CN103323596B - 髓过氧化物酶含量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种髓过氧化物酶含量检测试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被髓过氧化物酶抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水。本发明髓过氧化物酶含量检测试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、特异性强等诸多优点，且检测操作简便，适合于大规模推广和应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种人体内髓过氧化物酶含量的检测试剂盒及其制备方法，本发明还涉及该髓过氧化物酶测定试剂盒在检测人体内髓过氧化物酶含量的使用方法，属于人体内髓过氧化物酶含量的检测领域。
背景技术
髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）又称过氧化物酶，是一种重要的含铁溶酶体，存在于髓系细胞（主要是中性粒细胞和单核细胞）的嗜苯胺蓝颗粒中，是髓细胞的特异性标志。髓过氧化物酶（MPO）是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一。MPO是I相代谢酶。每个酶分子有两个铁素基团，顺磁共振波谱表明血红素中的铁是在甲酰基血红素部分。MPO的合成是粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并贮存于嗜天青颗粒内，外界刺激可导致中性粒细胞聚集，释放髓过氧化物酶（MPO）。在成熟的粒细胞中，MPO是含量最丰富的糖蛋白，约占外周血多形核中性粒细胞（PMNs）内总蛋白质含量的5%，血液中95%的MPO来源于PMNs。
冠心病是心血管系统中最常见的疾病，而动脉粥样硬化（AS）又是形成冠心病的重要病理基础。研究发现MPO有促进AS病变形成的作用，MPO通过产生自由基和多种反应性物质，促进斑块形成和不稳定性增加，加速AS进展，进而引起多种并发症如急性冠脉综合征（ACS）。研究发现，MPO缺陷的个体罹患心血管疾病的危险性明显下降。MPO水平的升高不仅与患冠状动脉疾病易感性相关，还可以预测早期患心肌梗死的危险性。
在肺部受微生物侵袭、职业暴露以及吸烟时，MPO会随中性粒细胞的聚集释放到炎症部位。MPO可代谢激活多种与肺癌有关的环境致癌物，能将前致癌物如多环芳烃类的苯并芘（BaP）转化成具有高度反应性和致癌性的活性产物二醇环氧化苯并芘（BPDE），BPDE能与DNA形成加合物并导致姐妹染色体互换，从而导致肺癌。
MPO在现阶段的研究也确定了它在疾病早期诊断与危险评估中具有重要的意义。随着对MPO研究的深入，人们发现MPO基因多态性导致个体对一些疾病易感性的差异，与人类多种疾病的发生、发展密切相关，因此越来越受到国内外学者的重视。
目前MPO常用的检测方法为酶联免疫法、双抗体夹心光激化学发光免疫检测法以及酶法。酶联免疫法自动化程度不高，检测操作繁琐、耗时较长，且受人为因素影响较大；双抗体夹心光激化学发光免疫检测法需要特殊的仪器，且检测成本较高；酶法检测的特异性较差，这些因素限制了这些检测手段的大规模应用。胶乳免疫比浊法，它有着操作简便、检测时间短、灵敏度高、线性范围宽和样品检测不受数量限制等显著的特点，因此，胶乳免疫比浊法有着极大的应用前景。制备MPO胶乳免疫比浊检测试剂盒可解决现有的检测手段中存在的一些缺陷，为MPO检测提供一种快捷、简便、准确的手段。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种髓过氧化物酶含量检测试剂盒；
本发明的目的之二提供一种制备所述髓过氧化物酶含量检测试剂盒的方法；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种髓过氧化物酶（MPO）检测试剂盒，由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；所述的试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂和水；所述的试剂Ⅱ的组分包括：包被MPO抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水；其中，所述包被MPO抗体的胶乳颗粒的粒径为100-220nm。
本发明通过试验发现，包被MPO抗体的胶乳颗粒的粒径的大小对于检测的灵敏性、准确性及线性范围等有着非常显著的影响，本发明通过大量的筛选试验最终确定，包被MPO抗体的胶乳颗粒的粒径为100-220nm时，相比于其它的粒径的胶乳颗粒，其检测的灵敏度及线性范围等特性有非常显著的改善。
制备包被MPO抗体的胶乳颗粒可以有多种制备方法，诸如化学交联法、物理吸附法等；本发明通过实验发现，采用化学交联法制备的致敏胶乳颗，其MPO抗体与胶乳颗粒结合紧密，不容易从胶乳颗粒上脱落，提高了抗体结合的稳定性，可显著提高检测试剂盒的稳定性。其中，采用下述方法制备的包被MPO抗体的胶乳颗粒，检测结果的稳定性为最好：
（1）制备羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液：取粒径为100-220nm的聚苯乙烯胶乳溶液，加入碳化二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺（硫代NHS），室温下搅拌反应；离心弃上清，再用缓冲液稀释分散沉淀胶乳，得到羧化改性聚苯乙烯胶乳；
（2）MPO抗体溶液的制备：将MPO抗体用缓冲液溶解，得到MPO抗体溶液；
（3）包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备：将步骤（2）所制备的MPO抗体溶液加入到步骤（1）所制备的羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液中，在25-37℃下搅拌反应，终止反应后，离心弃上清，洗涤沉淀，即得。
