高了测定试剂的灵敏度和稳定性，具有良好的抗冻性能，可适用于各类全自动生化分析仪进行分析，适应性好。

Description

一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
胱抑素C(Cystatin C，简称Cys C)亦称半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中,是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为13.3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其在血液中的浓度由肾小球滤过决定，而不依赖性别、年龄、饮食等外来因素，是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。正常情况下，Cys C在血清和血浆中的浓度为0.51-1.09mg/L(参考范围)。当肾功能受损时，Cys C在血液中的浓度随肾小球滤过率变化而变化。肾衰时，肾小球滤过率下降，Cys C在血液中浓度可增加10倍以上；若肾小球滤过率正常，而肾小管功能失常时，会阻碍Cys C在肾小管吸收并迅速分解，使尿中的浓度增加100倍以上。
近年来，Cys C被广泛应用于糖尿病肾病肾脏滤过功能早期损伤的评价、高血压肾功能损害早期诊断、肾移植病人肾功能的恢复情况评估、血液透析患者肾功能改变监测、老年人肾功能评价、儿科肾病的诊断、肿瘤化疗中肾功能的监测等。基于Cys C的特性和临床应用价值，加之Cys C在血清中的浓度较低，对Cys C的测定方法提出了分析灵敏度及特异性的高要求。
Cys C检测的常用方法是胶乳免疫比浊法，该方法为均相测定，优于单向免疫扩散法等非均相检测方法，具有检测快速精准、灵敏度高、特异性强、精密度好、成本较低，且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定等优点。该方法检测的基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。
现有的胶乳免疫比浊法，部分采用化学偶联法将特异性抗体结合于多种粒径组合的复合胶乳上，虽可兼顾检测灵敏度和线性范围，但胶乳试剂制备操作繁琐，易导致复合胶乳重复性差、稳定性差等问题，且胶乳试剂制备过程中，多采用超声波处理技术及离心与重悬，操作繁琐，制备时间较长，试剂均一性和稳定性较难控制。
此外，胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)检测试剂盒属于临床生化诊断试剂盒，需要在低温(2～8℃)状态下贮存及运输，否则会破坏试剂的稳定性，进而影响检测准确性。目前，临床生化诊断试剂盒的冷链运输需要专门的冷链运输工具，包括冷藏车、冷藏船、冷藏集装箱等，但这些运输工具结构复杂，且成本极高，仅仅适合大批量运输，难以满足单个或小批量多次运输的需求。对此，市面上销售的胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定试剂盒，在小批量运输过程中普遍采用具有隔热、防水、抗震、抗老化和价格低廉等特点的独立泡沫保温箱，添加若干块在-20℃～-30℃预冷的冰袋，再将胱氨酸蛋白酶抑制剂C测定试剂盒放入泡沫保温箱内的方式进行贮运或运输。
中国专利申请CN 102353770A公开了一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.01～1.5μm，该检测试剂盒制备过程中涉及多次超声分散，可能存在重复性差及操作复杂的问题，不具备耐候性，可能存在贮运或运输过程中质量受影响的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)检测试剂盒，该试剂盒基于胶乳免疫透射比浊法(PETIA)，采用化学偶联法将特异性抗体结合于单一粒径的胶乳颗粒表面，避免了多种粒径组合复合胶乳的重复性差及操作繁琐的问题，同时兼顾了检测灵敏度和线性范围，无需多次超声、离心和重悬即可获得稳定的胶乳试剂。
此外，发明人在对小批量运输过程中的独立泡沫保温箱等贮运或运输方式进行研究发现，这类贮运或运输方式存在以下不足：包装简易，恒温效果差，如果试剂盒的位置放置不是非常合理，运输过程中会因震荡或挤压造成局部与冰袋直接接触，因冰袋在-20℃～-30℃预冷，当冰袋放入泡沫保温箱时，受温度直接传导效应，泡沫保温箱和生化诊断试剂盒瞬时温度会低于0℃，从而极可能导致试剂盒产生冻结，使试剂盒中相关组分受到严重影响而达不到预期要求或变质，影响其使用。因此，具备抗冻性能的胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)检测试剂盒，对于保障试剂盒在贮运或运输过程中的质量稳定具有重要意义。
发明人通过大量实验筛选出适合反应体系的抗冻剂，即使胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)检测试剂盒的温度低于0℃，甚至在-20℃的低温下贮存1周，也能有效保证试剂盒中试剂的稳定性。同时该检测试剂盒的检测灵敏度高、特异性强、精密度好、成本较低，可以实现对Cys C的准确检测。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。
