CN103645323B - 一种胱抑素c检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种胱抑素c检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学免疫体外诊断领域，特别是一种检测血清中的胱抑素C检测试剂盒。其包括试剂R1，试剂R2及校准品。所述试剂R1，其组分为：Tris缓冲液0.01-0.05mol/L，PEG6000 10-40g/L，NaN30.5-1.5g/L，氯化钠12-20g/L，pH值8.0-8.5。所述R2试剂，其组分为：Tris缓冲液0.01-0.02mol/L，羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒0.5-3.0g/L。所述校准品为胱抑素C含量为0.1,0.5,1.0,2.0，4.0和8.0mg/L的六个梯度标准品，溶液为0.01mol/L的Tris缓冲液。本发明的试剂盒组成简单、稳定性好、准确度高。

Description

一种胱抑素C检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学免疫体外诊断领域，特别是一种检测血清中的胱抑素C检测试剂盒。
背景技术
肾脏疾病是临床上一种常见的疾病，各种原因导致的肾功能损害是进展为终末性肾病及心血管疾病的危险因素。唯一能阻止肾脏疾病恶化的方法就是早诊断、治疗以逆转损伤的肾功能。
胱抑素C是一种非糖化的蛋白，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂的一种，它由大多数有核细胞以一种恒定的方式生成。其分子量小，生成率稳定，由于其在血清中的浓度与肾小球滤过率（GFR）有密切的关系，并且对肾小球滤过率比肌酐更为敏感。因此，胱抑素C对测定肾小球滤过率有及其重要的意义。
胶乳颗粒增强比浊法（particle-enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液透光性能（即吸光度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA 法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。
由于血清胱抑素C的含量很低，其测定方法需要较高的灵敏度和特异性。由最初免疫电泳的定性检测，到放射免疫、荧光免疫和酶免疫的定量检测，以及到免疫比浊的自动化检测，发展十分迅速。单向免疫扩散（SRID）、放射免疫测定法（RIA）、荧光免疫测定发（FIA）、时间分辨荧光免疫测定法（TRFIA）、酶联免疫测定法（ELISA）、胶乳颗粒法、颗粒增强透射免疫比浊法（PETIA）、颗粒增强散射免疫比浊法（PENIA）。目前，胶乳颗粒增强比浊法是最为普遍通用的方法，但是胶乳颗粒增强比浊法最低检出限只能达到0.1mg/l，线性只能达到8mg/l，在临床应用上存在着局限性。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，发明提供了一种胱抑素C的检测试剂盒，以达到操作简便、灵敏度高、特异性好，快速、测定结果准确可靠的目的。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种胱抑素C 的检测试剂盒，其包括试剂R1，试剂R2及校准品。
所述试剂R1，其组分为：Tris缓冲液 0.01-0.05mol/L，PEG6000 10-40g/L，NaN3 0.5-1.5g/L，氯化钠12-20g/L，pH值8.0-8.5。
所述R2试剂，其组分为：Tris缓冲液 0.01-0.02mol/L，羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒 0.5-3.0g/L，pH值7.0-7.4。
所述校准品为胱抑素C含量为0.1,0.5,1.0,2.0，4.0和8.0mg/L的六个梯度标准品，溶液为0.01mol/L的Tris缓冲液。
进一步地，所述试剂R1中，其组分优选为：Tris缓冲液 0.01mol/L，PEG6000 25g/L，NaN3 1.0g/L，氯化钠 16g/L，pH值8.2。
进一步地，所述试剂R2中，其组分优选为：Tris缓冲液 0.01-0.02mol/L，羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒 1.0g/L，pH值7.2。
在本发明优选的实施方案中，所述的羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒中，羊抗人胱抑素C多克隆抗体与聚苯乙烯胶乳的质量比为0.5:1-2；更优选的是0.5:1，所述的聚苯乙烯胶乳优选为羧基聚苯乙烯胶乳颗粒。
进一步地，所述聚苯乙烯胶乳是粒径为30-50nm的聚苯乙烯胶乳和粒径为100-140nm的聚苯乙烯胶乳混合而成，粒径为30-50nm的聚苯乙烯胶乳与粒径为100-140nm的聚苯乙烯胶乳的质量比为1:3。
