CN104198732A - 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 - Google Patents
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品，其中：试剂R1：Tris10-100mM；NaCl50-200mM；BSA0.05%-1%；Tween-200.01%-0.1%；PEG0.5%-3%；NaN30.1%；试剂R2：Tris10-100mM；NaCl50-200mM；BSA 0.05%-1%；Tween-200.01%-0.1%；NaN30.1%；蔗糖1%-10%；NGAL抗体致敏胶乳微粒0.1%-1%；NGAL试剂参考标准品：Tris10-100mM；NaCl50-200mM；BSA0.05%-1%；Tween-200.01%-0.1%；EDTA0.5-5mM；NaN30.1%。本发明试剂组成构成简单、测试灵敏度好、线性范围广、稳定好，测试成本低廉，精度高，便于推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物蛋白检测技术方案，特别是一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒。
本申请中下列表达式的意义为：
0.01-0.2M NaCl：表示溶液中NaCl浓度为0.01-0.2mol/L；
0.1-3% 蔗糖：表示每100mL溶液中加蔗糖0.1-3g。
Tris：三羟甲基氨基甲烷；
BSA：牛血清白蛋白；
EDTA：乙二胺四乙酸；
EDAC:水溶性碳二亚胺类交联剂；
PEG：聚乙二醇；
MES：一水吗啉乙磺酸
本申请中跟上述表达式类似之处，所表达意义均跟上述意义类似；本申请中类似表达式另有说明的除外。
背景技术
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白( 简称NGAL) 是1993 年在中性粒细胞内首先被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程相关。近年来国内外的研究表明，NGAL 蛋白在多种疾发过程中具有特异性表达变化的特点，使得NGAL 成为检测疾病的生物标志物。
在发生缺血性和毒性肾损伤过程中，肾小管上皮细胞中的NGAL 将显著增加，在开始的两个小时内，尿液和血液中NGAL 水平将显著增加，因此NGAL 是早期急性肾损伤的敏感标志物。
急性肾功能损伤预后将发展成为急性肾功能衰竭。通用的诊断方法如测定血清肌酐或者半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C)，只能在损伤后一天甚者几天内检测。有研究表明，健康志愿者尿液中NGAL 含量检测结果分布0.7-9.6ng/ml，平均值为5.3ng/ml。而血浆中的含量检测结果为37-106ng/ml，平均值为63ng/ml。当肾损伤后，随机检测重病患者，尿液NGAL 的浓度为110ng/ml 到40000ng/ml 不等。而他们EDTA 抗凝血浆检测结果为25ng/ml 到3491ng/ml。根据急性肾衰竭患者检测的90％阳性预测值判断，尿液中NGAL 的阳性判断值为350ng/ml，而血浆检测的阳性判断值为400ng/ml。
目前NGAL的测定方法主要有酶联免疫法、放射免疫法、Western-blotting以及化学发光法。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大；放射免疫法存在着环境污染问题；Western-blotting操作复杂，测定精密度低；而化学发光法灵敏度虽高，但测定线性范围较小且检测成本较高，需要特定化学发光检测仪，这些原因导致其应用范围较小。
胶乳增强免疫透射比浊法也是测定人血浆或尿液中NGAL浓度的常用方法，该方法对仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题。与其他测定方法比较，该方法简便快速、灵敏可靠，普通自动或半自动生化分析仪就可，有较大应用范围，较大的实用价值。
NGAL浓度在正常人尿液中低于10ng/ml，在重度肾病患者尿液中浓度可高达7000ng/ml以上。如此宽广的浓度范围，对检测试剂盒灵敏度和线性范围均提出了较高的要求。目前市场上已有胶乳增强免疫透射比浊法测定人血浆或尿液中NGAL浓度的试剂盒，但这些试剂盒无法同时满足宽线性范围和高灵敏度的要求，因此需要稀释样本才能测定高浓度NGAL，这在使用上带来了不便。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，组成构成简单、测试灵敏度好、线性范围广、稳定好，测试成本低廉，精度高，便于推广。
本发明公开的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品，其中：
试剂R1：
Tris 10-100mM
NaCl 50-200mM
BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%-0.1%