本发明提供一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1包含如下浓度的组分：第一缓冲液20～100mmoL/L、第一表面活性剂10g/L～50g/L、无机盐10g/L～50g/L、促凝剂1g/L～15g/L、防腐剂0.05g/L～2g/L；所述试剂R2包含如下浓度的组分：第二缓冲液80～160mmoL/L、抗冻剂5g/L～50g/L、稳定剂50g/L～120g/L、第二表面活性剂5g/L～30g/L、封闭剂5g/L～30g/L、乳胶颗粒抗人CysC抗体结合乳液0.05g/L～0.2g/L、防腐剂0.05g/L～2g/L。
优选地，试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
优选地，所述试剂R1包含如下浓度的组分：第一缓冲液30～80mmoL/L、第一表面活性剂15g/L～40g/L、无机盐20g/L～40g/L、促凝剂5g/L～8g/L、防腐剂0.1g/L～1g/L；所述试剂R2包含如下浓度的组分：第二缓冲液120～160mmoL/L、抗冻剂5g/L～30g/L、稳定剂60g/L～100g/L、第二表面活性剂5g/L～25g/L、封闭剂10g/L～30g/L、乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液0.05g/L～0.15g/L、防腐剂0.1g/L～1g/L。
更优选地，所述试剂R1包含如下浓度的组分：第一缓冲液50mmoL/L、第一表面活性剂30g/L、无机盐25g/L、促凝剂8g/L、防腐剂0.5g/L；所述试剂R2包含如下浓度的组分：第二缓冲液150mmoL/L、抗冻剂10g/L、稳定剂80g/L、第二表面活性剂10g/L、封闭剂20g/L、乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液0.1g/L、防腐剂0.5g/L。
优选地，所述抗冻剂为甜菜碱。通过加入一定量的甜菜碱，在起到抗冻效果的同时，不会对试剂盒的检测性能造成影响或干扰。
优选地，所述第一缓冲液为甘氨酸缓冲液，所述第二缓冲液为磷酸盐缓冲液150mmoL/L，所述无机盐为NaCl，所述促凝剂为聚乙二醇8000，所述第一表面活性剂为Tween-20，所述第二表面活性剂为Tween-20，所述封闭剂为牛血清白蛋白，所述稳定剂为甘油，所述防腐剂为Proclin 300。
优选地，所述乳胶颗粒抗人CysC抗体结合乳液是由羧基化胶乳微球制得，所述羧基化胶乳微球的平均粒径为80～200nm；更优选地，所述羧基化胶乳微球的平均粒径为120nm。
优选地，所述乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液的制备方法包括如下步骤：
1)取1mL～2mL羧基化胶乳微球，加甘氨酸缓冲液至5mL～8mL；
2)加入1mL～3mL 22g/L的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1mL～3mL 8.5g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)进行活化，搅拌均匀后，进行第一次孵育，得到活化的聚苯乙烯胶乳微球颗粒；
3)加入3mL～6mL磷酸盐缓冲液，室温搅拌均匀，以抗人Cys C单克隆抗体与所述聚苯乙烯胶乳微球颗粒的质量比为(0.01～0.1)：1的比例加入抗人Cys C单克隆抗体，进行第二次孵育；
4)第二次孵育后，加入1mL～3mL终止液终止反应，室温下搅拌均匀，即得。
优选地，所述终止液为含20％(W/V)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述第一次孵育的温度为37℃，时间为20min；所述第二次孵育的温度为37℃，时间为4h。
优选地，所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒还包括血清标准品。
此外，本发明还提供胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：分离血清样品，向血清样品中加入试剂R1，混匀，孵育3～5min后，加入R2混匀孵育20～30s后，于600nm波长下检测吸光度值A1，5min后，于700nm波长下检测吸光度值A2，通过血清标准品数据建立标准曲线，计算胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明提供一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，采用胶乳免疫比浊法，用化学偶联法将特异性抗体结合于单一粒径的胶乳颗粒表面，通过特定的制备方法和优化反应体系，无需多次离心和重悬，无需超声波处理，即可获得稳定的胶乳试剂，同时兼顾了检测灵敏度和线性范围，显著提高了测定试剂的灵敏度和稳定性，可适用于各类全自动生化分析仪进行分析，适应性好。
(2)现有技术常使用聚乙二醇6000，但要求的用量通常是10g/L以上，比本发明更高；本发明通过添加了聚乙二醇8000作为促凝剂，并调整其用量为5～8g/L，避免了因聚合物过多造成的非特异性反应和因聚合物太少导致的灵敏度过低，合适的聚合物用量有利于提高灵敏度和特异性。
