CN103123319B - 心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水；所述包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的粒径为90-200nm。本发明检测试剂盒具有稳定性好、特异性强、灵敏度高、抗类风湿因子的干扰能力强、线性范围好、检测操作简便等系列优点，有利于大规模推广和应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种心脏标志物含量的检测试剂盒，尤其涉及心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法.本发明还涉及该心型脂肪酸结合蛋白测定试剂盒在检测人体心型脂肪酸结合蛋白含量的使用方法，属于心型脂肪酸结合蛋白含量的检测领域。
背景技术
急性冠脉综合征(ACS)是冠心病中重要的急性事件之一，主要分为急性心肌梗死(AMI)、不稳定心绞痛(UA)以及心源性猝死(SCD)，其发病率和病死率均较高。但若能在发病后及早辨别高危患者并进行再灌注治疗，则病死率及预后将会有明显改善。其中，心脏标志物在ACS的诊断及预后过程中，扮演着至关重要的角色。
近年来，急性心肌梗死（AMI）的标志物研究取得很大进展。血清酶学指标在AMI诊断、预后、疗效评估等方面的应用价值已被公认，肌红蛋白（MYO）、心肌钙蛋白T（cTnT）和心肌钙蛋白Ⅰ（cTnl）在临床应用也十分广泛。最近，又有一个AMI的标志蛋白—心型脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein,H-FABP）受到重视和关注。心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白。它具有高度心脏特异性，它是心脏最丰富的蛋白质之一，但在心脏以外的组织中也有低浓度表达。心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）由132个氨基酸组成，分子量为15kDa。心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因位于染色体I上。H-FABP结合两个脂肪酸分子并参与脂肪酰基辅酶A的运输，活跃于氧化过程，从而在线粒体中产生能量。
在心肌缺血损伤出现后，H-FABP可以早在胸痛发作后1～3小时出现于血液中，6～8小时达到峰值，而且血浆水平在24～30小时内恢复正常。与其它几种常用心脏标志物于心肌损伤后出现在血液中的时间和浓度变化对比发现，在心肌损伤早期(6小时内)，较其它心脏标志物而言，H-FABP和MYO在诊断评估方面具有明显的时间优势。其中，MYO也是一种低分子量细胞质蛋白，由于在炎症、局部缺血、SLE、休克及皮肌炎等情况下亦会引起MYO的血液浓度升高，从而导致其作为心肌细胞损伤的诊断指标特异性较低。综合考评各急性心肌梗死（AMI）的标志物，H-FABP具有许多优良的特性。
目前，H-FABP的测定方法有酶联免疫法（ELISA）、放射免疫法（RIA）、免疫层析等，但这些检测方法都存在一些缺陷，限制了它们的在临床诊断中的大规模应用，如：酶联免疫法检测耗时长，操作繁琐，重复性差；放射免疫法需要使用特定的仪器且有放射性物质污染；免疫层析多用于定性检测，且该方法灵敏度较低。胶乳增强免疫比浊法具有操作简单、快速、灵敏度高、可应用于自动生化分析仪等优点，现在市场上虽然也有一些H-FABP的试剂盒是基于胶乳增强免疫比浊法，但是这些试剂或多或少的存在检测线性范围不够宽、检测灵敏度不够、试剂存放稳定性差、检测过程中抗干扰能力差等问题。
因此，现急需研究开发一种基于胶乳增强免疫比浊法的检测试剂盒，克服上述的各种缺陷，使H-FABP在急性心肌梗死的临床诊断上得以大规模的推广应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒；
本发明的目的之二是提供一种制备所述心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒的方法；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；所述的试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水；其中，所述的包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒粒径为90-200nm，优选为120-160nm，最优选为135nm。
本发明通过大量的试验发现，包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的粒径大小对于检测的灵敏度以及线性范围等有着非常显著的影响。本发明通过大量的试验最终确定，当包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒粒径为90-200nm，相比于其它粒径的胶乳颗粒，其检测的灵敏度及线性范围等特性有非常显著的改善或提升。由此，本发明试剂盒中的包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的粒径优选为90-200nm，其中,当包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的粒径为120-160nm时,检测的效果会进一步提升,当包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的粒径为135nm时，检测的灵敏度及线性范围的效果最好。
心型脂肪酸结合蛋白抗体包被胶乳颗粒可以有多种方法，诸如化学交联法、物理吸附法等；本发明通过实验发现，采用化学交联法制备的致敏胶乳颗粒，心型脂肪酸结合蛋白抗体与胶乳颗粒结合紧密，有利于试剂盒的稳定性。其中，采用下述步骤所制备的包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒，具有良好的检测结果稳定性：