PEG 0.5%-3%
NaN3 0.1%
试剂R2：
Tris 10-100mM
NaCl 50-200mM
BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%-0.1%
NaN3 0.1%
蔗糖 1%-10%
NGAL抗体致敏胶乳微粒 0.1%-1%，NGAL抗体致敏胶乳微粒直径50-150nm；
NGAL试剂参考标准品：
Tris 10-100mM
NaCl 50-200mM
BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%-0.1%
EDTA 0.5-5mM
NaN3 0.1%。
作为一种优选，所述试剂R1中PEG的数均分子量为6000。
作为一种优选，所述试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品的酸碱度均为pH7-8。
作为一种优选，所述试剂R2中NGAL抗体致敏胶乳微粒为50-150nm聚苯乙烯乳胶微粒，其中功能基团为羧基功能基团。
作为一种优选，所述试剂R2中NGAL抗体致敏胶乳微粒通过如下步骤制得：
（1）用MES缓冲液将表面带有羧基功能基团、直径50-150nm的聚苯乙烯微粒稀释至终浓度为0.5-3%（wt），加入20-90mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应20-80分钟；
（2）离心步骤（1）混合液弃上清液，用MES缓冲液清洗两次，最终胶乳微粒重悬于 MES缓冲液至终浓度为2%，超声进行分散，得微粒分散液；
（3）用MES缓冲液稀释NGAL抗体至2mg/ml，与步骤（2）中微粒分散液等体积混合，于室温反应2-4小时；
（4）将步骤（3）反应液18000rpm离心30min后，用Tris缓冲液重悬微粒，室温封闭反应1-3小时；
（5）离心步骤（4）反应液，弃上清液，用Tris缓冲液清洗胶乳3次，最后用R2试剂保存液重悬胶乳沉淀并稀释至1%，超声充分分散后即获得NGAL抗体致敏胶乳微粒。
作为一种优选，步骤（1）至步骤（3）中所述MES缓冲液为酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液。其中酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液的配置步骤为，将10.6625g的MES溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准氢氧化钠溶液调整酸碱度至PH=6，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液。
作为一种优选，步骤（4）以及步骤（5）中所述Tris缓冲液为pH7.4并且含0.5% BSA、0.1% Tween-20的50mM Tris缓冲液。50mM Tris缓冲液的配置的配置步骤为：将6.057gTris溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准氯化氢溶液调整酸碱度至适当范围，如PH=7，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到复合要求的50mM Tris缓冲液。
机理：
采用化学交联方法，将具有高特异性、高亲和力的NGAL抗体偶联至聚苯乙烯胶乳微粒表面的羧基官能团上，当此胶粒与样本混合时，在促凝剂作用下，抗体与样本中的抗原发生特异性结合，形成抗原-抗体-胶乳微粒复合物，产生一定的浊度变化。在一定范围内，反应液吸光度值与样本中抗原NGAL含量成正比关系。通过测定一系列已知浓度的NGAL标准品与NGAL试剂反应的吸光度，绘制标准曲线，便可根据待测样本的吸光度值测得NGAL含量。
本发明在免疫比浊法的基础上引入具有一定粒径的纳米微球，将抗体包被与微球表面，当抗体与样本中的抗原结合时，形成一个更大的抗原-抗体-胶乳微粒复合物，增加了浊度变化，从而提高了检测反应的灵敏度。另一方面，本发明采用化学偶联的技术，将抗体固定包被在微球表面，通过增加抗体结构的稳定性以提高试剂的稳定性。本发明试图通过计算与试验，寻找合适的微球、交联剂、抗体的比例，在提高检测灵敏度的同时，降低反应的非特异性。
附图说明
图1、本发明与市场上销售的国内知名品牌NGAL试剂盒的标准曲线比较
图2、 本发明NGAL检测试剂盒检测线性范围
图3 、本发明试剂盒与对照试剂盒检测临床样本的相关性比较
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
测试条件与方法
仪器：日立7060 全自动生化分析仪
参数设置：
| 波长 | 570nm/800nm | 校正类型 | 非线性 |
| 样本/R1/R2（用量μl） | 3/300/100 | 血清+R1时间 | 3~5min |
| 方法 | 两点终点法 | 加入R2后反应时间 | 5min |
| 校正方法 | 六点定标 | 反应方向 | 向上 |
