CN105181969A - 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 - Google Patents
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,其中:试剂R1包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG、NaN3;试剂R2包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖、NGAL抗体致敏胶乳微粒;NGAL试剂参考标准品包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA、NaN3及不同含量的NGAL;NGAL抗体致敏胶乳微粒包括PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒,且PS纳米乳胶微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。本发明试剂组成构成简单、测试灵敏度好、线性范围广、稳定好,测试成本低廉,精度高,便于推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物蛋白检测技术方案,特别是一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒。
本申请中下列表达式的意义为:
0.01-0.2MNaCl:表示溶液中NaCl浓度为0.01-0.2mol/L;
0.1-3%蔗糖:表示每100mL溶液中加蔗糖0.1-3g。
Tris:三羟甲基氨基甲烷;
BSA:牛血清白蛋白;
EDTA:乙二胺四乙酸;
EDAC:水溶性碳二亚胺类交联剂;
PEG:聚乙二醇;
MES:一水吗啉乙磺酸;
PVN指聚乙烯基萘,VN指其单体;SDS指十二烷基磺酸钠;KPS指过硫酸钾;
本申请中跟上述表达式类似之处,所表达意义均跟上述意义类似;本申请中类似表达式另有说明的除外。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(简称NGAL)是1993年在中性粒细胞内首先被发现的,与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关。近年来国内外的研究表明,NGAL蛋白在多种疾发过程中具有特异性表达变化的特点,使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。
在发生缺血性和毒性肾损伤过程中,肾小管上皮细胞中的NGAL将显著增加,在开始的两个小时内,尿液和血液中NGAL水平将显著增加,因此NGAL是早期急性肾损伤的敏感标志物。
急性肾功能损伤预后将发展成为急性肾功能衰竭。通用的诊断方法如测定血清肌酐或者半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CystatinC),只能在损伤后一天甚者几天内检测。有研究表明,健康志愿者尿液中NGAL含量检测结果分布0.7-9.6ng/ml,平均值为5.3ng/ml。而血浆中的含量检测结果为37-106ng/ml,平均值为63ng/ml。当肾损伤后,随机检测重病患者,尿液NGAL的浓度为110ng/ml到40000ng/ml不等。而他们EDTA抗凝血浆检测结果为25ng/ml到3491ng/ml。根据急性肾衰竭患者检测的90%阳性预测值判断,尿液中NGAL的阳性判断值为350ng/ml,而血浆检测的阳性判断值为400ng/ml。
目前NGAL的测定方法主要有酶联免疫法、放射免疫法、Western-blotting以及化学发光法。酶联免疫法自动化程度不高,且受人为因素影响较大;放射免疫法存在着环境污染问题;Western-blotting操作复杂,测定精密度低;而化学发光法灵敏度虽高,但测定线性范围较小且检测成本较高,需要特定化学发光检测仪,这些原因导致其应用范围较小。
胶乳增强免疫透射比浊法也是测定人血浆或尿液中NGAL浓度的常用方法,该方法对仪器设备要求不高,没有环保和操作人员自身防护等问题。与其他测定方法比较,该方法简便快速、灵敏可靠,普通自动或半自动生化分析仪就可,有较大应用范围,较大的实用价值。
NGAL浓度在正常人尿液中低于10ng/ml,在重度肾病患者尿液中浓度可高达7000ng/ml以上。如此宽广的浓度范围,对检测试剂盒灵敏度和线性范围均提出了较高的要求。目前市场上已有胶乳增强免疫透射比浊法测定人血浆或尿液中NGAL浓度的试剂盒,但这些试剂盒无法同时满足宽线性范围和高灵敏度的要求,因此需要稀释样本才能测定高浓度NGAL,这在使用上带来了不便。
发明内容
为解决上述问题,本发明公开了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,组成构成简单、测试灵敏度好、线性范围广、稳定好,测试成本低廉,精度高,便于推广,在很大程度上能提高扩大检测的线性范围,提高检测灵敏度。
