CN111521822A - 一种用于检测血清中胱抑素c含量的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种用于检测血清中胱抑素c含量的试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测血清中胱抑素C含量的试剂盒及其制备方法。本发明提供的试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；R1试剂中，含有Procline‑300 1g/L、吐温‑20 7.5g/L、PEG‑6000 30g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液；R2试剂是通过如下方法制备得到的：取含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，加入procline‑300和BSA，使procline‑300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。本发明提供的试剂盒基于胶乳增强免疫比浊法检测胱抑素C，具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、准确性好和线性范围宽的优点，可适用于自动化分析仪并且便于生产，适合于临床样本批量检测。

Description

一种用于检测血清中胱抑素C含量的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测血清中胱抑素C含量的试剂盒及其制备方法，具体涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法检测血清中胱抑素C含量的试剂盒及其制备方法。
背景技术
胱抑素C(Cystatin C，Cys C)是一种用于评价早期肾功能损伤的特异性高、准确性好且较为敏感的新指标，是反映肾小球滤过率(GFR)变化的理想标志物。
胱抑素C，又称为γ2痕迹碱性蛋白或后γ球蛋白，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的一种，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的成员之一，相对分子量为13.3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体内所有有核细胞产生，产生率恒定。1985年Simonsen等人发现胱抑素C可作为反映肾小球滤过率，且不受年龄、性别等其他因素的影响，是一种优良的内源性标志物。此外，胱抑素C也是心脑血管疾病、糖尿病肾病和先兆子痫的优良诊断标志物。胱抑素C的正常参考范围为0.6-1.03mg/L。
目前已知的胱抑素C测定方法有放射免疫法(RIA)、化学发光法、酶联免疫吸附法(ELISA)法等。放射免疫分析法步骤繁琐，试剂价格昂贵，需使用配套的仪器且存在放射性污染。酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测血清中胱抑素C含量的试剂盒及其制备方法。
本发明提供了一种制备抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的方法(简称方法甲)，包括如下步骤：
(1)25ml MES缓冲液与25ml胶乳微球混合，然后加入4.3ml 1％Triton X-100溶液，然后30℃反应15分钟(反应条件具体可为80rpm振荡)；
(2)向完成步骤(1)的体系中加入2.5ml 100mg/ml NHS水溶液并混匀，2min后加入2.5ml 50mg/ml EDC水溶液，然后30℃反应30分钟(反应条件具体可为80rpm振荡)；
(3)向完成步骤(2)的体系中加入125ml硼酸盐缓冲液，然后30℃反应3分钟(反应条件具体可为300rpm振荡)；
(4)向完成步骤(3)的体系中加入25ml CysC多克隆抗体溶液，然后30℃反应3小时(反应条件具体可为90rpm振荡)；
(5)向完成步骤(4)的体系中加入25ml封闭液，然后30℃反应40分钟(反应条件具体可为90rpm振荡)；
(6)完成步骤(5)后，用硼酸盐缓冲液定容至500ml，然后30℃反应15分钟(反应条件具体可为90rpm振荡)。
所述方法还包括如下步骤：
(7)完成步骤(6)后，置于37℃环境中孵育8-12小时(具体可为10小时)，得到含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，简称多抗胶乳微球液相。
方法甲中，胶乳微球和CysC多克隆抗体的原料配比为50mg：1.5mg。
多抗胶乳微球液相中，胶乳微球的浓度为2.5mg/ml，CysC多克隆抗体的浓度为0.075mg/ml(均以原料加入量计)。
