CN104792982A - 一种阿司匹林耐药性监测试剂 - Google Patents

一种阿司匹林耐药性监测试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阿司匹林耐药性监测试剂，属于生物监测领域。本发明的监测试剂由试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品组成；试剂R1由Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG和NaN3组成；试剂R2由Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖和11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；11dhTxB2参考标准品由11dhTxB2、Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA和NaN3组成。本发明试剂检测精度高、线性范围广且稳定性高。另外，将抗体包被于微球表面，抗体与样本中的抗原结合时，形成抗原-抗体-胶乳微粒复合物，增加了浊度变化，提高了检测灵敏度。

Description

一种阿司匹林耐药性监测试剂
技术领域
本发明涉及生物监测领域，特别涉及一种阿司匹林耐药性监测试剂。
背景技术
冠状动脉，脑血管，外周动脉的粥样血栓在全球人类发病率和死亡率上位于前列，并且不断增长，其中关键的原因之一就是粥样硬化血栓成分为活化和聚集的血小板。因此抗血小板治疗成为治疗此种紊乱的核心方式。一项研究表明在高危脉管患者中，阿司匹林的治疗可降低34%非致命的心肌梗塞，25%的非致命心绞痛，18%所有原因的死亡率。
阿司匹林（aspirin, Acetylsalicylic Acid, ASA）作为解热、镇痛和抗炎药物在临床上应用已经有100多年的历史了，而作为抗血小板聚集药物是从上世纪50年代开始。近年来，各项试验结果逐渐阐明了ASA抗栓的机制：血小板上的环氧化酶（COX-1）可作用于花生四烯酸，细胞中的花生四烯酸以磷脂的形式存在于细胞膜中。多种刺激因素可激活磷脂酶A，使花生四烯酸从膜磷脂中释放出来。游离的花生四烯酸在（COX）的作用下转变成前列腺素G2（PGG2）和前列腺素H2（PGH2）。在体内有两种同工酶：COX-1与COX-2，两者都作用于花生四烯酸产生相同的代谢产物PGG2和PGH2。COX-1是结构酶，正常生理情况下即存在，主要介导生理性前列腺素类物质形成。COX-2是诱导酶，在炎性细胞因子的刺激下大量生成，主要存在于炎症部位，促使炎性前列腺素类物质的合成，可引起炎症反应、发热和疼痛。血小板内有血栓素A2（TXA2）合成酶，可将COX的代谢产物PGH2转变为TXA2，有强烈的促血小板聚集作用。血管内皮细胞含有前列环素（PGI2）合成酶，能将COX的代谢产物PGH2转变为PGI2，它是至今发现的活性最强的内源性血小板抑制剂，能抑制ADP、胶原等诱导的血小板聚集和释放。血小板产生TXA2的与内皮细胞产生PGI2的之间的动态平衡是机体调控血栓形成的重要机制。
阿司匹林可使COX丝氨酸位点乙酰化从而阻断催化位点与底物的结合，导致COX永久失活，血小板生成TXA2受到抑制。血小板没有细胞核不能重新合成酶，血小板的COX一旦失活就不能重新生成，因此阿司匹林对血小板的抑制是永久性的，直到血小板重新生成。血小板的寿命约7～10天，每天约有10%的血小板重新生成，每天1次的阿司匹林足以维持对血小板TxA2生成的抑制。内皮细胞是有核细胞，失去活性的可在数小时内重新合成。总体来说阿司匹林可充分抑制血小板具有促栓活性的TxA2的合成，而对内皮细胞具有抗栓活性的PGI2影响不大。因此小剂量的阿司匹林发挥的是抗栓作用。血小板活化中环氧酶作用途径如图6所示。
 阿司匹林是广泛使用的防止心血管疾病的辅助处方，因为它可以抑制血栓素A2 (TxA2)的生成。但最近的研究显示并非所有的个体对于阿司匹林的反应都是一致的。大约30%的个体服药者对阿司匹林耐药，也就是常说的不起作用，因此监控阿司匹林疗效变得更加关键和重要。
直接测定患者对阿司匹林的反应是指测定TxA2的循环水平，不幸的是，TxA2在血液中的寿命很短，这样分析TxA2就非常困难，但是它会在酶的作用下分解成很多代谢物包括11dhTxB2和11-去氢-2,3-dinor血栓素B2(11dh2,3DTxB2),它们被肾脏吸收，排泄在尿液里。11dhTxB2在尿液中非常稳定，是TxB2在尿液中最丰富的代谢物，11dhTxB2是一种生物非活性物质，是TxA2的下游代谢产物，其半衰期较长,它在尿液中排出，相对不受来自体内血小板活性和其他分析前变量的影响。这些性能使尿11dhTxB2成为一个良好的、可靠的生物标志物，来评估血小板活性。此外，纯化的11dhTxB2在室温下很稳定，如果在冷冻下存储可保存更长的时间。
因此研究用于检测尿液中的11dhTxB2免疫的检测试剂，用于测定阿司匹林耐药监测是临床所需要解决的问题。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供了一种使用方便、成本低、检测速度快、检测灵敏度高、检测精度高、线性范围广且稳定性高的阿司匹林耐药性监测试剂。
本发明的技术方案为：
一种阿司匹林耐药性监测试剂，由试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品组成；所述试剂R1由Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG和NaN3组成；所述试剂R2由Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖和11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；所述11dhTxB2参考标准品由11dhTxB2标准品、Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA和NaN3组成。