（1）活化胶乳；（2）向活化后的胶乳中加入心型脂肪酸结合蛋白抗体进行胶乳致敏反应；（3）封闭、洗涤，即得。
其中，步骤（1）所述的活化胶乳包括以下步骤：将粒径为90-200nm的聚苯乙烯胶乳溶液用活化缓冲液稀释后加入溶有活化剂的活化缓冲液， 混合均匀，置于恒温摇床上反应；待反应完成后加入淬灭剂，混合均匀，继续置于恒温摇床上反应；按重量比计，步骤（1）中所述的聚苯乙烯胶乳溶液的浓度为5-10%，稀释完成后聚苯乙烯胶乳溶液的终浓度为0.5-5%，优选终浓度为1%；所述的恒温是10-40℃的温度，优选的为25℃；所述的活化缓冲液为磷酸盐缓冲液，优选为0.12M磷酸盐缓冲液；所述的活化剂是碳化二亚胺；所述的淬灭剂为2-巯基乙醇。
步骤（3）中所述封闭胶乳包括：加入反应终止液终止致敏反应后，再加入封闭溶液，进行封闭反应；所述的反应终止液优选为乙醇胺溶液，所述的封闭溶液可以为各种蛋白质溶液，优选为牛血清白蛋白溶液。
试剂的pH值范围对于检测的效果有一定的影响，具体到本发明，试剂Ⅰ的pH值范围优选为7.0-8.0，试剂Ⅱ的pH值的范围优选为6.5-8.5。
为了达到更好的检测效果，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-110g，表面活性剂0.05-3mL，促凝剂2-50g，防腐剂1-10mL，稳定剂1-60g，阻断剂1-10mL，螯合剂0.1-10g，余量为水；优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-30g，表面活性剂0.1-2mL，促凝剂6-25g，防腐剂2-6mL，稳定剂5-40g，阻断剂2-6mL，螯合剂0.5-4g，余量为水；更优选的,每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂15g，表面活性剂0.5mL，促凝剂15g，防腐剂4mL，稳定剂20g，阻断剂4mL，螯合剂2g，余量为水。
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒0.1-10g，生物缓冲剂5-100g，螯合剂0.1-10g，表面活性剂0.05-3mL，防腐剂1-10mL，助悬剂5-50mL，封闭剂5-50g，稳定剂50-150g，余量为水；优选的，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒0.5-5g，生物缓冲剂5-30g，螯合剂0.5-5g，表面活性剂0.5-3mL，防腐剂2-6mL，助悬剂10-30mL，封闭剂6-20g，稳定 剂60-100g，余量为水；更优选的，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒2g，生物缓冲剂15g，螯合剂2g，表面活性剂1.5mL，防腐剂4mL，助悬剂20mL，封闭剂10g，稳定剂80g，余量为水。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中的生物缓冲剂是为了维持反应体系pH值的稳定性，凡是有一定缓冲能力的物质均能作为本试剂盒的生物缓冲剂，在本检测试剂盒中为了达到更好的检测效果，试剂Ⅰ和试剂Ⅱ的生物缓冲剂优选为三羟甲基氨基甲烷（Tris）。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中的表面活性剂主要是促进试剂体系中各组分以及检测样本中各物质的均匀分散以提高检测的精密度，确保测定结果的重现性，同时减少样本浊度对检测结果的影响；因此，只要是具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中的表面活性剂，例如：吐温20、吐温40、曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等。本发明试剂盒为了保证试剂盒良好的品质，试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中的表面活性剂均优选为曲拉通100。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中的螯合剂能够络合检测样本中的金属离子以减少金属离子对检测结果的影响；因此，能够络合金属离子的各种螯合剂均能够适用于本发明，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐等；为了提高本发明试剂盒的优良特性，本发明试剂盒的试剂Ⅰ或试剂Ⅱ的螯合剂优选为乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中的防腐剂的作用是为了防止微生物的繁殖对试剂盒的品质带来不良影响，凡是能抑制微生物生长的物质均可作为本发明的防腐剂，经过对配方的优化，本发明试剂盒的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的防腐剂均选自Proclin300。
试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中的稳定剂主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间。本发明的试剂Ⅰ中的稳定剂优选为氯化钠 或/和蔗糖，试剂Ⅱ中的稳定剂优选为蔗糖。
试剂Ⅰ中的促凝剂可以促进抗原抗体反应，有利于胶乳颗粒交联物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围。本发明通过筛选实验发现，PEG-8000作为本发明检测试剂盒中的促凝剂，能够有效提升检测灵敏度和线性范围。
试剂Ⅰ中所述的阻断剂可以有效避免非特异性反应对检测结果的干扰。检测试剂盒中常见的干扰因素有以下两类：异嗜性抗体干扰、类风湿因子干扰。试剂Ⅰ中所述的阻断剂优选为类风湿因子阻断剂。
试剂Ⅱ中所述的助悬剂可以帮助胶乳颗粒维持一个很好的分散状态，防止胶乳颗粒下沉影响检测试剂盒的品质及开瓶稳定性，常用的助悬剂，例如乙二醇、丙三醇、乳糖和麦芽糖等，均能适用于本发明；为了达到更佳的检测效果，本发明优选乙二醇作为助悬剂。