其中，步骤（1）中所述的聚苯乙烯胶乳溶液的浓度优选为0.5-5%（g/mL），优选为1%(g/mL)；所述的室温可以是20-30℃的温度。
步骤（1）或（2）中所述的缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，更优选为0.12M磷酸盐缓冲液；
步骤（3）中，MPO抗体溶液与羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的体积比为1:1；
为了达到更好的检测效果，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-60g，表面活性剂0.4-30mL，促凝剂1-40g，防腐剂0.1-5g，稳定剂5-50g，阻断剂1-10mL，螯合剂0.05-6g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被MPO抗体的胶乳颗粒0.1-5g，生物缓冲剂5-50g，螯合剂0.05-6g，表面活性剂0.1-5mL，防腐剂0.1-5g，助悬剂5-50g，封闭剂5-40g，稳定剂5-50g，余量为水。
进一步优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂10-30g，表面活性剂1-8mL，促凝剂10-20g，防腐剂0.5-3g，稳定剂10-20g，阻断剂3-8mL，螯合剂0.1-3g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被MPO抗体的胶乳颗粒1-3g，生物缓冲剂10-30g，螯合剂0.1-3g，表面活性剂1-3mL，防腐剂0.5-3g，助悬剂10-30g，封闭剂8-15g，稳定剂10-20g，余量为水。
最优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂12g，表面活性剂4mL，促凝剂15g，防腐剂1g，稳定剂15g，阻断剂5mL，螯合剂0.5g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被MPO抗体的胶乳颗粒2g，生物缓冲剂15g，螯合剂0.5g，表面活性剂2mL，防腐剂1g，助悬剂20g，封闭剂10g，稳定剂15g，余量为水。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂是为了维持反应体系pH值的稳定性，凡是有一定缓冲能力的物质，例如：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、三羟甲基甲胺基乙磺酸（TES）、2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES）、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES）、三羟甲基甲胺基丙磺酸（TAPS）、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸（POPSO）、3-（N-吗啉）丙磺酸(MOPS)等，为了达到更好的检测效果，试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂优选为三羟甲基甲胺基乙磺酸（TES）。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的表面活性剂主要起到促进试剂体系中各组分以及检测样本中各物质的均匀分散及提高检测的精密度，达到减少样本浊度对测定结果的影响的目的；因此，现有的具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的表面活性剂，例如，吐温20、吐温40、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等。本发明的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的表面活性剂优选为吐温-20。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质，所以任何一种能起到防止细菌滋生作用的防腐剂均能适用于本发明；本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的防腐剂优选为咪唑烷基脲。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的稳定剂，主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间。常用的稳定剂为糖类、醇类、蛋白类以及一些氨基酸等，本发明中的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的稳定剂优选为蔗糖。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中的螯合剂能够络合检测样本中的金属离子，以减少金属离子造成的干扰；因此，能够络合金属离子的各种螯合剂均能够适用，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐等，本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ优选氨基三乙酸为螯合剂。
试剂Ⅰ中的促凝剂可以促进抗原抗体反应，有利于胶乳颗粒交联物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围。本发明检测试剂盒中的促凝剂优选为PEG-20000。
试剂Ⅰ中的阻断剂可以有效避免非特异性反应对检测结果的干扰。检测试剂盒中常见的干扰因素有以下两类：异嗜性抗体干扰、类风湿因子干扰。本发明优选的阻断剂为类风湿因子阻断剂。部分类风湿关节炎、各种胶原结缔组织病、肝病以及多种慢性疾病病人体内会出现的一类自身抗体，可与自身IgG分子的Fc段抗原决定簇起反应，该类抗体被称为类风湿因子，这些自身提的存在会导致检测过程中非特异性反应的发生，从而对检测结果带来不良影响。本发明试剂盒中的阻断剂可以有效避免非特异性反应的发生，减少自身抗体对检测结果的不良影响。