其中，BSA作为稳定剂，同时具有避免非特异性反应的作用；Tween-20起到避免非特异性反应的作用；NaN3为防腐剂；R1中PEG作为促凝剂。
优选的，所述试剂R1由10-100 mM Tris、50-200 mM NaCl、0.05-1 wt% BSA、0.01-0.1wt% Tween-20、0.5-3wt% PEG和0.06-0.15 wt%NaN3组成；所述试剂R2由10-100 mM Tris、50-200 mM NaCl、0.05-1 wt% BSA、0.01-0.1wt% Tween-20、0.06-0.15wt% NaN3、1-10wt% 蔗糖和0.1-1wt% 11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；所述11dhTxB2参考标准品由600-80000pg/mL 11dhTxB2标准品、10-100 mM Tris、50-200 mM NaCl、0.05-1 wt% BSA、0.01-0.1wt% Tween-20、0.5-5mM EDTA和0.06-0.15wt% NaN3组成。
优选的，所述试剂R1中PEG的数均分子量为5000-8000。
作为优选，所述试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品的pH均为7-8。
优选的，所述11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球为交联有11dhTxB2抗体的粒径为50-300nm的聚苯乙烯胶乳纳米微球。
作为优选方案，所述11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球的制备步骤如下：
1）用MES缓冲液将表面带有用于交联11dhTxB2抗体功能基团的、直径50-300nm的聚苯乙烯胶乳纳米微球稀释至终浓度为0.5-3 wt %，加入20-90mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应20-80分钟；
2）离心步骤1）混合液，弃上清液，用MES缓冲液清洗两次，最终胶乳纳米微球重悬于MES缓冲液至终浓度为0.3-3wt%，超声，进行分散，得微球分散液；
3）用MES缓冲液稀释11dhTxB2抗体至1-3mg/ml，与步骤2）中微球分散液等体积混合，于室温反应2-4小时；
4）将步骤3）反应液离心，用Tris缓冲液重悬微球，室温下，反应1-3小时；
5）离心步骤4）反应液，弃上清液，用Tris缓冲液清洗胶乳纳米微球3次，即获得11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球。
其中步骤3）使得11dhTxB2抗体上的氨基与聚苯乙烯胶乳纳米微球上的羧基交联。步骤4）的作用在于封闭聚苯乙烯胶乳纳米微球上未与抗体交联的羧基。
进一步的，所述用于交联11dhTxB2抗体的功能基团为羧基。
作为优选方案，步骤1）至步骤3）中所述MES缓冲液为酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液；其中所述MES缓冲液的配置步骤为，将10.6625g的MES溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准氢氧化钠溶液调整酸碱度至pH=6，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液。
作为优选，步骤4）以及步骤5）中所述Tris缓冲液为pH7.4并且含0.5% BSA、0.1% Tween-20的50mM Tris缓冲液；所述Tris缓冲液的配置的配置步骤为：将6.057g Tris溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准HCL溶液调整酸碱度至适当范围，如pH=7，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到50mM Tris缓冲液。
本发明采用化学交联方法，将具有高特异性、高亲和力的11dhTxB2抗体偶联至聚苯乙烯胶乳纳米微球表面的羧基官能团上，当此微球与样本混合时，在促凝剂PEG的作用下，抗体与样本中的抗原发生特异性结合，形成抗原-抗体-胶乳微粒复合物，产生一定的浊度变化。在一定范围内，反应液吸光度值与样本中11dhTxB2含量成正比关系。通过测定一系列已知浓度的11dhTxB2参考标准品与R1试剂和R2试剂反应后的吸光度，绘制标准曲线，便可根据待测样本的吸光度值测得11dhTxB2含量。
本发明的有益效果为：
本发明在免疫比浊法的基础上引入具有一定粒径的纳米微球，将抗体包被于微球表面，当抗体与样本中的抗原结合时，形成抗原-抗体-胶乳微粒复合物，增加了浊度变化，从而提高了检测反应的灵敏度。
另一方面，本发明采用化学偶联的技术，将抗体固定包被在微球表面，通过增加抗体结构的稳定性以提高试剂的稳定性。
本发明通过计算与试验，寻找到合适的微球、交联剂、试剂保存液以及保存液中各组分与抗体的比例等，在提高检测灵敏度的同时，降低反应的非特异性。
本发明试剂成本低、使用方便、检测灵敏度高、检测精度高、线性范围广、稳定性高且特异性强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为11dhTxB2单克隆抗体的效价测定图；
图2为不同稀释下的样本数值的线性图；
图3为三个11dhTxB2 质控在12个月内的稳定性测试图；