(3)本发明试剂盒特地添加了抗冻剂甜菜碱，并调整其用量为5～30g/L，有效提高了试剂的稳定性。即使胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒的温度低于0℃，甚至低至-20℃贮存1周，也能有效保证其试剂的稳定性，同时其检测灵敏度高、特异性强、精密度好、成本较低，可以实现对Cys C的准确检测。
(4)本发明试剂盒可在具备有400-800nm波长的全自动生化分析仪上检测血液中胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)的含量，检测方法的重复性好，快速精准，自动化程度高，大大提高工作效率，且对检测样本的用量要求少，可适用于少量样本和急诊样本的测定。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
本发明中，所涉及的组分或材料均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。本发明中的浓度，除非明确指出，均指质量浓度。
实施例一 乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液的制备
乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液的制备方法包括如下步骤：
1)取1mL粒径为120nm且固含量为10％的羧基化胶乳微球，加甘氨酸缓冲液至5mL；
2)加入1mL 22g/L的N-羟基丁二酰亚胺和1mL 8.5g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化，搅拌均匀后，进行第一次孵育，温度为37℃，时间为20min，得到活化的聚苯乙烯胶乳微球颗粒；
3)加入3mL磷酸盐缓冲液，室温300r/min的转速搅拌均匀，以抗人Cys C单克隆抗体与所述聚苯乙烯胶乳微球颗粒的质量比为0.04：1的比例加入抗人Cys C单克隆抗体，进行第二次孵育，孵育的温度为37℃，时间为4h；
4)第二次孵育后，加入1.5mL终止液终止反应，终止液为含20％(W/V)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，室温下搅拌3h，即得，4℃保存备用。
实施例二 乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液的制备
乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液的制备方法包括如下步骤：
1)取2mL粒径为120nm且固含量为10％的羧基化胶乳微球，加甘氨酸缓冲液至5mL；
2)加入3mL 22g/L的N-羟基丁二酰亚胺和3mL 8.5g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化，搅拌均匀后，进行第一次孵育，温度为37℃，时间为20min，得到活化的聚苯乙烯胶乳微球颗粒；
3)加入6mL磷酸盐缓冲液，室温300r/min的转速搅拌均匀，以抗人Cys C单克隆抗体与所述聚苯乙烯胶乳微球颗粒的质量比为0.1：1的比例加入抗人Cys C单克隆抗体，进行第二次孵育，孵育的温度为37℃，时间为4h；
4)第二次孵育后，加入3mL终止液终止反应，终止液为含20％(W/V)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，室温下搅拌3h，即得，4℃保存备用。
实施例三 胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒及检测方法
胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2；试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
R1：甘氨酸缓冲液50mmoL/L、NaCl 25g/L、聚乙二醇8000 8g/L、Tween-20 30g/L、Proclin-300 0.5g/L；
R2：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、实施例一制得的乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液0.1g/L、Tween-20 10g/L、牛血清白蛋白(BSA)20g/L、甘油80g/L、甜菜碱10g/L、Proclin3000.5g/L。
胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：分离血清样品，向血清样品中加入试剂R1，混匀，孵育4min后，加入R2混匀孵育25s后，于600nm波长下检测吸光度值A1，5min后，于700nm波长下检测吸光度值A2，通过血清标准品数据建立标准曲线，计算胱氨酸蛋白酶抑制剂C的含量。
实施例四 胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒及检测方法
胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2；试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