试剂Ⅱ中的助悬剂可以帮助胶乳颗粒维持一个很好的分散状态，防止胶乳颗粒下沉影响检测试剂盒的品质及开瓶稳定性，常用的助悬剂有乙二醇、丙三醇、海藻酸钠、乳糖和麦芽糖等，本发明试剂Ⅱ优选海藻酸钠作为助悬剂。
试剂Ⅱ中的封闭剂的作用是为了与胶乳颗粒中游离的-COOH位点结合，避免游离的羧基位点对检测结果造成不良影响，本发明试剂Ⅱ中优选BSA蛋白作为封闭剂。
本发明检测试剂盒中所用到的每种组分均能通过商业途径从生物试剂公司或医药公司购买得到。
本发明的另外一个目的是提供一种制备所述检测MPO试剂盒的方法，包括：
（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；
（2）制备试剂Ⅱ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；
（3）将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
本发明的又一目的是提供所述髓过氧化物酶检测试剂盒检测样品中髓过氧化物酶含量的检测方法，该方法为两点终点法，包括以下步骤：
向5μL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品）中加入160μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入40μL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
本发明胶乳免疫比浊检测试剂盒克服了现有的MPO检测方法中的缺陷，为MPO检测提供一种快捷、简便、准确的手段。本发明髓过氧化物酶含量检测试剂盒，具有稳定性好、灵敏度高、特异性强等诸多优点，且检测操作简便，适合于大规模推广和应用。
附图说明
图1本发明检测试剂盒的标准工作曲线。
图2本发明检测试剂盒的37℃热稳定性试验结果。
图3对比实施例检测试剂盒37℃热稳定性试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
预备实施例1包被髓过氧化物酶抗体的胶乳颗粒的制备
包被髓过氧化物酶抗体的胶乳颗粒的制备过程如下：
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：取100mL粒径为100nm，浓度为1%的聚苯乙烯胶乳溶液，加入35mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），再加入15mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应40分钟，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②MPO抗体溶液的制备：将100μgMPO抗体用10mL0.12M磷酸盐缓冲液溶解，得到MPO抗体溶液；
③包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备：取10mL②步所制得的MPO抗体溶液，加入10mL步骤①制得胶乳溶液，在37℃搅拌反应3小时，加入0.4mL0.1M甘氨酸缓冲液和4mL10%BSA溶液，搅拌40分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀3次，得到包被MPO抗体的胶乳颗粒。
预备实施例2包被髓过氧化物酶抗体的胶乳颗粒的制备
包被髓过氧化物酶抗体的胶乳颗粒的制备过程如下：
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：取100mL粒径为220nm，浓度为1%的聚苯乙烯胶乳溶液，加入35mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），再加入15mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应40分钟，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②MPO抗体溶液的制备：将100μgMPO抗体用10mL0.12M磷酸盐缓冲液溶解，得到MPO抗体溶液；
③包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备：取10mL②步所制得的MPO抗体溶液，加入10mL步骤①制得胶乳溶液，在37℃搅拌反应3小时，加入0.4mL0.1M甘氨酸缓冲液和4mL10%BSA溶液，搅拌40分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀3次，得到包被MPO抗体的胶乳颗粒。
预备实施例3包被髓过氧化物酶抗体的胶乳颗粒的制备
包被髓过氧化物酶抗体的胶乳颗粒的制备过程如下：
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：取100mL粒径为150nm，浓度为1.5%的聚苯乙烯胶乳溶液，加入35mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），再加入15mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应40分钟，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②MPO抗体溶液的制备：将100μgMPO抗体用10mL0.12M磷酸盐缓冲液溶解，得到MPO抗体溶液；
③包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备：取10mL②步所制得的MPO抗体溶液，加入10mL步骤①制得胶乳溶液，在37℃搅拌反应3小时，加入0.4mL0.1M甘氨酸缓冲液和4mL10%BSA溶液，搅拌40分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀3次，得到包被MPO抗体的胶乳颗粒。