将方法甲命名为稳态一步法。稳态一步法：整个反应过程都在均匀的胶体溶液环境中进行的交联方法称为稳态一步法。采用方法甲制备包被胱抑素C抗体的乳胶颗粒，简化了操作步骤，解决了胶乳分散问题，并提升了性能与稳定性。
胶乳微球的粒径为60-300nm，具体可为100-300nm。
胶乳微球的粒径为107nm。
胶乳微球具体为JSR Life Sciences公司的货号为P0115的产品，粒径为107nm，产品形式为液态，其中胶乳微球含量为50mg/ml。
CysC多克隆抗体溶液：取CysC多克隆抗体，用硼酸盐缓冲液稀释至1.5mg/ml。
CysC多克隆抗体：北京晶华生物技术有限公司，兔抗人CYSc抗体，产品形式为液态，其中抗体浓度为10mg/ml。
MES缓冲液为pH6.0、0.2mol/L的MES缓冲液。
1％Triton X-100溶液的制备方法：将1g Triton X-100溶于100ml水。
硼酸盐缓冲液(BBS)的制备方法：取硼酸2.23g、十水合四硼酸钠1.72g，溶于800ml水，调pH至8.3-8.5，用水定容至1L。
封闭液：100g/L BSA水溶液。
本发明还保护一种制备检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒的方法(简称方法乙)，包括如下步骤：
(1)采用方法甲制备含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相；
(2)制备R1试剂和R2试剂；
R1试剂中，含有Procline-300 1g/L、吐温-20 7.5g/L、PEG-6000 30g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；
R2试剂的制备方法：取步骤(1)制备的含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，加入procline-300和BSA，使procline-300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。
所述方法乙还包括如下步骤：制备标准品溶液。标准品溶液：含胱抑素C 20mg/L、Procline-300 1g/L、吐温-20 7.5g/L、PEG-6000 30g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒由分别独立包装的R1试剂和R2试剂组成。
检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒由分别独立包装的R1试剂、R2试剂和标准品溶液组成。
本发明还保护方法乙制备得到的试剂盒。
本发明还保护方法甲在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒为检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒。
本发明还保护方法甲制备得到的抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒。
本发明还保护一种检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；
R1试剂中，含有Procline-300 1g/L、吐温-20 7.5g/L、PEG-6000 30g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；
R2试剂是通过如下方法制备得到的：取方法甲制备得到的含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，加入procline-300和BSA，使procline-300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。
所述试剂盒还包括标准品溶液。标准品溶液：含胱抑素C 20mg/L、Procline-3001g/L、吐温-20 7.5g/L、PEG-6000 30g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
R1试剂的功能：提供反应环境、控制反应达到终点的时间和速率，保证功能组分的稳定性和反应活性，使抗原位点充分暴露(从而有利于抗原与CysC多克隆抗体充分结合)。R1试剂为液态试剂。
R2试剂的功能：特异性识别并结合血清中的胱抑素C抗原。R2试剂为液态，呈现均一乳白色。R2试剂稳定性好，在2-8度可以保存12个月。
以上任一所述试剂盒中，R1试剂和R2试剂均独立包装。
以上任一所述试剂盒中，R1试剂和R2试剂和标准品溶液均独立包装。
