CN103513038B - 半乳糖凝集素3检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种半乳糖凝集素3含量检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、促凝剂、防腐剂、螯合剂、无机盐和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂和水。本发明采用粒径为130-270nm的胶乳颗粒通过化学交联法制备包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，能有效保证试剂盒的稳定性、灵敏度以及较宽的检测线性范围，具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适合于推广和应用。

Description

半乳糖凝集素3检测试剂盒及制备方法
技术领域
本发明涉及半乳糖凝集素3含量检测试剂盒，尤其涉及一种人体内半乳糖凝集素3含量的检测试剂盒及其制备方法，本发明进一步涉及该检测试剂盒在检测人体内半乳糖凝集素3含量的使用方法，属于半乳糖凝集素3含量的检测领域。
背景技术
Galectins，即β-半乳糖血凝素超家族，是一类钙非依赖性的糖结合蛋白，具有高度保守性。目前，已发现该家族有14个成员，根据发现的先后顺序依次编号为1-14。Galectins家族的每个成员都具有以下特性：（1）具有特征性的氨基酸序列：每个Galectin家族成员至少包含一个由约130个氨基酸组成的糖识别结构域（CRD）；（2）具有对β-半乳糖苷的亲和性。
Galectin-3是Galectins家族唯一的嵌合体成员，由一个糖基与一个非糖基配体交联结合而成，分子量为32KD。在人类基因组中由单个基因编码，位于14号染色体q21-22位点，总长约17KD。Galectin-3包括3个结构域，NH2末端结合域，即1个糖结构识别域和1个特有的富含甘氨酸、脯氨酸和酪氨酸重复序列的结构域；NH2末端结合域包括控制细胞靶向的12个氨基酸残基，为与具有糖轭合物的细胞表面结合时发挥多种功能所必需；羧基末端的糖结合域可被胰蛋白酶裂解为包含140个氨基酸残基的糖结构识别域。
根据Galectins的分子结构特点，可以将其分为3组：（1）原型，即含有一个CRD的单体，以单体（Galectin-5，-7，-10）或二聚体（Galectin-1，-2，-11，-13，-14）的形式存在；（2）嵌合体型，由一个糖基与一个非糖基配体交联结合而成（Galectin-3）；（3）串联重复型，由两个CRD串联融合而成（Galectin-4，-6，-8，-9，-12）。
作为一种多功能的蛋白，Galectin-3广泛分布于心脏、肾脏、肝脏、肺脏以及肠道等组织器官以及成骨细胞、上皮细胞和肠组织等各种组织和细胞中，并在激活的巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等血液细胞中高表达。根据细胞类型，Galectin-3可存在于细胞浆、细胞核、细胞膜或细胞外基质，其在细胞内的分布依赖于细胞的增值状态。在静止期细胞，Galectin-3主要分布在胞浆；在增殖期细胞，Galectin-3主要分布在细胞核。Galectin-3可通过非经典分泌途径分泌到细胞外，与细胞表面受体和糖蛋白相互作用，参与跨膜信号转导。Galectin-3可参与细胞生长、细胞黏附、细胞凋亡、炎性反应、免疫调节、新血管形成、肿瘤分化转移等各种生理和病理过程。研究表明，Galectin-3作为一种重要的促有丝分裂原能在旁分泌方式下通过凝集素-碳水化合物相互作用来刺激肌成纤维细胞的增值和胶原合成。
多项研究显示，随着心力衰竭程度的加重，血浆Galectin-3的表达水平呈逐步升高趋势，与健康对照组比较，差异具有统计学意义。心力衰竭组心功能Ⅲ级、Ⅳ级患者血浆Galectin-3水平较健康对照组升高，提示Galectin-3水平的升高可能提示心力衰竭失代偿，可能成为评价心功能分级的新的生物学标志物和治疗新靶点。
目前，Galectin-3常用的检测方法为酶联免疫法(ELISA)，酶联免疫法检测的准确度较高，但是检测过程繁琐，耗时较长且样本需要批量检测，不适用于及时检测。胶乳增强透射免疫比浊检测（PETIA）技术是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的一种非放射性均相免疫测定法，可以对各种微量的抗原物质和小分子半抗原进行精确的定量测定，目前越来越多的应用到临床实验室中。与ELISA技术相比，PETIA有效的提高检测速度和降低检测成本。然而，半乳糖凝集素3的定量检测分析需要较高的灵敏度，因此需要对PETIA技术参数进行优化以达到检测要求。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简单、线性范围宽的半乳糖凝集素3含量检测试剂盒。
本发明的目的之二是提供一种所述半乳糖凝集素3含量检测试剂盒的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种半乳糖凝集素3含量检测试剂盒，由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，所述试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、促凝剂、防腐剂、螯合剂、无机盐和水；所述试剂Ⅱ的组分包括：包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂和水。
本发明通过大量的实验发现，试剂Ⅱ中胶乳颗粒的粒径对试剂盒的稳定性、灵敏度以及检测结果的准确性等有着非常显著的影响，本发明通过大量的实验最终确定，当选用的胶乳颗粒的粒径为130-270nm时，制备出的检测试剂盒的稳定性、灵敏度以及检测线性范围等特性要明显优于其它粒径的胶乳颗粒，尤其是当胶乳颗粒的粒径为200-210nm时，制备的检测试剂盒其各项性能最好。
半乳糖凝集素3致敏胶乳颗粒可以采用化学交联法或物理吸附法等本领域的常规方法制备得到；本发明通过实验发现，采用化学交联法制备的致敏胶乳颗粒，抗体与胶乳颗粒通过化学键结合，从而使抗体不容易从胶乳颗粒上脱落下来，有利于维持试剂盒产品的稳定性，使产品的货架期能显著延长。
优选的，一种制备包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒的方法，该方法包括以下步骤：（1）洗涤并活化胶乳；（2）抗体致敏胶乳；（3）封闭抗体致敏胶乳，洗涤，即得。