操作步骤：双试剂操作
3μl样品（校准品或临床样本）与300μl试剂R1 混匀，于37℃孵育5 分钟后，加入100μl试剂R2，混匀，37℃孵育30秒后读取吸光度A1，再孵育5分钟后读取吸光度值A2，计算吸光度变化ΔA=A2-A1。以NGAL校准品浓度为X轴，以各浓度校准品测得的ΔA为Y轴绘制标准曲线，以待测样本△A在定标曲线上对应X轴上的值即可求得其NGAL的含量。
实施例1
试剂R1：pH7.4
Tris 50mM
NaCl 150mM
BSA 0.5%
Tween-20 0.1%
PEG6000 1.5%
NaN3 0.1%
试剂R2：pH7.4
Tris 50mM
NaCl 150mM
BSA 0.5%
Tween-20 0.1%
NaN3 0.1%
蔗糖 5%
NGAL抗体致敏胶乳微粒 0.5%
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液：pH7.4
Tris 50mM
NaCl 150mM
BSA 0.5%
Tween-20 0.1%
EDTA 2mM
NaN3 0.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度（150、300、600、1500、3000、5000ng/ml）溶解稀释，以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
其中NGAL抗体致敏胶乳微粒制备过程为：
（1）用50mM MES缓冲液（pH6.0）将表面带有羧基功能基团、直径100nm的聚苯乙烯稀释至终浓度为0.5%，加入50mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应20分钟；
（2）离心弃上清，用50mM MES缓冲液（pH6.0）清洗两次，最终胶乳微粒重悬于50mM MES缓冲液（pH6.0）至终浓度为2%，超声进行分散；
（3）用50mM MES缓冲液（pH6.0）稀释NGAL抗体（多克隆抗体或单克隆抗体）至2mg/ml，与步骤（2）中活化微粒等体积混合，于室温反应2小时；
（4）上述反应液18000rpm离心30min，用含0.5% BSA、0.1% Tween-20的50mM Tris缓冲液（pH7.4）重悬微粒，室温封闭反应1小时；
（5）离心弃上清，用同一缓冲液清洗胶乳3次，最后用R2试剂保存液（50mM Tris、0.15M NaCl、0.5% BSA、0.1% Tween-20 、0.1% NaN3、5%蔗糖）重悬胶乳沉淀并稀释至1%，超声充分分散后即获得NGAL抗体致敏胶乳微粒。
实施例2
试剂R1：pH7
Tris 10mM
NaCl 125mM
BSA 0.05%
Tween-20 0.05%
PEG6000 1%
NaN3 0.1%
试剂R2：pH7
Tris 20mM
NaCl 100mM
BSA 0.05%
Tween-20 0.08%
NaN3 0.1%
蔗糖 2%
NGAL抗体致敏胶乳微粒 0.1%
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液：pH7
Tris 40mM
NaCl 70mM
BSA 0.05%
Tween-20 0.03%
EDTA 5mM
NaN3 0.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度（150、300、600、1500、3000、5000ng/ml）溶解稀释，以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
其中NGAL抗体致敏胶乳微粒制备过程为：
（1）用50mM MES缓冲液（pH6.0）将表面带有羧基功能基团、直径50nm的聚苯乙烯稀释至终浓度为1.5%，加入80mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应30分钟；
（2）离心弃上清，用50mM MES缓冲液（pH6.0）清洗两次，最终胶乳微粒重悬于50mM MES缓冲液（pH6.0）至终浓度为2%，超声进行分散；
（3）用50mM MES缓冲液（pH6.0）稀释NGAL抗体（多克隆抗体或单克隆抗体）至2mg/ml，与步骤（2）中活化微粒等体积混合，于室温反应4小时；
（4）上述反应液18000rpm离心30min，用含0.5% BSA、0.1% Tween-20的50mM Tris缓冲液（pH7.4）重悬微粒，室温封闭反应1.5小时；
（5）离心弃上清，用同一缓冲液清洗胶乳3次，最后用R2试剂保存液（50mM Tris、0.15M NaCl、0.5% BSA、0.1% Tween-20 、0.1% NaN3、5%蔗糖）重悬胶乳沉淀并稀释至1%，超声充分分散后即获得NGAL抗体致敏胶乳微粒。
实施例3
试剂R1：pH7.5
Tris 100mM
NaCl 50mM
BSA 1%
Tween-20 0.01%
PEG6000 0.5%
NaN3 0.1%
试剂R2：pH7.5
Tris 100mM
NaCl 50mM
BSA 1%