图4为11dhTxB2 基线样本与服用阿司匹林的患者样本的比较柱状图；圆柱表示25%到75%之间的数值， 每个圆柱内部的水平线表示本组的中值，点表示落在90%和10%界限之外的样本数值，用黑点来强调；
图5为服用阿司匹林者与未使用阿司匹林者尿液11dhTxB2浓度数值的频率比较图；
图6为血小板活化中环氧酶作用途径图。
具体实施方式
11dhTxB2单克隆抗体的制备
1、抗原制备
11dhTxB2（C20 H32O6，分子量为368.5，购自SIGMA公司）与钥孔铜蓝蛋白（KLH，购自SIGMA公司）连接成11dhTxB2-KLH。用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物（EDC或EDAC，购自SIGMA公司），将11dhTxB2的羧基交联到KLH的氨基上。
2、动物免疫 
准备SPF级6周龄雌性Balb/c品系小鼠(中国科学院北京实验动物中心)4只，首次免疫，用11dhTxB2-KLH与弗氏完全佐剂的两后腿股四头肌多点注射。每只小鼠注射50μg抗原。第二次，用11dhTxB2-KLH与弗氏不完全佐剂的抗原乳浊液免疫，每隔三周免疫一次，共免疫三次。第三次免疫后十天，眼眶取血，离心制备血清，储存于-20℃备用。做细胞融合前3天，加强免疫小鼠一次，免疫方法同前，仅用抗原，不加免疫佐剂。
3、杂交瘤细胞建株
3.1细胞准备
A，骨髓瘤细胞的准备：收集经8-氮鸟嘌呤（8-氮鸟嘌呤购自Invitrogen)筛选过的骨髓瘤细胞SP2/0，将显微镜下观察细胞活性良好的对数增殖期的细胞洗涤后计数，细胞悬浮在DMEM(购自Invitrogen)培养液中备用。
B，饲养层细胞的准备：融合前一天，将5mlDMEM培养液注入小鼠腹腔，轻轻晃动后抽出腹腔液，离心，计数，调整细胞浓度为1×105/ml，接种到96孔培养板内，50μl/孔。
C，脾脏细胞的准备：解剖小鼠，取脾脏，用机械法分散脾细胞，经滤网过滤得脾细胞悬液，DMEM培养液洗涤后计数。
3.2细胞融合
取1×107SP2/0细胞与5×107脾细胞(按1:5比例)混合于50ml离心管中，加入DMEM无血清培养液，离心，1500rpm，3min，弃上清。振松沉淀细胞，逐滴加入50%(v/v)PEG(分子量1500)1ml，边加边摇晃，1min内加完。静置90秒，让PEG继续作用。然后在2.5min内逐滴加入37℃预温的无血清DMEM培养液10ml，静置5min，终止PEG的作用。融合后细胞悬液离心，1000rpm，3min。弃上清，沉淀细胞轻轻打匀，加入25ml完全培养液(DMEM+10%FBS)，接种于加有饲养层细胞的96孔板内，50μl/孔，置37℃， 5% CO2培养箱内培养。第二天，加入含2×NGALT(Sigma-Aldrich)的完全培养液，100μl/孔，杀死未融合的骨髓瘤细胞。
3.3杂交瘤细胞筛选
A，ELISA检测方法的建立: 11dhTxB2-KLH，KLH用0.05M pH7.4磷酸盐缓冲液稀释成5-10μg/ml，包被到96孔微孔板(Corning)内，100μl/孔，4℃，过夜。用稀释液(含10%(v/v)FBS的PBS，pH7.4)封闭37℃，2小时。检测抗体时，平行加入待测孔内杂交瘤细胞培养上清(100μl/孔)到11dhTxB2-KLH，KLH分别包被的板孔里。同时设置阳性、阴性对照，阳性对照为稀释过的免疫后小鼠血清，阴性对照为新鲜DMEM培养液，在37℃孵育2小时。洗板后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体(50μl/孔)，37℃孵育1小时后，洗板，用TMB底物(Sigma-Aldrich)显色(100ul/孔)，反应10min后，加入2M HCL终止反应(50μl/孔)。在ELISA读板仪(Thermo Scientific)上，测定各待测孔样品在波长在450nm下的吸光度(OD)值。对11dhTxB2-KLH抗原阳性，对KLH抗原为阴性的杂交瘤细胞进行克隆化。
B，杂交瘤细胞克隆化：
选择抗体阳性且OD值高的孔用有限稀释法对其中的杂交瘤细胞进行克隆化，一般稀释到0.8个细胞/孔。待细胞培养至20%板底面积时，吸取细胞培养上清用ELISA方法再次筛选抗体阳性孔。若连续3次克隆，每次克隆率小于2/3和阳性率都为100%；这样获得的细胞即为单克隆。1×106细胞在10ml培养上清培养3日后，取上清进行ELISA检测，以OD值较高的孔为指标进行筛选，结果共获得5株杂交瘤细胞系，各株杂交瘤细胞的滴度见表1，从中选择本发明的1个杂交瘤细胞系，命名为1G-2f-3c，其分泌的单克隆抗体属于IgG1，κ型(Bio-Rad抗体亚型鉴定试剂盒)。
表1，各株杂交瘤细胞的培养上清抗体滴度
杂交瘤细胞的冻存
细胞冻存液：50%小牛血清，40%RPMI1640溶液，10%二甲基亚砜。
将杂交瘤细胞离心，重新悬细胞于预冷的冻存液中，浓度为106-7/ml，转移至冻存管1ml。置于-70℃冰箱中，次日转入液氮中。
4、1G-2f-3c株的单克隆抗体制备
4.1腹水制备
取经产F1代小鼠，于腹腔注射0.5ml降植烷(pristane，购自SIGMA)。7-10天后，再次腹腔注射0.5ml 106杂交瘤细胞。每天观察小鼠生长情况，7天左右可见腹部隆起，及时采集腹水。
4.2单抗纯化
上述获得的单抗腹水，采用Protein A（天津石桥生物技术有限公司）亲和层析的纯化方法：预装Protein A-sepHarose4B(GE)柱子，并用约50ml PB平衡；取2ml腹水，经0.45μm的滤膜过滤，20mM PB缓冲液对倍稀释，最后过柱，20mM、pH为7.0的PB缓冲液洗脱未结合于柱的蛋白，测蛋白浓度，直至洗脱液内无蛋白为止；用100mM pH2.7Glycin洗脱结合在柱上的抗体，同时洗脱下来的液体用1M pH9.0 Tris-HCl中和，使其pH值为中性；收集洗脱液，测蛋白浓度。将上述溶液装入透析袋中，对10mM、pH为7.4的PBS缓冲液透析，4小时换液一次，换液3次，透析后的11dhTxB2单克隆抗体分装，-70℃冰箱保存。