R1：甘氨酸缓冲液40mmoL/L、NaCl 40g/L、聚乙二醇8000 6g/L、Tween-20 20g/L、Proclin 300 0.5g/L；
R2：磷酸盐缓冲液120mmoL/L、实施例一制得的乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液0.15g/L、Tween-20 15g/L、牛血清白蛋白(BSA)20g/L、甘油70g/L、甜菜碱15g/L、Proclin300 0.5g/L。
胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒的检测方法同实施例三。
实施例五 胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒及检测方法
胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2；试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
R1：甘氨酸缓冲液50mmoL/L、NaCl 25g/L、聚乙二醇8000 8g/L、Tween-20 30g/L、Proclin 300 0.5g/L；
R2：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、实施例一制得的乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液0.1g/L、Tween-20 10g/L、牛血清白蛋白(BSA)20g/L、甘油80g/L、甜菜碱20g/L、Proclin300 0.5g/L。
对比例1胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒及检测方法
胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2；试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
R1：甘氨酸缓冲液50mmoL/L、NaCl 25g/L、聚乙二醇8000 8g/L、Tween-20 30g/L、Proclin 300 0.5g/L；
R2：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、实施例一制得的乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液0.1g/L、Tween-20 10g/L、牛血清白蛋白(BSA)20g/L、甘油80g/L、Proclin 300 0.5g/L。
对比例1与实施例三相比，试剂R2不含甜菜碱。
对比例2胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒及检测方法
胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2；试剂R1与试剂R2的体积比为4:1。
R1：甘氨酸缓冲液50mmoL/L、NaCl 25g/L、聚乙二醇8000 8g/L、Tween-20 30g/L、Proclin 300 0.5g/L；
R2：磷酸盐缓冲液150mmoL/L、实施例一制得的乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液0.1g/L、Tween-20 10g/L、牛血清白蛋白(BSA)20g/L、甘油80g/L、乙二醇10g/L、Proclin300 0.5g/L。
对比例2与实施例三相比，试剂R2中用乙二醇替代甜菜碱。
实施例六本发明试剂盒的准确度分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪；
检测样本：40例随机血清样本和一份Cys C血清样本(靶值为4.36mg/L)；
对照试剂盒：国家食品药品监督管理局已批准上市的某知名厂家胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒(胶乳免疫比浊法)(包括试剂R1和R2，但成分与本发明不同，以下简称为对照试剂)；
将本发明实施例三、对比例1、对比例2检测试剂盒同时放入2～8℃(正常存放条件为2～8℃)、-20℃冷冻1天、-20℃冷冻7天进行抗冻试验，分别同时定标后同时测定40例血清样品，以考察试剂盒中组分和性能的稳定性，结果如表1-3所示。
表1实施例三在不同条件下保存7天后的样品检测结果(单位：mg/L)
Figure BDA0001753178510000101
表2对比例1在不同条件下保存7天后的样品检测结果(单位：mg/L)
Figure BDA0001753178510000111
表3对比例2在不同条件下保存7天后的样品检测结果(单位：mg/L)
Figure BDA0001753178510000112
Figure BDA0001753178510000121
从表1-3可知，未冷冻时，实施例三、对比例1、对比例2的40例样品检测结果平均值分别为1.40mg/L、1.38mg/L、1.39mg/L，三者检测结果基本相当，说明本实施例三中甜菜碱的加入不会对正常检测造成影响或干扰；经-20℃冷冻处理1天后，实施例三的检测结果平均值为1.38mg/L，对比例1的检测结果平均值为0.84mg/L，对比例2的检测结果平均值为1.07mg/L；经-20℃冷冻处理7天后，实施例三的检测结果平均值为1.37mg/L，对比例1的检测结果平均值为0.82mg/L，对比例2的检测结果平均值为1.02mg/L。