试剂Ⅱ中所述封闭剂的作用是为了与胶乳颗粒中游离的-COOH位点结合，避免游离的羧基位点对检测结果造成不良影响；本发明试剂Ⅱ中优选牛血清白蛋白（BSA）作为封闭剂。
本发明检测试剂盒中所用到的每种成分或原料均能通过商业途径从生物试剂公司或医药公司购买得到。
本发明的另外一个目的是提供一种制备所述检测心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒的方法，包括：
（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；（2）制备试剂Ⅱ：将试剂Ⅱ中的生物缓冲剂，螯合剂，表面活性剂，防腐剂，助悬剂，封闭剂，稳定剂溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，后向溶液中加入包被抗体的胶乳颗粒，充分搅拌，混合均匀，定容；（3）将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
本发明的又一目的是提供所述心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒检测样品中心型脂肪酸结合蛋白含量的检测方法，该方法为两点终点法， 包括以下步骤：
向5μL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品）中加入160μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入40μL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长520nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
本发明检测试剂盒克服了现有的心型脂肪酸结合蛋白检测方法所存在的缺陷，具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、线性范围好测量准确度高、精确度好、抗类风湿因子的干扰能力强等优点，且检测操作简便，为心型脂肪酸结合蛋白的检测提供了一种安全、快捷、简单、准确、无污染的检测手段，有利于大规模推广和应用。
附图说明
图1本发明实施例1-5所制备的试剂盒的标准工作曲线。
图2本发明实施例3和对比实施例1-2所制备的试剂盒的标准工作曲线。
图3本发明实施例1和对比实施例4-5所制备的试剂盒的标准工作曲线。
图4本发明实施例5和对比实施例6-7所制备的试剂盒的标准工作曲线。
图5本发明试剂盒的热稳定性工作曲线。
图6对比例试剂盒的热稳定性工作曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
预备实施例1包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的制备
（1）活化胶乳：取1mL浓度为10%粒径为90nm的聚苯乙烯胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，得稀释胶乳溶液；准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）用1mL 0.12M磷酸盐缓 冲溶液溶解，并将此溶液加入稀释完成的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应1h；反应完成后向上述体系中加入2μL 2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应10min；
（2）致敏胶乳：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL心型脂肪酸结合蛋白多克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应2h；
（3）封闭胶乳：步骤（2）反应完成后，向体系中加入100μL 1M乙醇胺溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应15min，再向反应体系中加入200μL 10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应45min；
（4）洗涤胶乳：将（3）步反应完成的体系于15000转/min，离心30min，弃上清，并用超纯水洗涤沉淀两次，即得。
预备实施例2包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的制备
（1）活化胶乳：取1mL浓度为10%粒径为200nm的聚苯乙烯胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，得稀释胶乳溶液。准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）用1mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液溶解，并将此溶液加入稀释完成的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应1h；反应完成后向上述体系中加入2μL 2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应10min；
（2）致敏胶乳：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL 心型脂肪酸结合蛋白多克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应2h；
（3）封闭胶乳：步骤（2）反应完成后，向体系中加100μL 1M乙醇胺溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应15min，再向反应体系中加200μL 10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应45min；
（4）洗涤胶乳：将（3）步反应完成的体系于15000转/min，离心30min，弃上清，并用超纯水洗涤沉淀两次，即得。