其中，所述洗涤包括：取粒径为130-270nm的聚苯乙烯胶乳颗粒分散于MES缓冲液中（缓冲液中胶乳颗粒的浓度为0.5%-5%），离心弃上清；
所述的活化胶乳包括：将洗涤过的胶乳颗粒分散于MES缓冲液中（缓冲液中胶乳颗粒的浓度优选为0.5%-5%），取碳化二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺用MES缓冲液溶解后加入胶乳溶液中，混合均匀置于25-40℃恒温摇床上反应0.5-3h，得到活化的胶乳颗粒；
所述抗体致敏胶乳颗粒包括：向活化的胶乳溶液中加入半乳糖凝集素3抗体，震荡混合均与，置于25-40℃恒温摇床上反应5-15h，即得；
所述封闭胶乳颗粒包括：向致敏完成的胶乳颗粒溶液中加入甘氨酸溶液，混合均匀室温下静置反应15-80min后向体系中加入BSA溶液，混合均匀，室温下静置反应10-30min；
所述洗涤胶乳颗粒包括：将封闭后的胶乳颗粒离心，弃上清，用超纯水洗涤沉淀，即得。
所述洗涤包括：取粒径为130-270nm的聚苯乙烯胶乳颗粒分散于MES缓冲液中，缓冲液中胶乳颗粒的浓度为0.5%-5%，离心弃上清。
本发明半乳糖凝集素3单克隆抗体或多克隆抗体采用化学交联法包被胶乳颗粒，其中半乳糖凝集素3单克隆抗体或多克隆抗体能很好的识别样品中的半乳糖凝集素3抗原，从而能很好的提高检测试剂盒的特异性。
为了达到更好的检测效果，本发明每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-100g，促凝剂1-38g，防腐剂0.02-2mL，无机盐4-40g，螯合剂0.05-6g，余量为水；优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂10-25g，促凝剂12-25g，防腐剂0.5-1mL，无机盐7-15g，螯合剂0.1-3g，余量为水；更优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂15g，促凝剂15g，防腐剂0.7mL，无机盐10g，螯合剂1g，余量为水；
本发明每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒0.5-4g，生物缓冲剂5-100g，表面活性剂0.1-5mL，防腐剂0.02-2mL，助悬剂5-50mL，封闭剂5-40g，余量为水；优选的，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒0.8-3g，生物缓冲剂10-30g，表面活性剂1-3mL，防腐剂0.5-1mL，助悬剂10-30mL，封闭剂10-20g，余量为水；更优选的，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒1.8g，生物缓冲剂15g，表面活性剂2mL，防腐剂0.7mL，助悬剂20mL，封闭剂15g，余量为水。
本发明所述的生物缓冲剂是能够用于维持一定pH值的各种生物缓冲剂，例如三羟甲基氨基甲烷（Tris）、三羟甲基甲胺基乙磺酸（TES）、2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸（POPSO）、3-（N-吗啉）丙磺酸（MOPS）中的一种或几种混合物；为了达到更好的检测效果，本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的生物缓冲剂优选为2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）。
本发明所述的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质从而对检测结果带来不良影响，因此，任何一种能阻止细菌繁殖的物质均能适用于本发明的防腐剂，如：苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、叠氮钠等等中的一种或几种的混合物；本发明试剂Ⅰ和试剂Ⅱ优选为Proclin-300作为防腐剂，防腐剂用量小，且毒性小，在反应体系中对反应结果不会造成不良影响。
本发明试剂Ⅰ所述的促凝剂可以促进样本中的抗原与胶乳颗粒表面的抗体颗粒反应，有利于胶乳颗粒的交联物的形成和增大，提高检测试剂盒的灵敏度；常用的促凝剂为聚乙二醇系列；聚乙二醇8000可以很好的促进胶乳颗粒的形成，并且也能较好的控制胶乳颗粒形成的速度和大小，对检测结果的判读有很大的好处，本发明优选聚乙二醇8000作为促凝剂。
本发明试剂Ⅰ中所述的螯合剂能够络合检测样本中的金属离子，避免金属离子对检测过程和结果的干扰，能络合金属离子的各种螯合剂均能够适用本发明，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸等。本发明优选乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）作为螯合剂。
本发明试剂Ⅰ所述的无机盐能协助促凝剂在检测反应过程中有效控制反应的速度以及胶乳颗粒的大小，常见的各种无机盐均能用于本试剂盒中，本发明优选氯化钠作为无机盐组分。
本发明试剂Ⅱ所述的表面活性剂有利于反应过程中各组分以及检测样本各物质的均匀分散，使反应体系能处于均相状态，达到减少样本浊度对测定结果的影响的目的；现有的具有增溶性质物质均可以作为本发明的表面活性剂如：吐温系列、曲拉通系列、乙基苯基聚乙二醇等。本发明优选曲拉通X-100作为表面活性剂。
本发明试剂Ⅱ所述的助悬剂可以帮助胶乳颗粒维持良好的分散状态，防止胶乳颗粒下沉影响试剂盒的品质及开瓶稳定性，常用的助悬剂为乙二醇、丙三醇、乳糖和麦芽糖等中的一种或几种的复配，本发明优选乙二醇作为助悬剂。
本发明试剂Ⅱ所述的封闭剂的作用是为了避免胶乳颗粒表面游离的羧基位点与抗原反应导致检测结果的误差，常用的封闭剂为蛋白质，本发明优选牛血清白蛋白（BSA）作为封闭剂。
本发明检测试剂盒中的所有组分均能通过商业途径从生物试剂或化学试剂公司购买得到。
本发明试剂Ⅰ与试剂Ⅱ的pH值的范围为6.5-8.5。
本发明的目的之二是提供一种制备所述检测半乳糖凝集素3试剂盒的方法，包括：
（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容得到试剂Ⅰ；（2）制备试剂Ⅱ：首先制备半乳糖凝集素3抗体包被的胶乳颗粒溶液；将其余各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中得到混合溶液；将半乳糖凝集素3抗体包被的胶乳溶液与混合溶液混合均匀，定容，得到试剂Ⅱ；（3）将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