得到的11dhTxB2单克隆抗体用于实施例1-5中11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球的制备。
4.3单抗效价测定 
用ELISA测定，11dhTxB2-KLH 5ug/ml包被酶联板，将纯化后的单克隆抗体用PBS作10倍系列稀释后，每孔加入100ul，37°C，1小时，PBST洗涤3次，加入羊抗鼠IgG-HRP，37°C，1小时，PBST洗涤3次，加入TMB显色10-20分钟，加入2M HCL，在酶联仪上测定OD450的值。结果见图1
实施例1
一种阿司匹林耐药性监测试剂，由试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品组成。
试剂R1由50 mM Tris、150 mM NaCl、0.5 wt% BSA、0.1wt% Tween-20、1.5wt% PEG6000和0.1 wt%NaN3组成；试剂R1的pH为7.4；
试剂R2由50mM Tris、150mM NaCl、0.5wt% BSA、0.1wt% Tween-20、0.1wt% NaN3、5wt% 蔗糖和0.5wt% 11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；试剂2的pH为7.4；
11dhTxB2参考标准品由1500pg/mL 11dhTxB2标准品、50 mM Tris、150 mM NaCl、0.5wt% BSA、0.1wt% Tween-20、2mM EDTA和0.1wt% NaN3组成；11dhTxB2参考标准品的pH为7.4。
将11dhTxB2参考标准品分别稀释至下述浓度：150 pg/ml、300 pg/ml、600 pg/ml、1500 pg/ml、3000 pg/ml、5000pg/ml。
其中，11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球的制备过程为：
1）用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）将表面带有羧基功能基团的、直径100nm的聚苯乙烯胶乳纳米微球稀释至终浓度为0.5wt%，加入50mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应20分钟；
2）离心步骤1）混合液，弃上清液，用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）清洗两次，最终胶乳纳米微球重悬于50mM的MES缓冲液（pH为6.0）至终浓度为2wt%，超声，进行分散，得微球分散液；
3）用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）稀释11dhTxB2抗体至2mg/ml，与步骤2）中微球分散液等体积混合，于室温反应2小时；
4）将步骤3）反应液以18000rpm的速度离心，用含0.5wt% BSA和0.1wt% Tween-20的50mM的Tris缓冲液（pH为7.4）重悬微球，室温下，反应1.0小时；
5）离心步骤4）反应液，弃上清液，用含0.5wt% BSA和0.1wt% Tween-20的50mM的Tris缓冲液（pH为7.4）清洗胶乳纳米微球3次，即获得11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球。
其中，步骤1）-步骤3）中所用MES缓冲液的配制步骤为：将10.6625g的MES溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准氢氧化钠溶液调整酸碱度至pH=6，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液。
其中步骤4）和步骤5）中所用的Tris缓冲液的配制步骤为：将6.057g Tris溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准HCL溶液调整酸碱度至适当范围，如pH=7，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到复合要求的50mM Tris缓冲液。
实施例2
一种阿司匹林耐药性监测试剂，由试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品组成。
试剂R1由10 mM Tris、125 mM NaCl、0.05 wt% BSA、0.08wt% Tween-20、1.0wt% PEG6000和0.1 wt%NaN3组成；试剂R1的pH为7.0；
试剂R2由20mM Tris、100mM NaCl、0.05wt% BSA、0.1wt% Tween-20、0.1wt% NaN3、2wt% 蔗糖和0.1wt% 11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；试剂2的pH为7.0；
11dhTxB2参考标准品由1500pg/mL 11dhTxB2标准品、40 mM Tris、70 mM NaCl、0.05wt% BSA、0.03wt% Tween-20、5mM EDTA和0.1wt% NaN3组成；11dhTxB2参考标准品的pH为7.0。
将11dhTxB2参考标准品分别稀释至下述浓度：150 pg/ml、300 pg/ml、600 pg/ml、1500 pg/ml、3000 pg/ml、5000pg/ml。