实施例1MPO胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例2MPO胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例3MPO胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例4MPO胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例5MPO胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例1MPO胶乳检测试剂盒的制备：
一、包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：取100mL粒径为95nm，浓度为1%的聚苯乙烯胶乳溶液，加入35mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），再加入15mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应40分钟，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②MPO抗体溶液的制备：将100μgMPO抗体用10mL0.12M磷酸盐缓冲液溶解，得到MPO抗体溶液；
③包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备：取10mL②步所制得的MPO抗体溶液，加入10mL步骤①制得胶乳溶液，在37℃搅拌反应3小时，加入0.4mL0.1M甘氨酸缓冲液和4mL10%BSA溶液，搅拌40分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀3次，得到包被MPO抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例2MPO胶乳检测试剂盒的制备：
一、包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备
①羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：取100mL粒径为230nm，浓度为1%的聚苯乙烯胶乳溶液，加入35mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC），再加入15mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应40分钟，离心弃上清，再用100mL0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
②MPO抗体溶液的制备：将100μgMPO抗体用10mL0.12M磷酸盐缓冲液溶解，得到MPO抗体溶液；
③包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备：取10mL②步所制得的MPO抗体溶液，加入10mL步骤①制得胶乳溶液，在37℃搅拌反应3小时，加入0.4mL0.1M甘氨酸缓冲液和4mL10%BSA溶液，搅拌40分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀3次，得到包被MPO抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例3MPO胶乳检测试剂盒的制备：
在羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备中聚苯乙烯胶乳的粒径为80nm，其余均与对比实施例1相同。
对比实施例4MPO胶乳检测试剂盒的制备：
在羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备中聚苯乙烯胶乳的粒径为60nm，其余均与对比实施例1相同。
对比实施例5MPO胶乳检测试剂盒的制备：
在羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备中聚苯乙烯胶乳的粒径为40nm，其余均与对比实施例1相同。
对比实施例6MPO胶乳检测试剂盒的制备：
在羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备中聚苯乙烯胶乳的粒径为20nm，其余均与对比实施例1相同。
对比实施例7MPO胶乳检测试剂盒的制备：
在羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备中聚苯乙烯胶乳的粒径为240nm，其余均与对比实施例2相同。
对比实施例8MPO胶乳检测试剂盒的制备：
在羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备中聚苯乙烯胶乳的粒径为250nm，其余均与对比实施例2相同。
对比实施例9MPO胶乳检测试剂盒的制备：
在羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备中聚苯乙烯胶乳的粒径为280nm，其余均与对比实施例2相同。
对比实施例10MPO胶乳检测试剂盒的制备：
在羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备中聚苯乙烯胶乳的粒径为300nm，其余均与对比实施例2相同。
对比实施例11MPO胶乳检测试剂盒的制备：
一、包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备（采用物理吸附法包被）
①MPO抗体溶液的制备：将100μgMPO抗体用10mL0.12M磷酸盐缓冲液溶解，得到MPO抗体溶液；
②取10mL①步所制得的MPO抗体溶液，加入10mL粒径为100nm，浓度为1%的聚苯乙烯胶乳溶液，于37℃搅拌反应1小时，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，并用20mL0.12M磷酸盐缓冲液复溶沉淀；