本发明提供的试剂盒，用于检测血液样本中的胱抑素C含量。本发明提供的试剂盒与市售进口的胱抑素C检测试剂盒相比，检测结果无显著差异，检测结果可靠，同时大大缩短了检测时间。本发明提供的试剂盒基于胶乳增强免疫比浊法检测胱抑素C，具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、准确性好和线性范围宽的优点，可适用于自动化分析仪并且便于生产，适合于临床样本批量检测。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
MES全称为：2-(4-吗啉)乙磺酸。EDC全称为：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。NHS全称为：N-羟基琥珀酰亚胺。
如无特殊说明书，MES缓冲液均为pH6.0、0.2mol/L的MES缓冲液。
实施例中所用的胶乳微球为JSR Life Sciences公司的货号为P0115的产品，粒径为107nm，产品形式为液态，其中胶乳微球含量为50mg/ml。
1％Triton X-100溶液的制备方法：将1g Triton X-100溶于100ml水。
硼酸盐缓冲液(BBS)的制备方法：取硼酸2.23g、十水合四硼酸钠1.72g，溶于800ml水，调pH至8.3-8.5，用水定容至1L。
CysC多克隆抗体：北京晶华生物技术有限公司，兔抗人CYSc抗体，产品形式为液态，其中抗体浓度为10mg/ml。CysC多克隆抗体溶液：取CysC多克隆抗体，用硼酸盐缓冲液稀释至1.5mg/ml。
封闭液：100g/L BSA水溶液。
实施例1、本发明试剂盒的制备
一、抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的制备(稳态一步法)
①25ml MES缓冲液与25ml胶乳微球混合，然后加入4.3ml 1％Triton X-100溶液，然后30℃、80rpm振荡反应15分钟。
②向完成步骤①的体系中加入2.5ml 100mg/ml NHS水溶液并混匀，2min后加入2.5ml 50mg/ml EDC水溶液，然后30℃、80rpm振荡反应30分钟。
③向完成步骤②的体系中加入125ml硼酸盐缓冲液，然后30℃、300rpm振荡反应3分钟。
④向完成步骤③的体系中加入25ml CysC多克隆抗体溶液，然后30℃、90rpm振荡反应3小时。
⑤向完成步骤④的体系中加入25ml封闭液，然后30℃、90rpm振荡反应40分钟。
⑥完成步骤⑤后，用硼酸盐缓冲液定容至500ml，然后30℃、90rpm振荡反应15分钟。
⑦完成步骤⑥后，置于37℃环境中孵育10小时，得到含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，简称多抗胶乳微球液相。
以上方法中，胶乳微球和CysC多克隆抗体的原料配比为50mg：1.5mg。
多抗胶乳微球液相中，胶乳微球的浓度为2.5mg/ml，CysC多克隆抗体的浓度为0.075mg/ml(均以原料加入量计)。
二、R2试剂的制备
R2试剂的制备方法：取步骤一制备的多抗胶乳微球液相，加入procline-300和BSA，使procline-300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。
三、R1试剂的制备
R1试剂：含Procline-300 1g/L、吐温-20 7.5g/L、PEG-6000 30g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
四、标准品溶液的制备
标准品溶液：含胱抑素C 20mg/L、Procline-300 1g/L、吐温-20 7.5g/L、PEG-600030g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
五、本发明试剂盒的组成
本发明试剂盒的组件包括：独立包装的R1试剂(步骤三制备)，独立包装的R2试剂(步骤二制备)，独立包装的标准品溶液(步骤四制备)。
六、试剂盒的使用方法
将6μl供试血液样本与180μl R1试剂混匀，然后37℃孵育5分钟，然后加入45μl R2试剂并混匀，然后室温孵育1分钟并读取吸光度A1(检测波长为546nm)，然后室温孵育3分钟并读取吸光度A2，计算吸光度差值(吸光度A2-吸光度A1)，将吸光度差值代入标准曲线方程，得到供试血液样本中的胱抑素C含量。供试血液样本为血清或血浆。
标准曲线方程的制备方法：将标准品溶液用生理盐水梯度稀释，得到各个稀释液；用稀释液代替供试血液样本进行上述步骤，建立以胱抑素C含量为自变量以吸光度差值为因变量的方程。
七、试剂盒的工作原理(胶乳增强免疫比浊法)
供试血液样本中的胱抑素C与抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒特异性结合，形成不溶性的抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，产生一定的浊度，浊度值与样本中的胱抑素C含量成正比。
实施例2、试剂盒的性能
一、灵敏度