预备实施例3包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的制备
（1）活化胶乳：取1mL浓度为10%粒径为120nm的聚苯乙烯胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，得稀释胶乳溶液。准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）用1mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液溶解，并将此溶液加入稀释完成的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应1h；反应完成后向上述体系中加入2μL 2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应10min；
（2）致敏胶乳：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL心型脂肪酸结合蛋白多克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应2h；
（3）封闭胶乳：步骤（2）反应完成后，向体系中加100μL 1M乙醇胺溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应15min，再向反应体系中加入200μL 10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应45min；
（4）洗涤胶乳：将（3）步反应完成的体系于15000转/min，离心30min，弃上清，并用超纯水洗涤沉淀两次，即得。
预备实施例4包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的制备
（1）活化胶乳：取1mL浓度为10%粒径为160nm的聚苯乙烯胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，得稀释胶乳溶液。准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）用1mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液溶解，并将此溶液加入稀释完成的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应1h；反应完成后向上述体系中加入2μL 2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应10min；
（2）致敏胶乳：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL心型脂肪酸结合蛋白多克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应2h；
（3）封闭胶乳：步骤（2）反应完成后，向体系中加入100μL 1M乙醇胺溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应15min，再向反应体系中加入200μL 10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应45min；
（4）洗涤胶乳：将（3）步反应完成的体系于15000转/min，离心30min，弃上清，并用超纯水洗涤沉淀两次，即得。
预备实施例5包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的制备
（1）活化胶乳：取1mL浓度为10%粒径为135nm的聚苯乙烯胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液，混合均匀，得稀释胶乳溶液。准确称取50mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）用1mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液溶解，并将此溶液加入稀释完成的胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应1h；反应完成后向上述体系中 加入2μL 2-巯基乙醇，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/min，反应10min；
（2）致敏胶乳：向（1）步反应完成的溶液中加入2mL 1mg/mL 心型脂肪酸结合蛋白多克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/min，反应2h；
（3）封闭胶乳：步骤（2）反应完成后，向体系中加入100μL 1M乙醇胺溶液（pH8.0），震荡混合均匀，并于室温下静置反应15min，再向反应体系中加200μL 10%浓度的BSA溶液，混合均匀，并于室温下静置反应45min；
（4）洗涤胶乳：将（3）步反应完成的体系于15000转/min，离心30min，弃上清，并用超纯水洗涤沉淀两次，即得。
实施例1心型脂肪酸结合蛋白胶乳检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将Tris、EDTA-2Na、牛血清白蛋白、TX-100、Proclin300、乙二醇以及蔗糖用800mL蒸馏水溶解，溶解完成后向溶液体系中加入包被抗体的胶乳颗粒，充分搅拌、混合均匀，后定容至1L，密封保存，备用。
实施例2心型脂肪酸结合蛋白胶乳检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将Tris、EDTA-2Na、牛血清白蛋白、TX-100、Proclin300、乙二醇以及蔗糖用800mL蒸馏水溶解，溶解完成后向溶液体系中加入包被抗体的胶乳颗粒，充分搅拌、混合均匀，后定容至1L，密封保存，备用。