③向②步所制得的溶液中加入4mL10%BSA溶液，于25℃搅拌反应1小时，以封闭胶乳微球上多余的基团，离心弃上清，后用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，既得物理法包被MPO抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
对比实施例12MPO胶乳检测试剂盒的制备：
在羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备中聚苯乙烯胶乳的粒径为220nm，其余均与对比实施例11相同。
对比实施例13MPO胶乳检测试剂盒的制备：
在羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备中聚苯乙烯胶乳的粒径为150nm，其余均与对比实施例11相同。
试验例1本发明检测试剂盒的标准工作曲线
取浓度为0ng/mL，150ng/mL，600ng/mL，1500ng/mL，3000ng/mL，5000ng/mL的MPO标准品溶液，用本发明实施例1所制备的MPO检测试剂盒、对比实施例1和对比实施例2制备的MPO检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线，结果见图1。
各MPO检测试剂盒检测样品中MPO含量的检测方法，该方法为两点终点法，包括以下步骤：向5μL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品）中加入160μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入40μL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
由图1的标准工作曲线可见，本发明检测试剂盒1的线性范围及灵敏度均优于对比实施例1检测试剂盒。
按照同样的方法将实施例2-5所制备的检测试剂盒的标准工作曲线与对比实施例3-10的检测试剂盒的标准工作曲线进行了对比；试验结果发现，本发明检测试剂盒2-5的线性范围及灵敏度均优于对比实施例3-10检测试剂盒的线性范围及灵敏度。
试验例2本发明检测试剂盒与对比例检测试剂盒高值线性范围试验
用本发明实施例2制备的检测试剂盒与对比实施例2的检测试剂盒对系列稀释后的高值质控品进行检测，分别测定不同稀释倍数时质控品的浓度并计算其线性偏差，试验结果见表1和表2：
表1本发明实施例2检测试剂盒高值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差（%） |
| 0.1 | 863.2 | 869.4 | 866.3 | 873.2 | -0.8 |
| 0.2 | 1754 | 1756 | 1755 | 1746.4 | 0.49 |
| 0.3 | 2641 | 2604 | 2622.5 | 2619.6 | 0.11 |
| 0.4 | 3502 | 3506 | 3504 | 3492.8 | 0.32 |
| 0.5 | 4352 | 4354 | 4353 | 4366 | -0.3 |
| 0.6 | 5306 | 5301 | 5303.5 | 5239.2 | 1.21 |
| 0.7 | 6142 | 6145 | 6143.5 | 6112.4 | 0.5 |
| 0.8 | 6997 | 6998 | 6997.5 | 6985.6 | 0.17 |
| 0.9 | 7826 | 7820 | 7823 | 7858.8 | -0.46 |
| 1.0 | 8680 | 8724 | 8702 | 8732 | -0.35 |
表2对比实施例2检测试剂盒高值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差（%） |
| 0.1 | 467.2 | 465.3 | 466.25 | 483.2 | -3.64 |
| 0.2 | 938.5 | 943.1 | 940.8 | 966.4 | -2.72 |
| 0.3 | 1395 | 1385 | 1390 | 1449.6 | -4.29 |
| 0.4 | 1856 | 1842 | 1849 | 1932.8 | -4.53 |
| 0.5 | 2238 | 2241 | 2239.5 | 2416 | -7.88 |
| 0.6 | 3017 | 3005 | 3011 | 2899.2 | 3.71 |
| 0.7 | 3214 | 3209 | 3211.5 | 3382.4 | -5.32 |
| 0.8 | 3976 | 3940 | 3958 | 3865.6 | 2.33 |
| 0.9 | 4438 | 4425 | 4431.5 | 4348.8 | 1.87 |
| 1.0 | 5012 | 5006 | 5009 | 4832 | 3.53 |
由表1和表2中的结果可见，本发明实施例2所制备的检测试剂盒高值线性范围要明显优于对比实施例2所制备的检测试剂盒。
按照上述同样的方法检测了本发明实施例1、3-5所制备的试剂盒以及对比实施例1、3-10所制备的试剂盒的高值线性范围，试验结果表明，本发明检测试剂盒高值线性范围均要明显优于对照检测试剂盒，对比实施例所制备的检测试剂盒测值线性偏差较大，对检测结果有不良的影响，本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒在各稀释倍数时，检测的结果相对较稳定，线性偏差小。
试验例3本发明检测试剂盒与对比检测试剂盒低值线性范围试验
取本发明实施例3制备的检测试剂盒与对比实施例3制备的检测试剂盒对系列稀释后的低值质控品进行检测，分别测定不同稀释倍数时质控品的浓度并计算其线性偏差，试验结果见表3和表4：
表3本发明实施例3检测试剂盒低值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差（%） |
| 0.1 | 57.6 | 56.2 | 56.9 | 60.1 | -5.62 |
| 0.2 | 118.3 | 117.5 | 117.9 | 120.2 | -1.95 |
| 0.3 | 176 | 178 | 177 | 180.3 | -1.86 |