取实施例1制备的试剂盒(即本发明的试剂盒)，将标准品溶液用生理盐水梯度稀释，得到各个稀释液。
将6μl稀释液与180μl R1试剂混匀，然后37℃孵育5分钟，然后加入45μl R2试剂并混匀，然后室温孵育1分钟并读取吸光度A1(检测波长为546nm)，然后室温孵育3分钟并读取吸光度A2，计算吸光度差值(吸光度A2-吸光度A1)。
胱抑素C浓度为0.4mg/L以上的稀释液，均可以检测到吸光度变化。具有良好的线性范围，线性范围为0.4-8.0mg/L。
二、准确性
从医院获取40例临床样本(血清)，分别采用实施例1制备的试剂盒或者对照试剂盒进行检测。对照试剂盒：生研CysC胶乳增强免疫比浊试剂盒(日本生研株式会社；批号：899071)。
结果见表1。
表1临床样本中的胱抑素C含量(单位为mg/L)
Figure BDA0002491701590000061
Figure BDA0002491701590000071
三、批间与批内准确度
定值血清样本：取临床血清样本，采用生研CysC胶乳增强免疫比浊试剂盒(日本生研株式会社；批号：899071)检测胱抑素C含量，然后根据检测值加入胱抑素C，使胱抑素C含量的理论值为8.0mg/L。
取三个生产批次的实施例1制备的试剂盒。
定值血清样本4℃保存，分别于保存前、保存1天后、保存15天后取样，采用实施例1制备的试剂盒并按说明书操作，检测其中的胱抑素C含量。
结果见表2。
表2定值血清样本中的胱抑素C含量检测值(单位为mg/L)
Figure BDA0002491701590000072
四、批间与批内精密度
高值血清样本：取临床血清样本，采用生研CysC胶乳增强免疫比浊试剂盒(日本生研株式会社；批号：899071)检测胱抑素C含量，为3.0mg/L。
低值血清样本：取临床血清样本，采用生研CysC胶乳增强免疫比浊试剂盒(日本生研株式会社；批号：899071)检测胱抑素C含量，为1.6mg/L。
血清样本4℃保存，分别于保存前、保存1天后、保存15天后取样，采用实施例1制备的试剂盒并按说明书操作，检测其中的胱抑素C含量。每个样本连续检测10次。
结果见表3。
表3血清样本中的胱抑素C含量检测值(单位为mg/L)
Figure BDA0002491701590000081
实施例3、对照试剂盒甲的制备
一、抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的制备(一步法)
①25ml MES缓冲液与25ml胶乳微球混合，然后加入2.5ml 50mg/ml NHS水溶液并混匀，2min后加入2.5ml 30mg/ml EDC水溶液，然后30℃、80rpm振荡反应30分钟。
②向完成步骤①的体系中加入25ml CysC多克隆抗体溶液，然后30℃、90rpm振荡反应1.5小时。
③完成步骤②后，离心，弃上清，用硼酸盐缓冲液洗涤沉淀物。
④完成步骤③后，取沉淀物，用硼酸盐缓冲液复溶至100ml，进行均质处理(均质处理即300W功率破碎10min)，然后加入25ml封闭液，然后30℃、90rpm振荡反应40分钟。
⑤完成步骤④后，用硼酸盐缓冲液定容至500ml，然后30℃、90rpm振荡反应15分钟。
⑥完成步骤⑤后，置于37℃环境中孵育10小时，得到含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相。
二、R2试剂的制备
R2试剂的制备方法：取步骤一制备的含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，加入procline-300和BSA，使procline-300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。
三、R1试剂的制备
同实施例1的步骤三。
四、标准品溶液的制备
同实施例1的步骤四。
五、对照试剂盒甲的组成
对照试剂盒甲的组件包括：独立包装的R1试剂(步骤三制备)，独立包装的R2试剂(步骤二制备)，独立包装的标准品溶液(步骤四制备)。
六、试剂盒的使用方法
同实施例1的步骤六。
实施例4、对照试剂盒乙的制备
一、抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的制备(两步法)
①25ml MES缓冲液与25ml胶乳微球混合，然后加入2.5ml 20mg/ml EDC水溶液，然后30℃、80rpm振荡反应15分钟。
②向完成步骤①的体系中加入25ml CysC多克隆抗体溶液，然后30℃、90rpm振荡反应1.5小时，然后加入2.5ml 50mg/ml NHS水溶液，然后30℃、90rpm振荡反应1小时。
③完成步骤②后，离心，弃上清，用硼酸盐缓冲液洗涤沉淀物。
④完成步骤③后，取沉淀，用硼酸盐缓冲液复溶至100ml，进行均质处理(均质处理即300W功率破碎10min)，然后加入25ml封闭液，然后30℃、90rpm振荡反应40分钟。
⑤完成步骤④后，用硼酸盐缓冲液定容至500ml，然后30℃、90rpm振荡反应15分钟。