其中，11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球的制备过程为：
1）用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）将表面带有羧基功能基团的、直径200nm的聚苯乙烯胶乳纳米微球稀释至终浓度为1.0wt%，加入80mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应30分钟；
2）离心步骤1）混合液，弃上清液，用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）清洗两次，最终胶乳纳米微球重悬于50mM的MES缓冲液（pH为6.0）至终浓度为2wt%，超声，进行分散，得微球分散液；
3）用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）稀释11dhTxB2抗体至2mg/ml，与步骤2）中微球分散液等体积混合，于室温反应4小时；
4）将步骤3）反应液以13000rpm的速度离心，用含0.5wt% BSA和0.1wt% Tween-20的50mM的Tris缓冲液（pH为7.4）重悬微球，室温下，反应1.5小时；
5）离心步骤4）反应液，弃上清液，用含0.5wt% BSA和0.1wt% Tween-20的50mM的Tris缓冲液（pH为7.4）清洗胶乳纳米微球3次，即获得11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球。
其中，步骤1）-步骤3）中所用MES缓冲液的配制步骤为：将10.6625g的MES溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准氢氧化钠溶液调整酸碱度至pH=6，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液。
其中步骤4）和步骤5）中所用的Tris缓冲液的配制步骤为：将6.057g Tris溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准HCL溶液调整酸碱度至适当范围，如pH=7，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到复合要求的50mM Tris缓冲液。
实施例3
一种阿司匹林耐药性监测试剂，由试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品组成。
试剂R1由100 mM Tris、50 mM NaCl、1 wt% BSA、0.01wt% Tween-20、0.5wt% PEG6000和0.1 wt%NaN3组成；试剂R1的pH为7.5；
试剂R2由100mM Tris、50mM NaCl、1wt% BSA、0.01wt% Tween-20、0.1wt% NaN3、10wt% 蔗糖和1.0wt% 11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；试剂2的pH为7.5；
11dhTxB2参考标准品由3000pg/mL 11dhTxB2标准品、10 mM Tris、200 mM NaCl、1wt% BSA、0.01wt% Tween-20、0.5mM EDTA和0.1wt% NaN3组成；11dhTxB2参考标准品的pH为7.5。
将11dhTxB2参考标准品分别稀释至下述浓度：150 pg/ml、300 pg/ml、600 pg/ml、1500 pg/ml、3000 pg/ml、5000pg/ml。
其中，11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球的制备过程为：
1）用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）将表面带有羧基功能基团的、直径300nm的聚苯乙烯胶乳纳米微球稀释至终浓度为2.0wt%，加入20mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应80分钟；
2）离心步骤1）混合液，弃上清液，用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）清洗两次，最终胶乳纳米微球重悬于50mM的MES缓冲液（pH为6.0）至终浓度为2wt%，超声，进行分散，得微球分散液；
3）用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）稀释11dhTxB2抗体至2mg/ml，与步骤2）中微球分散液等体积混合，于室温反应3小时；
4）将步骤3）反应液以13000rpm的速度离心，用含0.5wt% BSA和0.1wt% Tween-20的50mM的Tris缓冲液（pH为7.4）重悬微球，室温下，反应2小时；
5）离心步骤4）反应液，弃上清液，用含0.5wt% BSA和0.1wt% Tween-20的50mM的Tris缓冲液（pH为7.4）清洗胶乳纳米微球3次，即获得11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球。
其中，步骤1）-步骤3）中所用MES缓冲液的配制步骤为：将10.6625g的MES溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准氢氧化钠溶液调整酸碱度至pH=6，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液。