Tween-20 0.01%
NaN3 0.1%
蔗糖 10%
NGAL抗体致敏胶乳微粒 1%
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液：pH7.5
Tris 10mM
NaCl 200mM
BSA 1%
Tween-20 0.01%
EDTA 0.5mM
NaN3 0.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度（150、300、600、1500、3000、5000ng/ml）溶解稀释，以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
其中NGAL抗体致敏胶乳微粒制备过程为：
（1）用50mM MES缓冲液（pH6.0）将表面带有羧基功能基团、直径75nm的聚苯乙烯稀释至终浓度为2%，加入20mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应80分钟；
（2）离心弃上清，用50mM MES缓冲液（pH6.0）清洗两次，最终胶乳微粒重悬于50mM MES缓冲液（pH6.0）至终浓度为2%，超声进行分散；
（3）用50mM MES缓冲液（pH6.0）稀释NGAL抗体（多克隆抗体或单克隆抗体）至2mg/ml，与步骤（2）中活化微粒等体积混合，于室温反应3小时；
（4）上述反应液18000rpm离心30min，用含0.5% BSA、0.1% Tween-20的50mM Tris缓冲液（pH7.4）重悬微粒，室温封闭反应2小时；
（5）离心弃上清，用同一缓冲液清洗胶乳3次，最后用R2试剂保存液（50mM Tris、0.15M NaCl、0.5% BSA、0.1% Tween-20 、0.1% NaN3、5%蔗糖）重悬胶乳沉淀并稀释至1%，超声充分分散后即获得NGAL抗体致敏胶乳微粒。
实施例4
试剂R1：pH7.8
Tris 20mM
NaCl 200mM
BSA 0.6%
Tween-20 0.02%
PEG6000 3%
NaN3 0.1%
试剂R2：pH7.8
Tris 10mM
NaCl 200mM
BSA 0.75%
Tween-20 0.05%
NaN3 0.1%
蔗糖 1%
NGAL抗体致敏胶乳微粒 0.8%
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液：pH7.8
Tris 100mM
NaCl 50mM
BSA 0.2%
Tween-20 0.05%
EDTA 4mM
NaN3 0.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度（150、300、600、1500、3000、5000ng/ml）溶解稀释，以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
其中NGAL抗体致敏胶乳微粒制备过程为：
（1）用50mM MES缓冲液（pH6.0）将表面带有羧基功能基团、直径150nm的聚苯乙烯稀释至终浓度为3%，加入90mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应45分钟；
（2）离心弃上清，用50mM MES缓冲液（pH6.0）清洗两次，最终胶乳微粒重悬于50mM MES缓冲液（pH6.0）至终浓度为2%，超声进行分散；
（3）用50mM MES缓冲液（pH6.0）稀释NGAL抗体（多克隆抗体或单克隆抗体）至2mg/ml，与步骤（2）中活化微粒等体积混合，于室温反应2.5小时；
（4）上述反应液18000rpm离心30min，用含0.5% BSA、0.1% Tween-20的50mM Tris缓冲液（pH7.4）重悬微粒，室温封闭反应3小时；
（5）离心弃上清，用同一缓冲液清洗胶乳3次，最后用R2试剂保存液（50mM Tris、0.15M NaCl、0.5% BSA、0.1% Tween-20 、0.1% NaN3、5%蔗糖）重悬胶乳沉淀并稀释至1%，超声充分分散后即获得NGAL抗体致敏胶乳微粒。
实施例5
试剂R1：pH8
Tris 80mM
NaCl 75mM
BSA 0.08%
Tween-20 0.08%
PEG6000 2%
NaN3 0.1%
试剂R2：pH8
Tris 45mM
NaCl 175mM
BSA 0.08%
Tween-20 0.07%
NaN3 0.1%
蔗糖 4%
NGAL抗体致敏胶乳微粒 0.6%
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液：pH8
Tris 70mM
NaCl 175mM
BSA 0.6%
Tween-20 0.08%
EDTA 3mM
NaN3 0.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度（150、300、600、1500、3000、5000ng/ml）溶解稀释，以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