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品,其中:试剂R1包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG、NaN3;试剂R2包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖、NGAL抗体致敏胶乳微粒;NGAL试剂参考标准品包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA、NaN3及不同含量NGAL,所述NGAL抗体致敏胶乳微粒包括PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒(胶乳微粒中PVN纳米胶乳微粒的含量占胶乳微粒总体积的50-80%),且PS纳米乳胶微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。本方案中通过大粒径的PS微球和小粒径的PVN微球相配合,从而有利于在整体上改善试剂的检测灵敏度和扩大线性范围,较大粒径PS微球可以提高灵敏度,但偶联抗体量较小,线性范围也相应较窄。乙烯基萘(VN)因萘环与碳碳双键共轭,其在一定波长范围内的吸光值比苯乙烯强,从而可以通过较小粒径的PVN微粒来改善检测灵敏度和增强扩大检测的线性范围,同时经检测在同一波长下,粒径较小的PVN微球与粒径较大的PS微球具有相近的A值(紫外吸光光度法),并且采用混合型的微球体系有利于控制整体的成本和加工性能。
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进,PS纳米胶乳微粒的粒径为120nm-180nm.
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进,PVN纳米胶乳微粒的粒径为80nm-120nm。
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进,PVN纳米胶乳微粒的制备为:在PH8-10的碳酸盐缓冲液中,加入SDS、KPS以及VN单体,KPS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.1-0.3wt%,在常压保护气氛围和水浴条件下搅拌反应后,提取胶乳微粒并清洗后即可。
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进,SDS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.08-0.15wt%。本方案中SDS浓度的大小对所制备出的PVN纳米微球的粒径具有显著影响。当SDS浓度较大时,所生成的PVN胶束数目越多,而其形成的PVN胶束粒径却随之减小,在一定范围可用调节SDS浓度的方法来调节PVN乳胶粒的粒度,从而控制PVN纳米胶乳微粒的粒径为80nm-120nm。
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进,水浴的温度为70-85摄氏度。
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒的一种改进,保护气氛围为氮气和二氧化碳混合气,其中二氧化碳占混合气总量的5-15(v/v)%。通过采用氮气和二氧化碳混合气作为保护气,不仅仅可以起到保护隔绝降低杂质和副反应发生的作用,还可以通过调节二氧化碳的含量来调节和维持碳酸缓冲液的PH,提高缓冲液的缓冲能力,从而维持PVN胶乳微粒的制备稳定性,提高微粒的质量。
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品,其中:
试剂R1:
Tris10-100mM
NaCl50-200mM
BSA0.05%-1%
Tween-200.01%-0.1%
PEG0.5%-3%
NaN30.1%
试剂R2:
Tris10-100mM
NaCl50-200mM
BSA0.05%-1%
Tween-200.01%-0.1%
NaN30.1%
蔗糖1%-10%
NGAL抗体致敏胶乳微粒0.1%-1%,NGAL抗体致敏胶乳微粒直径50-150nm;
NGAL试剂参考标准品:
Tris10-100mM
NaCl50-200mM
BSA0.05%-1%
Tween-200.01%-0.1%
EDTA0.5-5mM
NaN30.1%
重组人NGAL蛋白纯品。
作为一种优选,所述试剂R1中PEG的数均分子量为6000。
作为一种优选,所述试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品的酸碱度均为pH7-8。
机理:
采用化学交联方法,将具有高特异性、高亲和力的NGAL抗体偶联至胶乳微粒表面的羧基官能团上,当此胶粒与样本混合时,在促凝剂作用下,抗体与样本中的抗原发生特异性结合,形成抗原-抗体-胶乳微粒复合物,产生一定的浊度变化。在一定范围内,反应液吸光度值与样本中抗原NGAL含量成正比关系。通过测定一系列已知浓度的NGAL标准品与NGAL试剂反应的吸光度,绘制标准曲线,便可根据待测样本的吸光度值测得NGAL含量。