其中步骤4）和步骤5）中所用的Tris缓冲液的配制步骤为：将6.057g Tris溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准HCL溶液调整酸碱度至适当范围，如pH=7，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到复合要求的50mM Tris缓冲液。
实施例4
一种阿司匹林耐药性监测试剂，由试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品组成。
试剂R1由20 mM Tris、200 mM NaCl、0.6 wt% BSA、0.02wt% Tween-20、3.0wt% PEG6000和0.1 wt%NaN3组成；试剂R1的pH为7.5；
试剂R2由10mM Tris、200mM NaCl、0.75wt% BSA、0.05wt% Tween-20、0.1wt% NaN3、1wt% 蔗糖和0.8wt% 11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；试剂2的pH为7.5；
11dhTxB2参考标准品由6000pg/mL 11dhTxB2标准品、100 mM Tris、50 mM NaCl、0.2wt% BSA、0.05wt% Tween-20、4mM EDTA和0.1wt% NaN3组成；11dhTxB2参考标准品的pH为7.8。
将11dhTxB2参考标准品分别稀释至下述浓度：150 pg/ml、300 pg/ml、600 pg/ml、1500 pg/ml、3000 pg/ml、5000pg/ml。
其中，11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球的制备过程为：
1）用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）将表面带有羧基功能基团的、直径250nm的聚苯乙烯胶乳纳米微球稀释至终浓度为1.0wt%，加入90mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应45分钟；
2）离心步骤1）混合液，弃上清液，用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）清洗两次，最终胶乳纳米微球重悬于50mM的MES缓冲液（pH为6.0）至终浓度为2wt%，超声，进行分散，得微球分散液；
3）用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）稀释11dhTxB2抗体至2mg/ml，与步骤2）中微球分散液等体积混合，于室温反应2.5小时；
4）将步骤3）反应液以13000rpm的速度离心，用含0.5wt% BSA和0.1wt% Tween-20的50mM的Tris缓冲液（pH为7.4）重悬微球，室温下，反应3小时；
5）离心步骤4）反应液，弃上清液，用含0.5wt% BSA和0.1wt% Tween-20的50mM的Tris缓冲液（pH为7.4）清洗胶乳纳米微球3次，即获得11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球。
其中，步骤1）-步骤3）中所用MES缓冲液的配制步骤为：将10.6625g的MES溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准氢氧化钠溶液调整酸碱度至pH=6，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液。
其中步骤4）和步骤5）中所用的Tris缓冲液的配制步骤为：将6.057g Tris溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准HCL溶液调整酸碱度至适当范围，如pH=7，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到复合要求的50mM Tris缓冲液。
实施例5
一种阿司匹林耐药性监测试剂，由试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品组成。
试剂R1由450 mM Tris、180mM NaCl、0.8 wt% BSA、0.06wt% Tween-20、2.5wt% PEG8000和0.1 wt%NaN3组成；试剂R1的pH为7.2；
试剂R2由80mM Tris、85mM NaCl、0.25wt% BSA、0.03wt% Tween-20、0.1wt% NaN3、8wt% 蔗糖和0.4wt% 11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；试剂2的pH为7.2；
11dhTxB2参考标准品由35000pg/mL 11dhTxB2标准品、20 mM Tris、95 mM NaCl、0.8wt% BSA、0.04wt% Tween-20、2.5mM EDTA和0.1wt% NaN3组成；11dhTxB2参考标准品的pH为7.2。
将11dhTxB2参考标准品分别稀释至下述浓度：150 pg/ml、300 pg/ml、600 pg/ml、1500 pg/ml、3000 pg/ml、5000pg/ml。
其中，11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球的制备过程为：
1）用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）将表面带有羧基功能基团的、直径50nm的聚苯乙烯胶乳纳米微球稀释至终浓度为1.2wt%，加入40mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应70分钟；