| 0.4 | 248.1 | 246.7 | 247.4 | 240.4 | 2.83 |
| 0.5 | 305.1 | 301.2 | 303.15 | 300.5 | 0.87 |
| 0.6 | 358.7 | 354.2 | 356.45 | 360.6 | -1.16 |
| 0.7 | 412.1 | 411.8 | 411.95 | 420.7 | -2.12 |
| 0.8 | 482.3 | 483.6 | 482.95 | 480.8 | 0.45 |
| 0.9 | 536.2 | 534.2 | 535.2 | 540.9 | -1.07 |
| 1.0 | 605 | 609 | 607 | 601 | 0.99 |
表4对比实施例3检测试剂盒低值线性范围结果
| 稀释倍数 | 测量值1 | 测量值2 | 测量均值 | 理论值 | 线性偏差（%） |
| 0.1 | 62.3 | 59.1 | 60.7 | 75 | -23.56 |
| 0.2 | 142.9 | 138.7 | 140.8 | 150 | -6.53 |
| 0.3 | 231.3 | 230.9 | 231.1 | 225 | 2.64 |
| 0.4 | 289.5 | 287.2 | 288.35 | 300 | -4.04 |
| 0.5 | 356.8 | 356.7 | 356.75 | 375 | -5.12 |
| 0.6 | 426.1 | 425.9 | 426 | 450 | -5.63 |
| 0.7 | 523.1 | 523.4 | 523.25 | 525 | -0.33 |
| 0.8 | 608 | 607 | 607.5 | 600 | 1.23 |
| 0.9 | 661.7 | 669.2 | 665.45 | 675 | -1.44 |
| 1.0 | 758 | 762 | 760 | 750 | 1.32 |
由表3和表4中的结果可见，本发明实施例3检测试剂盒检测低值线性范围要明显低于对比实施例3检测试剂盒，且实施例3所制备的检测试剂盒的检测值与理论值的线性偏差较小，说明测值更加准确。
按照上述同样的方法检测了本发明实施例1-2、4-5所制备的试剂盒以及对比实施例1-2、4-10所制备的试剂盒的低值线性范围；试验结果表明，本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒低值线性范围要明显低于对比实施例1-10所制备的检测试剂盒，且检测值与理论值的线性偏差较小，说明测值更加准确。
试验例4本发明检测试剂盒热稳定性试验
将本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒与对比实施例11-13制备的检测试剂盒，于37℃分别热处理0天、3天、5天和7天，并于不同的处理时间之后分别测定MPO校准品，记录其ΔA值，并绘制其变化曲线，本发明检测试剂盒的37℃热稳定性试验结果见图2，对比实施例检测试剂盒37℃热稳定性试验结果见图3。
从图2及图3的结果可知，本发明检测试剂盒37℃热处理稳定性好，其优良的稳定性决定了其在临床诊断上的广泛应用。
Claims (5)
1.一种髓过氧化物酶含量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；
每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：三羟甲基甲胺基乙磺酸12g，吐温-204mL，PEG-2000015g，咪唑烷基脲1g，蔗糖15g，类风湿因子阻断剂5mL，氨基三乙酸0.5g，余量为蒸馏水或双蒸水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被MPO抗体的胶乳颗粒1.7g，三羟甲基甲胺基乙磺酸11g，氨基三乙酸0.5g，吐温-202mL，咪唑烷基脲1g，海藻酸钠20g，牛血清白蛋白10g，蔗糖15g，余量为蒸馏水或双蒸水；
所述包被MPO抗体的胶乳颗粒的粒径为100nm；
所述包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备方法包括：
(1)羧化改性聚苯乙烯胶乳溶液的制备：取100mL粒径为100nm，浓度为1％的聚苯乙烯胶乳溶液，加入35mg EDC，再加入15mg的硫代NHS，在室温下搅拌反应40分钟，离心弃上清，再用100mL 0.12M磷酸盐缓冲液稀释分散沉淀胶乳既得羧化改性聚苯乙烯胶乳；
(2)MPO抗体溶液的制备：将100μgMPO抗体用10mL0.12M磷酸盐缓冲液溶解，得到MPO抗体溶液；
(3)包被MPO抗体的胶乳颗粒的制备：取10mL(2)步所制得的MPO抗体溶液，加入10mL步骤(1)制得胶乳溶液，在37℃搅拌反应3小时，加入0.4mL 0.1M甘氨酸缓冲液和4mL 10％BSA溶液，搅拌40分钟，终止反应，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀3次，得到包被MPO抗体的胶乳颗粒。
2.按照权利要求1所述的髓过氧化物酶含量检测试剂盒，其特征在于：步骤(1)中所述的室温是20-30℃的温度。
3.按照权利要求1所述的髓过氧化物酶含量检测试剂盒，其特征在于：所述MPO抗体是MPO单克隆抗体或多克隆抗体。
4.按照权利要求1-3任何一项所述的检测试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ的pH值的范围为6.5-8.5，试剂Ⅱ的pH值的范围为7.0-8.0。
5.一种制备权利要求1-4任何一项所述检测试剂盒的方法，包括：(1)制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(2)制备试剂Ⅱ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(3)将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
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