本发明在免疫比浊法的基础上引入具有一定粒径的纳米微球,将抗体包被与微球表面,当抗体与样本中的抗原结合时,形成一个更大的抗原-抗体-胶乳微粒复合物,增加了浊度变化,从而提高了检测反应的灵敏度。另一方面,本发明采用化学偶联的技术,将抗体固定包被在微球表面,通过增加抗体结构的稳定性以提高试剂的稳定性。本发明试图通过计算与试验,寻找合适的微球、交联剂、抗体的比例,在提高检测灵敏度的同时,降低反应的非特异性。
附图说明
图1、本发明与市场上销售的国内知名品牌NGAL试剂盒的标准曲线比较
图2、本发明NGAL检测试剂盒检测线性范围
图3、本发明试剂盒与对照试剂盒检测临床样本的相关性比较
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式,进一步阐明本发明,应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
PVN纳米胶乳微粒的制备实施例
实施例1
本实施例中在PH8的碳酸盐缓冲液中,加入SDS、KPS以及VN单体,VN单体在碳酸盐缓冲液中的含量为3wt%,KPS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.1wt%,SDS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.15wt%,在常压保护气氛围和水浴条件下搅拌反应后,水浴的温度为83摄氏度,保护气氛围为氮气和二氧化碳混合气,其中二氧化碳占混合气总量的15(v/v)%。反应完成后,离心分离机高速分离后,再以去离子水或双蒸水清洗1-2遍后,再以去离子水或双蒸水清洗并用半透膜分离得到PVN纳米胶乳微粒,测定得到PVN纳米胶乳微粒的粒径为80nm。
实施例2
本实施例中在PH8.5的碳酸盐缓冲液中,加入SDS、KPS以及VN单体,VN单体在碳酸盐缓冲液中的含量为4wt%,KPS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.2wt%,SDS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.08wt%,在常压保护气氛围和水浴条件下搅拌反应后,水浴的温度为78摄氏度,保护气氛围为氮气和二氧化碳混合气,其中二氧化碳占混合气总量的12(v/v)%。反应完成后,离心分离机高速分离后,再以去离子水或双蒸水清洗1-2遍后,再以去离子水或双蒸水清洗并用半透膜分离得到PVN纳米胶乳微粒,测定得到PVN纳米胶乳微粒的粒径为120nm。
实施例3
本实施例中在PH9的碳酸盐缓冲液中,加入SDS、KPS以及VN单体,VN单体在碳酸盐缓冲液中的含量为5wt%,KPS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.3wt%,SDS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.10wt%,在常压保护气氛围和水浴条件下搅拌反应后,水浴的温度为75摄氏度,保护气氛围为氮气和二氧化碳混合气,其中二氧化碳占混合气总量的10(v/v)%。反应完成后,离心分离机高速分离后,再以去离子水或双蒸水清洗1-2遍后,再以去离子水或双蒸水清洗并用半透膜分离得到PVN纳米胶乳微粒,测定得到PVN纳米胶乳微粒的粒径为110nm。
实施例4
本实施例中在PH10的碳酸盐缓冲液中,加入SDS、KPS以及VN单体,VN单体在碳酸盐缓冲液中的含量为3.5wt%,KPS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.15wt%,SDS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.12wt%,在常压保护气氛围和水浴条件下搅拌反应后,水浴的温度为85摄氏度,保护气氛围为氮气和二氧化碳混合气,其中二氧化碳占混合气总量的5(v/v)%。反应完成后,离心分离机高速分离后,再以去离子水或双蒸水清洗1-2遍后,再以去离子水或双蒸水清洗并用半透膜分离得到PVN纳米胶乳微粒,测定得到PVN纳米胶乳微粒的粒径为105nm。
实施例5
本实施例中在PH9.5的碳酸盐缓冲液中,加入SDS、KPS以及VN单体,VN单体在碳酸盐缓冲液中的含量为4.5wt%,KPS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.25wt%,SDS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.125wt%,在常压保护气氛围和水浴条件下搅拌反应后,水浴的温度为70摄氏度,保护气氛围为氮气和二氧化碳混合气,其中二氧化碳占混合气总量的7(v/v)%。反应完成后,离心分离机高速分离后,再以去离子水或双蒸水清洗1-2遍后,再以去离子水或双蒸水清洗并用半透膜分离得到PVN纳米胶乳微粒,测定得到PVN纳米胶乳微粒的粒径为90nm。