对比例1经-20℃冷冻处理1天后的样品检测结果均显著下降，平均下降幅度达到了39.13％；对比例2由于含有一定量的乙二醇，起到一定的抗冻作用，经-20℃冷冻处理1天后的样品检测结果平均下降幅度为23.02％，较对比例1有所改善，但仍不理想；而实施例三由于含有一定量的甜菜碱作为抗冻剂，经-20℃冷冻处理1天后的样品检测结果平均下降幅度仅为1.43％，属于合理范围，且较对比例1、对比例2有明显改善；经-20℃冷冻处理7天后的实施例三、对比例1、对比例2的样品检测结果平均下降幅度分别为2.14％、40.58％和26.62％，与经-20℃冷冻处理1天后的样品检测结果无明显差异，可能原因：试剂在-20℃冷冻处理1天后至7天内，试剂尚处于稳定状态，试剂组分变化较小。平均下降幅度＝(未冷冻时的均值－冷冻一定天数的均值)/未冷冻时的均值。
以上结果表明，添加乙二醇的对比例2试剂抗冻性能好于未添加乙二醇的对比例1，添加甜菜碱的实施例三试剂抗冻性能好于未添加甜菜碱的对比例1和添加乙二醇的对比例2，可见，甜菜碱作为本发明试剂盒成分的抗冻剂显著增强了试剂的抗冻能力，在试剂冷链运输过程中能有效保证试剂的稳定性。
用实施例三、对比例1、对比例2的试剂盒和对照试剂盒按各自的检测方法分别同时定标后同时一份Cys C血清样本(靶值为4.36mg/L)，结果如表4所示。
表4Cys C血清样本检测结果(单位：mg/L)
Figure BDA0001753178510000131
结果显示，根据实施例三、对比例1、对比例2检测结果计算出的相对偏差分别为0.69％、1.10％、1.07％，表明本发明所述方法检测结果与对照试剂盒结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)，而且实施例三为最优的选择。
实施例七 本发明试剂盒及方法的灵敏度分析
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪
检测样本：1份纯化水、1份浓度为1.02mg/L的Cys C低值样本
用实施例三的试剂和对照试剂(某厂家Cys C检测试剂盒)用各自的检测方法同时定标同时对每份待测样本重复检测20次，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差(SD)；水的吸光度平均值加上2SD作为最低检出限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和1.02mg/L样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度，即灵敏度。检测结果见表5。
表5实施例三试剂盒与对照试剂盒的灵敏度分析结果(单位：mg/L)
Figure BDA0001753178510000132
Figure BDA0001753178510000141
结果显示，本发明实施例三的灵敏度为0.018mg/L，对照试剂盒的灵敏度为0.029mg/L，表明本发明试剂盒具有较高的检测灵敏度。
灵敏度＝(水吸光度差值平均值+2SD)*样本浓度/样本吸光度差值平均值
实施例八：本发明试剂盒及方法的精密度分析：
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪；
检测样本：1份临床血清样本(低值样本)、1份Cys C血清样本(2.00mg/L)(高值样本)；
用实施例三的试剂和检测方法对每份待测样本重复检测10次，检测结果见表6。
表6实施例三的精密度分析结果(单位：mg/L)
Figure BDA0001753178510000142
Figure BDA0001753178510000151
结果显示，本发明的精密度：CV低值为2.61、CV高值为1.36，均小于等于10％，而对照试剂CV低值为3.37、CV高值为1.81，表明本发明所述方法具有较高的精密度。
实施例九：本发明试剂盒及方法的线性分析：
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪
检测样本：高Cys C血清样本(8.0mg/L)
将高Cys C血清样本(8.0mg/L)用校准品稀释液稀释成6个不同浓度，分别为0mg/L、0.5mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L、7.0mg/L，采用实施例三的检测方法对上述样品的每个浓度进行检测，每个浓度检测三次，计算相关系数R值，实施例三的检测结果见表7。
表7实施例三的线性分析结果(单位：mg/L)
Figure BDA0001753178510000152
结果显示，根据实施例三检测结果得到的回归方程为y＝1.0183x+0.0095，相关系数R2＝0.9997，表明本发明试剂在0mg/L～8mg/L范围内具有良好的线性度。
实施例十：本发明试剂盒及方法的稳定性分析：
不同检测试剂的加速稳定性考察：
试验仪器：日立7170全自动生化分析仪；
检测样本：40例随机血清样本；
将2～8℃、-20℃冷冻1天、-20℃冷冻7天的本发明实施例三检测试剂进行37度加速破坏性实验，以考察其组分的稳定性，结果如表8-9所示。