其中NGAL抗体致敏胶乳微粒制备过程为：
（1）用50mM MES缓冲液（pH6.0）将表面带有羧基功能基团、直径125nm的聚苯乙烯稀释至终浓度为2.5%，加入60mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应65分钟；
（2）离心弃上清，用50mM MES缓冲液（pH6.0）清洗两次，最终胶乳微粒重悬于50mM MES缓冲液（pH6.0）至终浓度为2%，超声进行分散；
（3）用50mM MES缓冲液（pH6.0）稀释NGAL抗体（多克隆抗体或单克隆抗体）至2mg/ml，与步骤（2）中活化微粒等体积混合，于室温反应3.5小时；
（4）上述反应液18000rpm离心30min，用含0.5% BSA、0.1% Tween-20的50mM Tris缓冲液（pH7.4）重悬微粒，室温封闭反应2.5小时；
（5）离心弃上清，用同一缓冲液清洗胶乳3次，最后用R2试剂保存液（50mM Tris、0.15M NaCl、0.5% BSA、0.1% Tween-20 、0.1% NaN3、5%蔗糖）重悬胶乳沉淀并稀释至1%，超声充分分散后即获得NGAL抗体致敏胶乳微粒。
实施例6
试剂R1：pH7.2
Tris 450mM
NaCl 180mM
BSA 0.8%
Tween-20 0.06%
PEG6000 2.5%
NaN3 0.1%
试剂R2：pH7.2
Tris 80mM
NaCl 85mM
BSA 0.25%
Tween-20 0.03%
NaN3 0.1%
蔗糖 8%
NGAL抗体致敏胶乳微粒 0.4%
NGAL试剂参考标准品
标准品稀释缓冲液：pH7.2
Tris 20mM
NaCl 95mM
BSA 0.8%
Tween-20 0.04%
EDTA 2.5mM
NaN3 0.1%
将重组人NGAL蛋白用标准品稀释液按标准品浓度（150、300、600、1500、3000、5000ng/ml）溶解稀释，以国内知名品牌的NGAL试剂盒对配制的标准品进行测定和校准。
其中NGAL抗体致敏胶乳微粒制备过程为：
（1）用50mM MES缓冲液（pH6.0）将表面带有羧基功能基团、直径80nm的聚苯乙烯稀释至终浓度为1.2%，加入40mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应70分钟；
（2）离心弃上清，用50mM MES缓冲液（pH6.0）清洗两次，最终胶乳微粒重悬于50mM MES缓冲液（pH6.0）至终浓度为2%，超声进行分散；
（3）用50mM MES缓冲液（pH6.0）稀释NGAL抗体（多克隆抗体或单克隆抗体）至2mg/ml，与步骤（2）中活化微粒等体积混合，于室温反应3小时；
（4）上述反应液18000rpm离心30min，用含0.5% BSA、0.1% Tween-20的50mM Tris缓冲液（pH7.4）重悬微粒，室温封闭反应2小时；
（5）离心弃上清，用同一缓冲液清洗胶乳3次，最后用R2试剂保存液（50mM Tris、0.15M NaCl、0.5% BSA、0.1% Tween-20 、0.1% NaN3、5%蔗糖）重悬胶乳沉淀并稀释至1%，超声充分分散后即获得NGAL抗体致敏胶乳微粒。
鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适于于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，均可以证明本发明之试剂盒反应灵敏，对NGAL检测性能良好，检测结果线性程度高，便于在测试过程中得到精度较高的测试结果，故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明。
下面以实施例1为例进行分析（如图1-3所示）
1、检测方法
仪器：日立7060 全自动生化分析仪
参数设置：
| 波长 | 570nm/800nm | 校正类型 | 非线性 |
| 用量（样本/R1/R2，μl） | 3/300/100 | 血清+R1时间 | 3~5min |
| 方法 | 两点终点法 | 加入R2后反应时间 | 5min |
| 校正方法 | 六点定标 | 反应方向 | 向上 |
操作步骤：样品（标准品或临床样本）与试剂R1 混匀，于37℃孵育5 分钟后，加入试剂R2，混匀，37℃孵育30秒后读取吸光度A1，再孵育5分钟后读取吸光度值A2，ΔA=A2-A1。以NGAL标准品浓度为X轴，以各浓度标准品测得的ΔA为Y轴绘制标准曲线，以待测样本△A在定标曲线上即可求得相应NGAL的含量。
2、NGAL标准曲线
将实施例1中的NGAL试剂盒与国内知名品牌NGAL测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）按照各自的检测方法绘制标准曲线（附图1）。本发明试剂盒空白吸光度相对较低，具有更高的灵敏度与线性范围。
3、灵敏度检测
测定空白液和4个不同NGAL浓度含量样品的ΔA，每个样品测10 次，计算平均值和标准偏差（SD），以样本吸光度-3SD大于空白吸光度+3SD的样本浓度作为NGAL检测试剂盒的最低检测灵敏度。从下表可见，本发明检测试剂盒的灵敏度为10ng/ml。