区别地,本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品,其中:试剂R1包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG、NaN3;试剂R2包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖、NGAL抗体致敏胶乳微粒;NGAL试剂参考标准品包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA、NaN3及不同含量NGAL,所述NGAL抗体致敏胶乳微粒包括PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒,NGAL抗体致敏胶乳微粒为120nm的PS纳米胶乳微粒(PS纳米乳胶微粒的尺寸还可以为123、127、130、131、138、140、142、148、150、154、157、160、163、169、170、172、177以及120nm-180nm范围内的其它任意值)和80nm的PVN纳米胶乳微粒(PVN纳米胶乳微粒的尺寸还可以为82、88、90、93、96、98、100、103、012、107、109、110、112、114、117、120以及80nm-120nm范围内的其它任意值),其中PVN纳米胶乳微粒的含量占胶乳微粒总体积的50%(PVN纳米胶乳微粒占胶乳微粒总量的体积分数还可以为52%、55%、58%、60%、61%、63%、66%、67%、69%、70%、72%、74%、75%、77%、78%以及50-80%范围内的其它任意值)。另外需要特别说明的是体系中PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒的尺寸的选择,需要严格地保证PS纳米胶乳微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。
本发明技术方案中包括而不限于上述实施例列举技术方案所制得的PVN纳米胶乳微粒,均具有良好的粒径分布性,粒径分布系数均不大于0.035,同时均满足抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂的要求。
测试条件与方法
仪器:日立7060全自动生化分析仪
参数设置:
操作步骤:双试剂操作
3μl样品(校准品或临床样本)与300μl试剂R1混匀,于37℃孵育5分钟后,加入100μl试剂R2,混匀,37℃孵育30秒后读取吸光度A1,再孵育5分钟后读取吸光度值A2,计算吸光度变化ΔA=A2-A1。以NGAL校准品浓度为X轴,以各浓度校准品测得的ΔA为Y轴绘制标准曲线,以待测样本△A在定标曲线上对应X轴上的值即可求得其NGAL的含量。
实施例1
试剂R1:pH7.4
Tris50mM
NaCl150mM
BSA0.5%
Tween-200.1%
PEG60001.5%
NaN30.1%
试剂R2:pH7.4
Tris50mM
NaCl150mM
BSA0.5%
Tween-200.1%
NaN30.1%
蔗糖5%
NGAL抗体致敏胶乳微粒0.5%
NGAL抗体致敏胶乳微粒为120nm的PS纳米胶乳微粒(PS纳米乳胶微粒的尺寸还可以为123、127、130、131、138、140、142、148、150、154、157、160、163、169、170、172、177以及120nm-180nm范围内的其它任意值)和80nm的PVN纳米胶乳微粒(PVN纳米胶乳微粒的尺寸还可以为82、88、90、93、96、98、100、103、012、107、109、110、112、114、117、120以及80nm-120nm范围内的其它任意值),其中PVN纳米胶乳微粒的含量占胶乳微粒总体积的50%(PVN纳米胶乳微粒占胶乳微粒总量的体积分数还可以为52%、55%、58%、60%、61%、63%、66%、67%、69%、70%、72%、74%、75%、77%、78%以及50-80%范围内的其它任意值)。另外需要特别说明的是体系中PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒的尺寸的选择,需要严格地保证PS纳米胶乳微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液:pH7.4
Tris50mM
NaCl150mM
BSA0.5%
Tween-200.1%
EDTA2mM
NaN30.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀释,以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
实施例2
试剂R1:pH7
Tris10mM
NaCl125mM
BSA0.05%
Tween-200.05%
PEG60001%
NaN30.1%
试剂R2:pH7
Tris20mM
NaCl100mM
BSA0.05%
Tween-200.08%
NaN30.1%
蔗糖2%
NGAL抗体致敏胶乳微粒0.1%