2）离心步骤1）混合液，弃上清液，用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）清洗两次，最终胶乳纳米微球重悬于50mM的MES缓冲液（pH为6.0）至终浓度为2wt%，超声，进行分散，得微球分散液；
3）用50mM的MES缓冲液（pH为6.0）稀释11dhTxB2抗体至2mg/ml，与步骤2）中微球分散液等体积混合，于室温反应3小时；
4）将步骤3）反应液以18000rpm的速度离心，用含0.5wt% BSA和0.1wt% Tween-20的50mM的Tris缓冲液（pH为7.4）重悬微球，室温下，反应2小时；
5）离心步骤4）反应液，弃上清液，用含0.5wt% BSA和0.1wt% Tween-20的50mM的Tris缓冲液（pH为7.4）清洗胶乳纳米微球3次，即获得11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球。
其中，步骤1）-步骤3）中所用MES缓冲液的配制步骤为：将10.6625g的MES溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准氢氧化钠溶液调整酸碱度至pH=6，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液。
其中步骤4）和步骤5）中所用的Tris缓冲液的配制步骤为：将6.057g Tris溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准HCL溶液调整酸碱度至适当范围，如pH=7，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到复合要求的50mM Tris缓冲液。
下面以实施例2为例进行分析
测试条件与方法；
仪器：日立7060全自动生化分析仪；
参数设置：波长 570nm/800nm，校正类型:非线性，样本/R1/R2（用量μl）50/300/100 尿液+R1时间 5min，方法 两点终点法 加入R2后反应时间 5min 校正方法 六点定标 反应方向向上。
操作步骤：双试剂操作，50μl样品（校准品或临床样本）与300μl试剂R1混匀，于37℃孵育5分钟后，加入100μl试剂R2，混匀，37℃孵育30秒后读取吸光度A1，再孵育5分钟后读取吸光度值A2，计算吸光度变化ΔA=A2-A1。以11dhTxB2校准品浓度为X轴，以各浓度校准品测得的ΔA为Y轴绘制标准曲线，以待测样本△A在定标曲线上对应X轴上的值即可求得其的11dhTxB2含量。
起始检测显示样本浓度为222pg/l时11dhTxB2的检测界限，线性检测范围是300–4000 pg/ml。
干扰物影响分析
为了确保本发明方法稳定性好，不易受外界干扰，向样品中加入干扰试剂以验证干扰试剂对本发明监测方法影响不大。
最开始的研究是确定干扰物的影响，如果高浓度某复合物对11dhTxB2测定有影响，可能会在经常服用阿司匹林的患者中发现。
ASA及其代谢物水杨酸被认为存在于服用阿司匹林的患者的尿液中。对乙酰氨基酚是一种常用的消炎药。抗坏血酸维生素C是一种普遍的食品添加剂，咖啡因是日常消耗的咖啡，茶和软饮料的成分。葡萄糖和血色素在某些情况下可以在尿液中发现。检测11dhTxB2时，所有这些物质没有发现显著的干扰。(表2)。
表2 11dhTxB2的干扰物研究数据
由表2可知，在人类尿液样本中检测服用阿司匹林者尿液中通常出现的复合物和代谢物，检测浓度是否过高。测定的11dhTxB2 数值与质控进行比较。参考质控，平均回归为105.9%。
检测结果精密度分析
选择三种尿液样本，分别是跨越检测范围的11dhTxB2的低值，中值和高值。将每个样本分别多次检测，获得的数值用于计算每个样本的均值，标准偏差，变化百分数。计算结果显示，在可报告的11dhTxB2数值范围内，多种批次之间测试间和测试内精密度好于15%，如表3所示。
表3 不同监测试剂和批号的样本的11dhTxB2精确度计算 
 
检测浓度线性范围分析
样本也在一系列的稀释液中分析以确定测试的线性。4个不同的样本，每个进行四次独立的稀释因数(0.5, 0.2, 0.1, 和 0.05)稀释，每个稀释因数浓度也描绘出来，如图2所示。 符合度绘图数值范围0.9996-1.0，确定测试线性的样本稀释因数的变化范围0.5-0.05 (稀释比 1:2 至1:20)。
试剂稳定性分析
尿液中的11dhTxB2可以在室温或4°C 保存两周，经受4个冻融周期。此外，实时样本稳定性研究检查了一系列储存在-70℃的尿液标本。另外，当样本储存1年及其以上的时间，11dhTxB2数值维持不变。对监测试剂的实时稳定性进行评估。
试剂1和试剂2-包括盒内提供的三个不同的质控，储存在2-8℃时稳定期为12个月（图3）。3个11dhTxB2质控的平均数值是343， 741， 和1750 pg/ml，变化百分数分别是12、6、5%，可见，其稳定性非常好。
阿司匹林治疗的影响
本发明的阿司匹林耐药性监测试剂，由试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品组成。可以测定人类尿液中的11dhTxB2水平，确定阿司匹林对于个体的影响。为了检测这种能力，采用的171个尿液样本来自于三组人，分别是未服用阿司匹林的；每天81mg阿司匹林，连续7天的；每天325mg，连续7天的。87个样本无阿司匹林，47个样本每日服用81mg，37个样本每日服用325mg，数值按照肌氨酸酐数值正常化。
结果如图4所示，未使用阿司匹林的均值为每毫克肌氨酸酐3094 pg 11dhTxB2 ，每日服用81mg和325mg阿司匹林的分别为每毫克肌氨酸酐900 和 786 pg。 如上所示，在上述研究课题中未服用阿司匹林和其他两种的11dhTxB2都具有广阔的范围。