进一步地，聚苯乙烯胶乳与羊抗人胱抑素C多克隆抗体的包被采用物理吸附法或化学交联法；更优选的是化学交联法。在化学交联包被中，采用活化剂对聚苯乙烯胶乳进行活化，所述活化剂为N,N'-羰基二咪唑（CDI）；CDI与聚苯乙烯胶乳中羧基的摩尔比为0.5:1。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述试剂盒的方法，具体步骤如下：
（1）试剂R1的制备：在Tris缓冲液中加入相应重量的PEG6000和氯化钠混匀后，再加入NaN3，调节pH值即得；
（2）试剂R2的制备：加入CDI对聚苯乙烯胶乳活化12min，18000g/min离心25min，弃上清，加PB缓冲液溶解，加羊抗人胱抑素C多克隆抗体室温震荡反应1小时，18000g/min离心25min，弃上清，加入0.01mol/L的Tris缓冲液即得；
（3）校准品的制备：分别去相应含量的胱抑素C加入到0.01mol/L的Tris缓冲液中，得终浓度为0.1,0.5,1.0,2.0，4.0和8.0mg/L的六个梯度校准品。
本发明的胱抑素C的检测试剂盒相较于现有技术，具有如下优势：
1. 采用两种不同粒径范围的聚苯乙烯胶乳，两者在特定比例范围内使试剂盒灵敏度、精密度及线性均表现较好。
2. 在抗体与胶乳的包被中采用化学偶连法，采用CDI做为聚苯乙烯胶乳的活化剂，避免了传统的活化剂EDC/NHS出现的胶乳颗粒制备后发生沉淀、稳定性不好的技术问题，并且提高的试剂盒的灵敏度、精密度及稳定性。
3. 本发明的试剂盒组成简单、稳定性好、准确度高。
综上所述，本发明的胱抑素C的检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、准确性高、抗干扰能力强及线性好等优点。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
试剂R1的制备：在Tris缓冲液中加入相应重量的PEG6000和氯化钠混匀后，再加入NaN3，调节pH值即得；试剂R1的组分为：
试剂R2的制备：加入CDI对聚苯乙烯胶乳活化12min，18000g/min离心25min，弃上清，加PB缓冲液溶解，加羊抗人胱抑素C多克隆抗体室温震荡反应1小时，18000g/min离心25min，弃上清，加入0.01mol/L的Tris缓冲液即得；试剂R2的组分为：
校准品的制备：分别去相应含量的胱抑素C加入到0.01mol/L的Tris缓冲液中，得终浓度为0.1,0.5,1.0,2.0，4.0和8.0mg/L的六个梯度校准品。
将上述试剂分别包装，即得胱抑素C的检测试剂盒
实施例2-5
除各试剂组分外，其他均同实施例1，具体组分如下：
试剂R1组成为：
试剂R2组成为：
实施例6
实施例1-5制备的检测试剂盒的最低检测限试验
采用日立7080全自动生化分析仪和本发明试剂盒测定已知浓度的人血清样本和空白溶液（生理盐水或精制水），具体方法为：
混匀在37℃孵育30秒后，读取吸光度A1,继续孵育5分钟后，读取吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。           
分析方法为：两点终点法，主波长546nm，副波长700nm，
实施例1制备的试剂盒灵敏度检测结果如下：
本发明制备的试剂盒最低检出限为：[微软用户1]
实施例2-5制备的试剂盒的最低检出限见下表：
实施例7 实施例1-5制备的试剂盒的稳定性试验
在2-8℃贮存条件下，分别在0月、4月、8月、12月、24月和36月对同一血清样本进行测定，每个样本测10 值。血清样本分装后，储存于-20℃。4 月、8 月、12 月、24月、36月与0月相比，测得值差异小，并且任意时间点的CV值小于1.01%，说明本发明的检测试剂盒在2-8℃贮存条件下可稳定3年，具体结果见下表：
实施例8 实施例1-5制备的试剂盒的精密度试验
用本发明中的胱抑素C试剂盒检测低、中、高值3个胱抑素C含量的人血清样品各20次，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度和批间精密度均较好。
实施例3制备的试剂盒的批内精密度结果
实施例3制备的试剂盒的批间精密度结果
其他实施例制备的试剂盒的批内精密度（CV%在0.99-1.2之间）和批间精密度（相对极差%在0.9-1.3之间）均表现良好，数据在此不一一列出。
实施例9 实施例1-5制备的试剂盒的相关度试验
添加胱抑素C蛋白于无胱抑素C的空白血清中，胱抑素C在血清中的终浓度为15mg/l。用0.9％NaCl稀释血清，得到5个含不同浓度胱抑素C的血清样本。胱抑素C理论浓度分别为0.1 mg/l，0.5mg/l，1mg/l，2mg/l，4mg/l，8mg/l。把空白血清作为胱抑素C浓度为0的样本。每个样品用本发明中的胱抑素C试剂盒测3次，取均值。对测定值进行相关分析，以实施例3为例，本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到8mg/L，Y轴实测值，X轴理论值（胱抑素C的含量mg/L），相关系数的R2＝0.9999，回归方程为Y＝1.0072x-0.0089。说明本发明中胱抑素C试剂盒线性好。
 其他实施例制备的试剂盒的相关度数据（R2>0.999）均表现良好，数据在此不一一列出。