NGAL抗体致敏胶乳微粒为120nm的PS纳米胶乳微粒(PS纳米乳胶微粒的尺寸还可以为123、127、130、131、138、140、142、148、150、154、157、160、163、169、170、172、177以及120nm-180nm范围内的其它任意值)和80nm的PVN纳米胶乳微粒(PVN纳米胶乳微粒的尺寸还可以为82、88、90、93、96、98、100、103、012、107、109、110、112、114、117、120以及80nm-120nm范围内的其它任意值),其中PVN纳米胶乳微粒的含量占胶乳微粒总体积的50%(PVN纳米胶乳微粒占胶乳微粒总量的体积分数还可以为52%、55%、58%、60%、61%、63%、66%、67%、69%、70%、72%、74%、75%、77%、78%以及50-80%范围内的其它任意值)。另外需要特别说明的是体系中PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒的尺寸的选择,需要严格地保证PS纳米胶乳微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液:pH7
Tris40mM
NaCl70mM
BSA0.05%
Tween-200.03%
EDTA5mM
NaN30.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀释,以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
实施例3
试剂R1:pH7.5
Tris100mM
NaCl50mM
BSA1%
Tween-200.01%
PEG60000.5%
NaN30.1%
试剂R2:pH7.5
Tris100mM
NaCl50mM
BSA1%
Tween-200.01%
NaN30.1%
蔗糖10%
NGAL抗体致敏胶乳微粒1%
NGAL抗体致敏胶乳微粒为120nm的PS纳米胶乳微粒(PS纳米乳胶微粒的尺寸还可以为123、127、130、131、138、140、142、148、150、154、157、160、163、169、170、172、177以及120nm-180nm范围内的其它任意值)和80nm的PVN纳米胶乳微粒(PVN纳米胶乳微粒的尺寸还可以为82、88、90、93、96、98、100、103、012、107、109、110、112、114、117、120以及80nm-120nm范围内的其它任意值),其中PVN纳米胶乳微粒的含量占胶乳微粒总体积的50%(PVN纳米胶乳微粒占胶乳微粒总量的体积分数还可以为52%、55%、58%、60%、61%、63%、66%、67%、69%、70%、72%、74%、75%、77%、78%以及50-80%范围内的其它任意值)。另外需要特别说明的是体系中PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒的尺寸的选择,需要严格地保证PS纳米胶乳微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液:pH7.5
Tris10mM
NaCl200mM
BSA1%
Tween-200.01%
EDTA0.5mM
NaN30.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀释,以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
实施例4
试剂R1:pH7.8
Tris20mM
NaCl200mM
BSA0.6%
Tween-200.02%
PEG60003%
NaN30.1%
试剂R2:pH7.8
Tris10mM
NaCl200mM
BSA0.75%
Tween-200.05%
NaN30.1%
蔗糖1%
NGAL抗体致敏胶乳微粒0.8%
NGAL抗体致敏胶乳微粒为120nm的PS纳米胶乳微粒(PS纳米乳胶微粒的尺寸还可以为123、127、130、131、138、140、142、148、150、154、157、160、163、169、170、172、177以及120nm-180nm范围内的其它任意值)和80nm的PVN纳米胶乳微粒(PVN纳米胶乳微粒的尺寸还可以为82、88、90、93、96、98、100、103、012、107、109、110、112、114、117、120以及80nm-120nm范围内的其它任意值),其中PVN纳米胶乳微粒的含量占胶乳微粒总体积的50%(PVN纳米胶乳微粒占胶乳微粒总量的体积分数还可以为52%、55%、58%、60%、61%、63%、66%、67%、69%、70%、72%、74%、75%、77%、78%以及50-80%范围内的其它任意值)。另外需要特别说明的是体系中PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒的尺寸的选择,需要严格地保证PS纳米胶乳微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液:pH7.8
Tris100mM
NaCl50mM
BSA0.2%
Tween-200.05%
EDTA4mM
NaN30.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀释,以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
实施例5
试剂R1:pH8
Tris80mM
NaCl75mM
BSA0.08%
Tween-200.08%
PEG60002%
NaN30.1%
试剂R2:pH8
Tris45mM