本发明的目的之三是提供所述半乳糖凝集素3检测试剂盒检测样品中半乳糖凝集素3含量的检测方法（该方法为两点终点法），包括以下步骤：
向3uL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品，购自美国BG Medicine,Inc公司）中加入140uL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入35uL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长570nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2，计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
本发明检测试剂盒采用粒径为130-270nm的胶乳颗粒制备包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，能有效保证试剂盒的稳定性、灵敏度以及较宽的检测线性范围，同时本发明检测试剂盒抗体包被胶乳颗粒的工艺采用化学交联法保证了检测试剂盒具有良好的开瓶稳定性，包被胶乳颗粒的半乳糖凝集素3能很好的识别样本中的半乳糖凝集素3抗原，保证了试剂盒具有良好的特异性。本发明试剂盒具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适合于推广和应用。
附图说明
图1为本发明半乳糖凝集素3检测试剂盒标准工作曲线。
图2为本发明实施例1与对比实施例1、3、4、5制备的半乳糖凝集素3检测试剂盒标准工作曲线的比对试验结果。
图3为本发明实施例1与对比实施例6制备的半乳糖凝集素3检测试剂盒热稳定性比对试验结果。
图4为本发明检测试剂盒与市售酶联免疫检测试剂盒测定人血清中半乳糖凝集素3含量其结果的相关性。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
预备实施例1
（1）洗涤、活化胶乳：取0.1g粒径为130nm的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒。准确称取75mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）并用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于30℃恒温摇床上，200转/min，反应2小时；
（2）抗体致敏胶乳颗粒：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL半乳糖凝集素3多克隆抗体（购自Fitzgerald Industries International,Inc.），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应8h。
（3）封闭、洗涤胶乳颗粒：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入200μL2%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应1h，再向反应体系中加入200μL5%浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并于室温下静置反应30min；反应完成后将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，再用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
预备实施例2
（1）洗涤、活化胶乳：取0.15g粒径为270nm的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒。准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）并用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于30℃恒温摇床上，200转/min，反应2小时；
（2）抗体致敏胶乳颗粒：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL半乳糖凝集素3多克隆抗体（购自Fitzgerald Industries International,Inc.），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，220转/min，反应10h。
（3）封闭、洗涤胶乳颗粒：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入200μL 2%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应1h，再向反应体系中加入200μL 5%浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并于室温下静置反应30min；反应完成后将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，再用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
预备实施例3
（1）洗涤、活化胶乳：取0.12g粒径为200nm的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒。准确称取60mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和60mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）并用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于30℃恒温摇床上，200转/min，反应2小时；
（2）抗体致敏胶乳颗粒：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL半乳糖凝集素3多克隆抗体（购自Fitzgerald Industries International,Inc.），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，220转/min，反应10h。