这些范围进一步区分使用总量为354个接受或未接受阿司匹林治疗的患者（267个样本来自每日81，162，325mg阿司匹林的患者，87个样本来自于未服用阿司匹林患者）。检测样本，计算11dhTxB2 浓度，换算成肌氨酸酐浓度数值，确定每个样本数值的频率，结果如图5所示。这项分析的结果显示，较高的数值来自于未服用阿司匹林的患者。

Claims (9)

1.一种阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：由试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品组成；所述试剂R1由Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG和NaN3组成；所述试剂R2由Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖和11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；所述11dhTxB2参考标准品由11dhTxB2标准品、Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA和NaN3组成。
2.如权利要求1所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述试剂R1由10-100 mM Tris、50-200 mM NaCl、0.05-1 wt% BSA、0.01-0.1wt% Tween-20、0.5-3wt% PEG和0.06-0.15 wt%NaN3组成；所述试剂R2由10-100 mM Tris、50-200 mM NaCl、0.05-1 wt% BSA、0.01-0.1wt% Tween-20、0.06-0.15wt% NaN3、1-10wt% 蔗糖和0.1-1wt% 11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；所述11dhTxB2参考标准品由600-80000pg/mL 11dhTxB2标准品、10-100 mM Tris、50-200 mM NaCl、0.05-1 wt% BSA、0.01-0.1wt% Tween-20、0.5-5mM EDTA和0.06-0.15wt%NaN3组成。
3.如权利要求1所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述试剂R1中PEG的数均分子量为5000-8000。
4.如权利要求1所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品的pH均为7-8。
5.如权利要求1所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球为交联有11dhTxB2抗体的粒径为50-300nm的聚苯乙烯胶乳纳米微球。
6.如权利要求1或5所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球的制备步骤如下：
1）用MES缓冲液将表面带有用于交联11dhTxB2抗体功能基团的、直径50-300nm的聚苯乙烯胶乳纳米微球稀释至终浓度为0.5-3 wt%，加入20-90mM EDAC，混合均匀，室温震荡反应20-80分钟；
2）离心步骤1）混合液，弃上清液，用MES缓冲液清洗两次，最终胶乳纳米微球重悬于MES缓冲液至终浓度为0.3-3wt%，超声，进行分散，得微球分散液；
3）用MES缓冲液稀释11dhTxB2抗体至1-3mg/ml，与步骤2）中微球分散液等体积混合，于室温反应2-4小时；
4）将步骤3）反应液离心，用Tris缓冲液重悬微球，室温下，反应1-3小时；
5）离心步骤4）反应液，弃上清液，用Tris缓冲液清洗胶乳纳米微球3次，即获得11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球。
7.如权利要求6所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述用于交联11dhTxB2抗体的功能基团为羧基。
8.如权利要求6所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：步骤1）至步骤3）中所述MES缓冲液为酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液；其中所述MES缓冲液的配置步骤为，将10.6625g的MES溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准氢氧化钠溶液调整酸碱度至pH=6，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到酸碱度pH6.0的50mM MES缓冲液。
9.如权利要求6所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：步骤4）以及步骤5）中所述Tris缓冲液为pH7.4并且含0.5% BSA、0.1% Tween-20的50mM Tris缓冲液；所述Tris缓冲液的配置的配置步骤为：将6.057g Tris溶于500mL去离子水中，再采用1mol/L的标准HCL溶液调整酸碱度至适当范围，如pH=7，最后转移至1000mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到50mM Tris缓冲液。
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