NaCl175mM
BSA0.08%
Tween-200.07%
NaN30.1%
蔗糖4%
NGAL抗体致敏胶乳微粒0.6%
NGAL抗体致敏胶乳微粒为120nm的PS纳米胶乳微粒(PS纳米乳胶微粒的尺寸还可以为123、127、130、131、138、140、142、148、150、154、157、160、163、169、170、172、177以及120nm-180nm范围内的其它任意值)和80nm的PVN纳米胶乳微粒(PVN纳米胶乳微粒的尺寸还可以为82、88、90、93、96、98、100、103、012、107、109、110、112、114、117、120以及80nm-120nm范围内的其它任意值),其中PVN纳米胶乳微粒的含量占胶乳微粒总体积的50%(PVN纳米胶乳微粒占胶乳微粒总量的体积分数还可以为52%、55%、58%、60%、61%、63%、66%、67%、69%、70%、72%、74%、75%、77%、78%以及50-80%范围内的其它任意值)。另外需要特别说明的是体系中PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒的尺寸的选择,需要严格地保证PS纳米胶乳微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液:pH8
Tris70mM
NaCl175mM
BSA0.6%
Tween-200.08%
EDTA3mM
NaN30.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀释,以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
实施例6
试剂R1:pH7.2
Tris450mM
NaCl180mM
BSA0.8%
Tween-200.06%
PEG60002.5%
NaN30.1%
试剂R2:pH7.2
Tris80mM
NaCl85mM
BSA0.25%
Tween-200.03%
NaN30.1%
蔗糖8%
NGAL抗体致敏胶乳微粒0.4%
NGAL抗体致敏胶乳微粒为120nm的PS纳米胶乳微粒(PS纳米乳胶微粒的尺寸还可以为123、127、130、131、138、140、142、148、150、154、157、160、163、169、170、172、177以及120nm-180nm范围内的其它任意值)和80nm的PVN纳米胶乳微粒(PVN纳米胶乳微粒的尺寸还可以为82、88、90、93、96、98、100、103、012、107、109、110、112、114、117、120以及80nm-120nm范围内的其它任意值),其中PVN纳米胶乳微粒的含量占胶乳微粒总体积的50%(PVN纳米胶乳微粒占胶乳微粒总量的体积分数还可以为52%、55%、58%、60%、61%、63%、66%、67%、69%、70%、72%、74%、75%、77%、78%以及50-80%范围内的其它任意值)。另外需要特别说明的是体系中PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒的尺寸的选择,需要严格地保证PS纳米胶乳微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液:pH7.2
Tris20mM
NaCl95mM
BSA0.8%
Tween-200.04%
EDTA2.5mM
NaN30.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度(150、300、600、1500、3000、5000ng/ml)溶解稀释,以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
鉴于本发明方案实施例众多,各实施例实验数据庞大众多,不适于于此处逐一列举说明,但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近,均可以证明本发明之试剂盒反应灵敏,对NGAL检测性能良好,检测结果线性程度高,便于在测试过程中得到精度较高的测试结果,故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明。下述结论同样适用于本发明方式所有实施技术方案(包括而不限于上述列举的实施例的技术方案)。
下面以实施例1为例进行分析(如图1-3所示)
1、检测方法
仪器:日立7060全自动生化分析仪
参数设置:
操作步骤:样品(标准品或临床样本)与试剂R1混匀,于37℃孵育5分钟后,加入试剂R2,混匀,37℃孵育30秒后读取吸光度A1,再孵育5分钟后读取吸光度值A2,ΔA=A2-A1。以NGAL标准品浓度为X轴,以各浓度标准品测得的ΔA为Y轴绘制标准曲线,以待测样本△A在定标曲线上即可求得相应NGAL的含量。
2、NGAL标准曲线
将实施例1中的NGAL试剂盒与国内知名品牌NGAL测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)按照各自的检测方法绘制标准曲线(附图1)。表明本发明试剂盒空白吸光度相对较低,具有更高的灵敏度与线性范围。
3、灵敏度检测