（3）封闭、洗涤胶乳颗粒：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入200μL 2%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应1h，再向反应体系中加入200μL 5%浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并于室温下静置反应30min；反应完成后将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，再用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
预备实施例4
（1）洗涤、活化胶乳：取0.1g粒径为150nm的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒。准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）并用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于28℃恒温摇床上，200转/min，反应2小时；
（2）抗体致敏胶乳颗粒：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL半乳糖凝集素3多克隆抗体（购自Fitzgerald Industries International,Inc.），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，220转/min，反应10h。
（3）封闭、洗涤胶乳颗粒：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入200μL 2%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应1h，再向反应体系中加入200μL 5%浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并于室温下静置反应30min；反应完成后将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，再用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
预备实施例5
（1）洗涤、活化胶乳：取0.14g粒径为240nm的聚苯乙烯胶乳颗粒（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒。准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）并用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于28℃恒温摇床上，200转/min，反应2小时；
（2）抗体致敏胶乳颗粒：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL半乳糖凝集素3多克隆抗体（购自Fitzgerald Industries International,Inc.），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，220转/min，反应10h。
（3）封闭、洗涤胶乳颗粒：步骤（2）反应完成后，向反应体系中加入200μL 2%浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应1h，再向反应体系中加入200μL 5%浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并于室温下静置反应30min；反应完成后将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，再用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
实施例1检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入1.8g预备实施例3制备的包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例2检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入1.8g预备实施例1制备的包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例3检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入1.8g预备实施例2制备的包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例4检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入1.8g预备实施例4制备的包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
实施例5检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入1.8g预备实施例5制备的包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
对比实施例1半乳糖凝集素3检测试剂盒的制备
除了胶乳颗粒的粒径为120nm外，其余均与实施例2完全相同。
对比实施例2半乳糖凝集素3检测试剂盒的制备
除了胶乳颗粒的粒径为280nm外，其余均与实施例3完全相同。
对比实施例3半乳糖凝集素3检测试剂盒的制备
除了胶乳颗粒的粒径为100nm外，其余均与实施例4完全相同。
对比实施例4半乳糖凝集素3检测试剂盒的制备
除了胶乳颗粒的粒径为300nm外，其余均与实施例5完全相同。
对比实施例5半乳糖凝集素3检测试剂盒的制备
除了胶乳颗粒的粒径为320nm外，其余均与实施例1完全相同。
对比实施例6半乳糖凝集素3检测试剂盒的制备
一、包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒的制备（采用物理吸附法包被）