实施例3心型脂肪酸结合蛋白胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将Tris、EDTA-2Na、牛血清白蛋白、TX-100、Proclin300、乙二醇以及蔗糖用800mL蒸馏水溶解，溶解完成后向溶液体系中加入包被抗体的胶乳颗粒，充分搅拌、混合均匀，后定容至1L，密封保存，备用。
实施例4心型脂肪酸结合蛋白胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将Tris、EDTA-2Na、牛血清白蛋白、TX-100、Proclin300、乙二醇以及蔗糖用800mL蒸馏水溶解，溶解完成后向溶液体系中加入包被抗体的胶乳颗粒，充分搅拌、混合均匀，后定容至1L，密封保存，备用。
实施例5心型脂肪酸结合蛋白胶乳检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将Tris、EDTA-2Na、牛血清白蛋白、TX-100、Proclin300、乙二醇以及蔗糖用800mL蒸馏水溶解，溶解完成后向溶液体系中加入包被抗体的胶乳颗粒，充分搅拌、混合均匀，后定容至1L，密封保存，备用。
对比实施例1
一、包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的制备
除了聚苯乙烯胶乳溶液的粒径为80nm外，其余均与预备实施例1相同。
二、试剂盒的制备
除了胶乳溶液中胶乳的粒径为80nm外，其余均与实施例1相同。
对比实施例2
一、包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的制备
除了聚苯乙烯胶乳溶液的粒径为210nm外，其余均与预备实施例2相同。
二、试剂盒的制备
除了胶乳溶液中胶乳的粒径为210nm外，其余均与实施例2相同。
对比实施例3
一、包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的制备（物理吸附法包被）
①取1mL浓度为10%粒径为80nm的胶乳溶液（购自PolyMicrospheres公司）于50mL离心管中，再向离心管中加入9mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液，震荡混合均匀，后再向离心管中加入8μL吐温-20，震荡混合均匀，将离心管置于离心机中于25000转/min，离心30min，弃上清，并用10mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液复溶沉淀；
②向上述复溶的胶乳溶液中加入0.5mL 1mg/mL心型脂肪酸结合蛋白多克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），于37℃搅拌反应1小时，离心弃上清，用0.12M磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀2次，并用20mL 0.12M磷酸盐缓冲溶液复溶沉淀；
③向②步所制得的溶液中加入4mL 10%BSA溶液，于25℃搅拌反应1小时，以封闭胶乳微球上多余的基团，离心弃上清，后用0.12M磷酸盐缓冲溶液洗涤沉淀2次，既得物理法包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒。
二、试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
将Tri s、EDTA-2Na、牛血清白蛋白、TX-100、Proclin300、乙二醇以及蔗糖用800mL蒸馏水溶解，溶解完成后向溶液体系中加入包被抗体的胶乳颗粒，充分搅拌、混合均匀，后定容至1L，密封保存，备用。
对比实施例4心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液中胶乳的粒径为60nm外，其余均与对比实施例1相同。
对比实施例5心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液中胶乳的粒径为230nm外，其余均与对比实施例2相同。
对比实施例6心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液中胶乳的粒径为40nm外，其余均与对比实施例1相同。
对比实施例7心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒的制备
除了胶乳溶液中胶乳的粒径为250nm外，其余均与对比实施例2相同。
试验例1本发明检测试剂盒的线性范围试验
1、试验样品
（1）供试样品：本发明实施例1-5所制备的心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒；
（2）对照样品：对比实施例1-7所制备的心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒；
2、试验方法
配制浓度为0mg/L，20mg/L，40mg/L，80mg/L，160mg/L的心型脂肪酸结合蛋白标准品溶液，用本发明实施例1-5所制备的心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒、对比实施例1-7所制备的心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒标准工作曲线。
各心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒检测样品中心型脂肪酸结合蛋白含量的检测方法，该方法为两点终点法，包括以下步骤：向5μL待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品）中加入160μL的试剂Ⅰ充分混匀，于37℃恒温5分钟，再向混合体系中加入40μL试剂Ⅱ，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长520nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