表8未冷冻的实施例三经加速破坏性实验1周后的样品检测结果(单位：mg/L)
Figure BDA0001753178510000161
表9经-20℃冷冻的实施例三经加速破坏性实验1周后的样品检测结果(单位：mg/L)
Figure BDA0001753178510000171
从表8-9可知，未加速时，2～8℃、-20℃冷冻1天、-20℃冷冻7天的实施例三的40例样品检测结果平均值分别为1.40mg/L、1.38mg/L、1.37mg/L，三者结果无明显差异；经37度加速破坏性实验1周后，2～8℃、-20℃冷冻1天、-20℃冷冻7天的实施例三的检测结果平均值分别为1.35mg/L、1.30mg/L、1.24mg/L，较未加速时，检测结果平均值下降幅度分别为3.57％、5.80％、9.48％，均小于10％，属于合理范围。平均下降幅度＝(未加速时的均值－加速1周的均值)/未加速时的均值。
以上结果表明，实施例三由于含有一定量的甜菜碱作为抗冻剂，经-20℃冷冻1天、-20℃冷冻7天，再经破坏性实验1周后的样品检测结果均未发生明显变化，且与2～8℃的检测结果基本相当，属于合理范围。可见，一定量的甜菜碱的添加不仅增强了本发明试剂盒成分的抗冻性，也能有效的保证试剂的稳定性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1由如下浓度的组分组成：第一缓冲液20～100mmoL/L、第一表面活性剂10g/L～50g/L、无机盐10g/L～50g/L、促凝剂1g/L～15g/L、防腐剂0.05g/L～2g/L；所述试剂R2由如下浓度的组分组成：第二缓冲液80～160mmoL/L、抗冻剂5g/L～50g/L、稳定剂50g/L～120g/L、第二表面活性剂5g/L～30g/L、封闭剂5g/L～30g/L、乳胶颗粒抗人CysC抗体结合乳液0.05g/L～0.2g/L、防腐剂0.05g/L～2g/L；
所述抗冻剂为甜菜碱；
所述第一缓冲液为甘氨酸缓冲液，所述第二缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述无机盐为NaCl，所述促凝剂为聚乙二醇8000，所述第一表面活性剂为Tween-20，所述第二表面活性剂为Tween-20，所述封闭剂为牛血清白蛋白，所述稳定剂为甘油，所述防腐剂为Proclin 300；
所述乳胶颗粒抗人CysC抗体结合乳液是由羧基化胶乳微球制得，所述羧基化胶乳微球的平均粒径为80～200nm；
所述乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液的制备方法包括如下步骤：
1)取1mL～2mL羧基化胶乳微球，加甘氨酸缓冲液至5mL～8mL；
2)加入1mL～3mL 22g/L的N-羟基丁二酰亚胺和1mL～3mL 8.5g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化，搅拌均匀后，进行第一次孵育，得到活化的聚苯乙烯胶乳微球颗粒；
3)加入3mL～6mL磷酸盐缓冲液，室温搅拌均匀，以抗人Cys C单克隆抗体与所述聚苯乙烯胶乳微球颗粒的质量比为(0.01～0.1)：1的比例加入抗人Cys C单克隆抗体，进行第二次孵育；
4)第二次孵育后，加入1mL～3mL终止液终止反应，室温下搅拌均匀，即得。
2.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1包含如下浓度的组分：第一缓冲液30～80mmoL/L、第一表面活性剂15g/L～40g/L、无机盐20g/L～40g/L、促凝剂5g/L～8g/L、防腐剂0.1g/L～1g/L；所述试剂R2包含如下浓度的组分：第二缓冲液120～160mmoL/L、抗冻剂5g/L～30g/L、稳定剂60g/L～100g/L、第二表面活性剂5g/L～25g/L、封闭剂10g/L～30g/L、乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液0.05g/L～0.15g/L、防腐剂0.1g/L～1g/L。
3.根据权利要求2所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1包含如下浓度的组分：第一缓冲液50mmoL/L、第一表面活性剂30g/L、无机盐25g/L、促凝剂8g/L、防腐剂0.5g/L；所述试剂R2包含如下浓度的组分：第二缓冲液150mmoL/L、抗冻剂10g/L、稳定剂80g/L、第二表面活性剂10g/L、封闭剂20g/L、乳胶颗粒抗人Cys C抗体结合乳液0.1g/L、防腐剂0.5g/L。
4.根据权利要求1所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：所述终止液为含20％(W/V)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；所述羧基化胶乳微球的平均粒径为120nm；所述第一次孵育的温度为37℃，时间为20min；所述第二次孵育的温度为37℃，时间为4h。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的胱氨酸蛋白酶抑制剂C检测试剂盒，其特征在于：还包括血清标准品。
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