①取0.1mL 1mg/mL半乳糖凝集素3多克隆抗体（购自FitzgeraldIndustries International,Inc.）用10mL pH为7.0的MES缓冲液稀释，得到半乳糖凝集素3抗体溶液；
②向①步稀释好的抗体溶液中加入10mL粒径为200nm，浓度为1%的聚苯乙烯胶乳溶液，于37℃搅拌反应1小时，离心弃上清，用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀2次，并用20mL pH为7.0的MES缓冲液复溶沉淀；
③向②步所制得的溶液中加入4mL 10%BSA溶液，于25℃搅拌反应1小时，以封闭胶乳微球上多余的基团，离心弃上清，后用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀2次，并用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶沉淀，得到物理法包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒溶液。
二、检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解，后加入1.8g上述制备的物理法包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用。
试验例1 本发明检测试剂盒标准工作曲线
取浓度为0ng/mL，8ng/mL，16ng/mL，32ng/mL，64ng/mL的半乳糖凝集素3标准品溶液，用本发明实施例1-5及对比实施例1-5所制备的半乳糖凝集素3检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线。
测定结果见图1和图2。从图1可以看出本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒具有良好的线性，根据图2可以看出本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒的线性范围要明显的优于对比实施例1-5所制备的检测试剂盒；此外，本发明采用最优化的条件制备出的试剂盒（即实施例1所制备的试剂盒），其标准工作曲线较实施例2-5制备出的试剂盒线性更为优良。
试验例2 本发明检测试剂盒热稳定性检测试验
将本发明实施例1及对比实施例6所制备的检测试剂盒置于37℃分别热处理0天、3天、5天和7天，在不同的处理时间之后分别测定半乳糖凝集素3校准品，记录其ΔA值，并绘制其变化曲线。试验结果见图3。从图3中结果可知本发明检测试剂盒具有良好的热稳定性。
试验例3 本发明试剂盒与酶联免疫分析试剂盒测值的相关性试验
1、供试试剂盒
实施例1所制备的试剂盒；酶联免疫试剂盒（购自BG Medicine,Inc）；
2、试验方法及结果
通过用本发明实施例1所制备的试剂盒与购自BG Medicine,Inc的酶联免疫试剂盒测定血清中半乳糖凝集素3的含量的测定值进行比较，试验结果为图4所示，并进行回归分析。从图4中可以看出本发明试剂盒与酶联试剂盒在血清中半乳糖凝集素3测定方面具有良好的相关性。

Claims (2)

1.一种半乳糖凝集素3含量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；
试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于900mL双蒸水中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用蒸馏水定容至1L，密封4℃保存，备用；
试剂Ⅱ的制备：
按所述用量量取各组分：
将上述各组分溶解于700mL双蒸水中，搅拌、充分溶解后加入1.8g包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，充分混匀之后，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.5，后用双蒸水定容至1L，密封4℃保存，备用；
所述包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒的制备方法为：
(1)洗涤、活化胶乳：取0.12g粒径为200nm的聚苯乙烯胶乳颗粒于50mL离心管中，再向离心管中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液，震荡分散均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，重复洗涤两次；向洗涤过的胶乳颗粒中加入10mL pH为7.0的MES缓冲液重悬胶乳颗粒；准确称取60mg EDC和60mg NHS并用1mL pH为7.0的MES缓冲液溶解，溶解完全后将溶液加入胶乳溶液中，震荡混合均匀，置于30℃恒温摇床上，200转/min，反应2小时；
(2)抗体致敏胶乳颗粒：向(1)步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL半乳糖凝集素3多克隆抗体，震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，220转/min，反应10h；
(3)封闭、洗涤胶乳颗粒：步骤(2)反应完成后，向反应体系中加入200μL 2％浓度的甘氨酸溶液，混合均匀，并于室温下静置反应1h，再向反应体系中加入200μL 5％浓度的BSA溶液，震荡，混合均匀，并于室温下静置反应30min；反应完成后将反应体系置于12000转/min，离心30min，弃上清，并用pH为7.0的MES缓冲液洗涤沉淀两次，既得包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，再用10mL pH为7.0的MES缓冲液复溶胶乳颗粒，即得包被抗体的胶乳颗粒溶液。
2.一种制备权利要求1所述检测试剂盒的方法，包括：(1)制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容得到试剂Ⅰ；(2)制备试剂Ⅱ：首先制备半乳糖凝集素3抗体包被的胶乳颗粒溶液；将其余各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中得到混合溶液；将半乳糖凝集素3抗体包被的胶乳溶液与混合溶液混合均匀，定容，得到试剂Ⅱ；(3)将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
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