测定空白液和4个不同NGAL浓度含量样品的ΔA,每个样品测10次,计算平均值和标准偏差(SD),以(样本吸光度-3SD)大于(空白吸光度+3SD)的样本浓度作为NGAL检测试剂盒的最低检测灵敏度。从下表可见,本发明检测试剂盒的灵敏度为7.5ng/ml。
4、线性测定
取一份NGAL高值血清,梯度增加样本检测量,用实施例1中试剂盒检测样本中NGAL含量,根据NGAL理论含量的梯度分析检测结果,如图2所示,发现本试剂盒线性检测范围高达8000ng/ml,R2=0.9947。
NGAL理论浓度梯度 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
NGAL测定浓度(ng/ml) | 0 | 1613 | 3732 | 6313 | 8127 |
5、相关性分析
分别用本发明实施例1中的试剂盒和对照试剂(国内知名品牌NGAL测定试剂盒)同时检测50份临床血清样本(包含正常和异常样本)中NGAL含量,以对照试剂检测样本的NGAL含量为横坐标,以本发明试剂盒检测的NGAL含量为纵坐标,做回归分析,检测结果见附图3,回归方程为Y=1.0505X-22.289,相关系数R=0.9948。该结果表明本发明试剂盒同对照试剂盒对于临床样本检测的相关性良好。
6、稳定性研究
将发明NGAL检测试剂盒试剂R1、R2置于2-8℃冷库与37℃水浴中,分别在存放前、2-8℃冷库存放3个月、6个月和12个月及37℃水浴7天后对校准品进行定标分析,记录ΔA(*10000)值。结果如下表所示,本研究研制的NGAL检测试剂盒具有良好的稳定性,在2-8℃冷库存放一年后,或在37℃水浴7天后,均保持90%以上的反应活性。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案,同样都在本发明要求保护的范围内;同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中,在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案),而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系,其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换,特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段,还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品,其中:试剂R1包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG、NaN3;试剂R2包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖、NGAL抗体致敏胶乳微粒;NGAL试剂参考标准品包括Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA、NaN3及不同含量的NGAL,其特征在于:所述NGAL抗体致敏胶乳微粒包括PS纳米胶乳微粒和PVN纳米胶乳微粒,且PS纳米胶乳微粒的粒径大于PVN纳米胶乳微粒的粒径。
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,其特征在于:所述PS纳米胶乳微粒的粒径为120nm-180nm。
3.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,其特征在于:所述PVN纳米胶乳微粒的粒径为80nm-120nm。
4.根据权利要求1或3所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,其特征在于:所述PVN纳米胶乳微粒的制备为:在PH8-10的碳酸盐缓冲液中,加入SDS、KPS以及VN单体,KPS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.1-0.3%,在常压保护气氛围和水浴条件下搅拌反应后,提取胶乳微粒并清洗后即可。
5.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,其特征在于:所述SDS在碳酸盐缓冲液中的含量为0.08-0.15%。
6.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,其特征在于:所述水浴的温度为70-85摄氏度。
7.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,其特征在于:所述保护气氛围为氮气和二氧化碳混合气,其中二氧化碳占混合气总量的5-15(v/v)%。
8.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒,其特征在于:所述试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品的酸碱度均为pH7-8。
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