⑥完成步骤⑤后，置于37℃环境中孵育10小时，得到含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相。
二、R2试剂的制备
R2试剂的制备方法：取步骤一制备的含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，加入procline-300和BSA，使procline-300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。
三、R1试剂的制备
同实施例1的步骤三。
四、标准品溶液的制备
同实施例1的步骤四。
五、对照试剂盒乙的组成
对照试剂盒乙的组件包括：独立包装的R1试剂(步骤三制备)，独立包装的R2试剂(步骤二制备)，独立包装的标准品溶液(步骤四制备)。
六、试剂盒的使用方法
同实施例1的步骤六。
实施例5、对照试剂盒的性能
分别采用实施例3制备的对照试剂盒甲和实施例4制备的对照试剂盒乙代替本发明的试剂盒，进行实施例2的步骤一的试验。
对照试剂盒甲的灵敏度为0.5mg/L，线性范围为0.5-7.5mg/L。
对照试剂盒乙的灵敏度为0.5mg/L，线性范围为0.5-7.5mg/L。
实施例6、胶乳颗粒与抗胱抑素C多克隆抗体的优化
一、多克隆抗体的选择(单因素实验)
多克隆抗体A1：霍尔姆斯(北京)诊断技术有限公司，产品货号C01P001。
多克隆抗体A2：上海领潮生物科技有限公司,产品货号L1K00105。
多克隆抗体A3：北京晶华生物技术有限公司,产品货号JH-ab-01。
多克隆抗体A4：厦门裕泰康进出口有限公司,产品货号IIC-CYS-G1。
多克隆抗体A5：北京爱必信生物技术有限公司,产品货号Abt-p-301。
ElISA法测试各个抗体的活性,计算比活，结果见表4。选择比活高的进行后续实验。
表4
Figure BDA0002491701590000101
结论：本发明选用的多克隆抗体为多克隆抗体A3。
二、胶乳微球的选择
通过离心物理方法对9种微球进行筛选。结果见表5。
表5
胶乳微球 20000rpm离心30min 微球粒径(nm)
JSR P0115 ++++ 96
成都仅硕PS110 +++ 110
Holmes H8004C + 80
Holmes H10016C ++ 100
Holmes H09525C + 95
Holmes H10806C ++ 108
江苏为度VD07PS041 +- 100
江苏为度VD08PS036 +++ 200
江苏为度VD08PS029 +++ 300
注：+代表微球与缓冲液分离程度，“+”越多分离越完全。
结论：本发明选择JSR P0115胶乳微球进行后续实验。
实施例7、胶乳颗粒与抗胱抑素C多克隆抗体的制备方法的优化
一、一步法制备参数的优化
1、抗体稀释缓冲体系
对比MES、HEPES、MES-Tris、HEPES-Tris、Tris、PBS、CB(碳酸盐缓冲液)等多个缓冲体系，经过实验论证发现多数抗体原料比较适合BBS(硼酸盐缓冲体系)。见表6。表6中，第一行为抗体浓度，第一列为缓冲体系。表中的数据为吸光度。
表6
0.0mg/L 0.5mg/L 1.0mg/L 2.0mg/L 4.0mg/L 8.0mg/L
CB 30 3020 1000 5252 15232 18951
PBS 12 20 12 25 24 30
Tris 17 168 748 2168 12058 15571
HEPES-Tris 15 200 1045 4568 13125 14126
MES-Tris 12 298 1234 4974 15791 16674
HEPES 5 20 100 358 468
BBS 17 271 948 4558 17952 25871
MES 3 12 60 238 320
2、封闭体系
对BSA作为主要封闭蛋白的体系进行了调整，最终确定了最适初始浓度以及最终浓度，并对缓冲体系进行了比较筛选，经过对PBS、BBS的对比，最终确定封闭体系可以不使用缓冲体系，这也降低了生产成本的繁琐性与成本。
3、交联剂的改进
对交联促进剂NHS以及交联剂EDC进行了使用浓度的摸索，确定了交联促进剂NHS与交联剂EDC的使用配比和使用量。一步法中需要使用交联促进剂NHS与交联剂EDC。一步法中NHS的用量为100mg/ml，EDC的用量为50mg/ml。EDC与NHS用量过多会发生聚沉，用量过少，交联率低。
4、交联比例的改进
胶乳微球和多克隆抗体的配比为50mg：1.5mg时，最优。
5、封闭蛋白的选择
对封闭蛋白以及乙醇胺进行了实验对比，选用BSA单独封闭效果最佳。见表7。表7中数据为吸光度。
表7
Figure BDA0002491701590000121
6、封闭蛋白用量的选择
封闭蛋白游离在体系里对试剂稳定性较好，所以用量以不发生聚沉为准，摸索后BSA采用100mg/ml。
二、二步法制备参数的优化
经摸索，两步法中可以只使用交联剂EDC。