4、
5、线性测定
取一份NGAL高值血清，梯度增加样本检测量，用实施例1中试剂盒检测样本中NGAL含量，根据NGAL理论含量的梯度分析检测结果，发现本试剂盒线性检测范围高达6000ng/ml，R2=0.993。
| NGAL理论浓度梯度 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| NGAL测定浓度（ng/ml) | 0 | 1241 | 2872 | 4958 | 6227 |
5、相关性分析
分别用本发明实施例1中的试剂盒和对照试剂（国内知名品牌NGAL测定试剂盒）同时检测50份临床血清样本（包含正常和异常样本）中NGAL含量，以对照试剂检测样本的NGAL含量为横坐标，以本发明试剂盒检测的NGAL含量为纵坐标，做回归分析，检测结果见附图3，回归方程为Y=0.9896X-12.299，相关系数R=0.9966。该结果表明本发明试剂盒同对照试剂盒对于临床样本检测的相关性良好。
6、稳定性研究
将发明NGAL检测试剂盒试剂R1、R2置于2-8℃冷库与37℃水浴中，分别在存放前、2-8℃冷库存放3个月、6个月和12个月及37℃水浴7天后对校准品进行定标分析，记录ΔA（*10000）值。结果如下表所示，本研究研制的NGAL检测试剂盒具有良好的稳定性，在2-8℃冷库存放一年后，或在37℃水浴7天后，均保持90%以上的反应活性。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，其特征在于：包括试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品，其中：
试剂R1：
Tris 10-100mM
NaCl 50-200mM
BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%-0.1%
PEG 0.5%-3%
NaN3 0.1%
试剂R2：
Tris 10-100mM
NaCl 50-200mM
BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%-0.1%
NaN3 0.1%
蔗糖 1%-10%
NGAL抗体致敏胶乳微粒 0.1%-1%
NGAL试剂参考标准品：
Tris 10-100mM
NaCl 50-200mM
BSA 0.05%-1%
Tween-20 0.01%-0.1%
EDTA 0.5-5mM
NaN3 0.1%。
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中PEG的数均分子量为6000。
3.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1、试剂R2以及NGAL试剂参考标准品的酸碱度均为pH7-8。
4.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中NGAL抗体致敏胶乳微粒为50-150nm聚苯乙烯乳胶微粒，其中功能聚苯乙烯的功能基团为羧基功能基团。
5.根据权利要求1或4所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中NGAL抗体致敏胶乳微粒通过如下步骤制得：
（1）用MES缓冲液将表面带有羧基功能基团、直径50-150nm的聚苯乙烯微粒稀释至终浓度为0.5-3%（wt），加入20-90mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应20-80分钟；
（2）离心步骤（1）混合液弃上清液，用MES缓冲液清洗两次，最终胶乳微粒重悬于 MES缓冲液至终浓度为2%，超声进行分散，得微粒分散液；
（3）用MES缓冲液稀释NGAL抗体至2mg/ml，与步骤（2）中微粒分散液等体积混合，于室温反应2-4小时；
（4）将步骤（3）反应液18000rpm离心30min后，用Tris缓冲液重悬微粒，室温封闭反应1-3小时；
（5）离心步骤（4）反应液，弃上清液，用Tris缓冲液清洗胶乳3次，最后用R2试剂保存液重悬胶乳沉淀并稀释至1%，超声充分分散后即获得NGAL抗体致敏胶乳微粒。
6.根据权利要求5所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，其特征在于：步骤（1）至步骤（3）中所述MES缓冲液为酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液。
7.根据权利要求5所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量检测试剂盒，其特征在于：步骤（4）以及步骤（5）中所述Tris缓冲液为pH7.4并且含0.5% BSA、0.1% Tween-20的50mM Tris缓冲液。
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