Claims (2)

1.一种胱抑素C的检测试剂盒，其特征在于，其包括试剂R1，试剂R2及校准品；具体组成如下：
试剂R1，其组分为：Tris缓冲液 0.01mol/L，PEG6000 25g/L，NaN3 1.0g/L，氯化钠 16g/L，pH值8.2；
R2试剂，其组分为：Tris缓冲液 0.01-0.02mol/L，羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒 1.0g/L，pH值7.2；所述的羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒中，羊抗人胱抑素C多克隆抗体与聚苯乙烯胶乳的质量比为0.5:1；聚苯乙烯胶乳与羊抗人胱抑素C多克隆抗体的包被采用化学交联法；所述的聚苯乙烯胶乳为羧基聚苯乙烯胶乳，所述化学交联法中，采用活化剂对聚苯乙烯胶乳进行活化，活化剂为N,N'-羰基二咪唑；N,N'-羰基二咪唑与所述羧基聚苯乙烯胶乳中羧基的摩尔比为0.5:1；
校准品为胱抑素C含量为0.1,0.5,1.0,2.0，4.0和8.0mg/L的六个梯度标准品，溶液为0.01mol/L的Tris缓冲液。
2.一种制备权利要求1所述的检测试剂盒的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）试剂R1的制备：在Tris缓冲液中加入相应重量的PEG6000和氯化钠混匀后，再加入NaN3，调节pH值即得；
（2）试剂R2的制备：加入CDI对聚苯乙烯胶乳活化12min，18000g/min离心25min，弃上清，加PB缓冲液溶解，加羊抗人胱抑素C多克隆抗体室温震荡反应1小时，18000g/min离心25min，弃上清，加入0.01mol/L的Tris缓冲液即得；
（3）校准品的制备：分别取相应含量的胱抑素C加入到0.01mol/L的Tris缓冲液中，得终浓度为0.1,0.5,1.0,2.0，4.0和8.0mg/L的六个梯度校准品。
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Denomination of invention: A cystatin C detection kit and its preparation method

Effective date of registration: 20230924

Granted publication date: 20150805

Pledgee: Xinchang Zhejiang rural commercial bank Limited by Share Ltd.

Pledgor: ZHEJIANG KUAKE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2023330002129

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