3、试验结果
根据各试剂盒检测结果所绘制的标准工作曲线可见，不论是实施例1还是实施例2-5所制备的检测试剂盒，其检测的线性范围均优于对比实施例1-7检测试剂盒的线性范围；此外，无论是在高浓度还是低浓度时，本 发明实施例1-5所制备的检测试剂盒相对于对比实施例1-7的检测试剂盒更能保持良好的线性；另外，本发明实施例5所制备的试剂盒的标准工作曲线较实施例1-4所制备的试剂盒的线性更为优良（图1、图2、图3及图4）。
试验例2本发明检测试剂盒热稳定性试验
1、试验样品
（1）供试样品：本发明实施例1-5制备的心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒；
（2）对照样品：对比实施例3制备的心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒；
2、试验方法及结果
将本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒与对比实施例3制备的检测试剂盒分别于37℃分别热处理0天、3天、5天和7天，并于不同的处理时间之后分别测定心型脂肪酸结合蛋白校准品，记录其ΔA值，并绘制其变化曲线。试验结果见图5及图6。从试验结果可见，本发明检测试剂盒的热稳定性要明显优于对比实施例检测试剂盒。
试验例3本发明检测试剂盒的抗干扰性实验
1、试验样品
本发明实施例1-5所制备的试剂盒。
2、试验方法及结果
在80ng/mL校准品中按表1中所示的类风湿因子的终浓度加入一定量的类风湿因子，再分别用本发明实施例1-5所制备的检测试剂盒和对比实施例1-7所制备的检测试剂盒对各样本进行检测，考察类风湿因子对各检测试剂盒的影响，结果见表1。
表1各检测试剂盒抗类风湿因子干扰性能比对实验结果
| 类风湿因子浓度（U/mL） | 0 | 100 | 200 | 300 | 500 |
| 本发明试剂盒测量均值 | 80 | 82.5 | 83.1 | 84.3 | 85.7 |
| 本发明试剂盒测量偏差(%) | 0.0 | 3.13 | 3.88 | 5.38 | 7.13 |
| 对比实施例测量均值 | 78.9 | 84.5 | 87.2 | 89.4 | 91.8 |
| 对比实施例测量偏差（%） | -1.38 | 5.63 | 9.00 | 11.75 | 14.75 |
从表1结果可见，本发明检测试剂盒抗类风湿因子的干扰能力要明显优于对比实施例所制备的检测试剂盒。
试验例4本发明检测试剂盒的准确度和精确度实验
1、试验样品
本发明实施例1-5制备的检测试剂盒
2、试验方法及结果
准确度和精确度是反应检测试剂盒测量结果的准确程度与可信程度。本试验例以英国朗道公司生产的心型脂肪酸结合蛋白质控品系列稀释后作为测试对象，评价本发明检测试剂盒的准确度和精确度，试验结果表2。
表2本发明试剂盒准确度及精确度检测试验结果
从表2的试验结果可见，本发明检测试剂盒测量结果与样本浓度的误差值较小，测量准确度高。同时测量结果的标准差率较小，说明本发明检测试剂盒的精确度好。
Claims (5)
1.一种心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，所述试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、表面活性剂、促凝剂、防腐剂、稳定剂、阻断剂、螯合剂和水；所述试剂Ⅱ的组分包括：包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂、稳定剂和水；具体如下：
试剂Ⅰ的各组分及每1升试剂Ⅰ的用量：
试剂Ⅱ的各组分及每1升试剂Ⅱ的用量：
所述包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒的粒径为135nm；
所述包被心型脂肪酸结合蛋白抗体的胶乳颗粒采用化学交联法制备得到，制备方法包括：(1)活化胶乳；(2)向活化后的胶乳中加入心型脂肪酸结合蛋白抗体进行胶乳致敏反应；(3)封闭、洗涤，即得。
2.按照权利要求1所述的心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)所述的活化胶乳包括以下步骤：将粒径为135nm的聚苯乙烯胶乳溶液用活化缓冲液稀释后加入溶有活化剂的活化缓冲液，混合均匀，置于恒温摇床上反应；待反应完成后加入淬灭剂，混合均匀，继续置于恒温摇床上反应；所述的聚苯乙烯胶乳溶液的浓度为5-10％；所述的恒温为25℃；所述的活化缓冲液为磷酸盐缓冲液，为0.12M磷酸盐缓冲液；所述的活化剂是碳化二亚胺；所述的淬灭剂为2-巯基乙醇；
步骤(3)中所述封闭包括：加入反应终止液终止致敏反应后，再加入封闭溶液，进行封闭反应；所述的反应终止液为乙醇胺溶液。
3.按照权利要求1所述的心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒，其特征在于：所述的心型脂肪酸结合蛋白抗体是心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体或多克隆抗体。
4.按照权利要求1-3任何一项的检测试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ的pH值的范围为7.0-8.0，试剂Ⅱ的pH值的范围为6.5-8.5。
5.一种制备权利要求1-4任何一项所述检测试剂盒的方法，包括：(1)制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容；(2)制备试剂Ⅱ：将试剂Ⅱ中的生物缓冲剂，螯合剂，表面活性剂，防腐剂，助悬剂，封闭剂，稳定剂溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，后向溶液中加入包被抗体的胶乳颗粒，充分搅拌，混合均匀，定容；(3)将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
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