经摸索，两步法中EDC的用量优选为50mg/ml。
实施例8、R2试剂的优化
见表8。表8中的数据为吸光度。
表8稳态一步法不同工艺所交联R2试剂的对比
0.0mg/L 0.5mg/L 1.0mg/L 2.0mg/L 4.0mg/L 8.0mg/L
对照试剂 6678 7153 7762 9475 14117 23073
自制1号R2 27421 27587 27680 27723 27817 28020
自制2号R2 8213 8637 9416 13304 25142 25491
自制3号R2 5810 6270 7140 9709 16637 24614
以上结果显示自制3号R2本底较低，线性较好为最优选择。自制3号R2即实施例1中的R2试剂。

Claims (10)

1.一种制备抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的方法，包括如下步骤：
(1)25ml MES缓冲液与25ml胶乳微球混合，然后加入4.3ml 1％Triton X-100溶液，然后30℃反应15分钟；
(2)向完成步骤(1)的体系中加入2.5ml 100mg/ml NHS水溶液并混匀，2min后加入2.5ml 50mg/ml EDC水溶液，然后30℃反应30分钟；
(3)向完成步骤(2)的体系中加入125ml硼酸盐缓冲液，然后30℃反应3分钟；
(4)向完成步骤(3)的体系中加入25ml CysC多克隆抗体溶液，然后30℃反应3小时；
(5)向完成步骤(4)的体系中加入25ml封闭液，然后30℃反应40分钟；
(6)完成步骤(5)后，用硼酸盐缓冲液定容至500ml，然后30℃反应15分钟。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
胶乳微球和CysC多克隆抗体的原料配比为50mg：1.5mg。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述方法还包括如下步骤：
(7)完成步骤(6)后，置于37℃环境中孵育8-12小时，得到含有抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒的液相，简称多抗胶乳微球液相。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：多抗胶乳微球液相中，胶乳微球的浓度为2.5mg/ml，CysC多克隆抗体的浓度为0.075mg/ml。
5.一种制备检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)采用权利要求3或4所述方法制备多抗胶乳微球液相；
(2)制备R1试剂和R2试剂；
R1试剂中，含有Procline-300 1g/L、吐温-20 7.5g/L、PEG-6000 30g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；
R2试剂的制备方法：取步骤(1)制备的多抗胶乳微球液相，加入procline-300和BSA，使procline-300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。
6.权利要求5所述方法制备得到的试剂盒。
7.权利要求1至4中任一所述方法在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒为检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒。
8.权利要求1至4中任一所述方法制备得到的抗胱抑素C多克隆抗体包被的胶乳颗粒。
9.一种检测血液样本中的胱抑素C含量的试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；
R1试剂中，含有Procline-300 1g/L、吐温-20 7.5g/L、PEG-6000 30g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；
R2试剂是采用如下方法制备得到的：取权利要求3或4所述方法制备得到的多抗胶乳微球液相，加入procline-300和BSA，使procline-300的浓度为1g/L、BSA的浓度为2g/L。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包括标准品溶液；
标准品溶液中，含胱抑素C 20mg/L、Procline-300 1g/L、吐温-20 7.5g/L、PEG-600030g/L、乙二胺四乙酸二钠6.98g/L，余量为pH8.0、20mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
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