CN105974106B - 11-脱氢-血栓素b2测定试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种11‑脱氢‑血栓素B2测定试剂盒:其特征在于,所述试剂盒包括:试剂R1,其包含0.01%‑2%的以w/v计的11dhTxB2抗体和缓冲液;试剂R2,其包含0.1%‑2%的以w/v计的包被了11dhTxB2蛋白的纳米胶乳微粒的缓冲液;校准品,其为11dhTxB2蛋白和缓冲液;以及质控品,其为溶于人工尿液中的11dhTxB2蛋白。本发明的11‑脱氢‑血栓素B2测定试剂盒提高了检测尿液中11‑脱氢‑血栓素B2含量的灵敏度和线性范围,检测灵敏度可以达到775pg/ml,线性范围可以达到0‑6300pg/ml。是一种灵敏度高、特异性好、准确性高、精密度好、稳定性好的11‑脱氢‑血栓素B2测定试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定试剂盒,具体地涉及一种11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,本发明也涉及该试剂盒的用途。
背景技术
由于阿司匹林的抗血小板聚集作用,高风险患者可以减少约25%的动脉血栓形成性事件的发生率。但在接受阿司匹林治疗的有动脉血栓形成性事件的患者,在长期随访中,有10%-25%出现病情的复发,这一现象被称为阿司匹林抵抗或者耐药。这个观点的出现使得人们开始质疑阿司匹林的有效性,因为服用阿司匹林后,相当一部分患者的血小板功能还是正常的。
匈牙利学者Pusch等对2008年以前的有关阿司匹林抵抗发生率及其临床联系的相关资料进行了系统回顾。他们发现,尽管目前“阿司匹林抵抗(AR)”还没有被广泛接受的标准定义,但不同的实验室方法已经证明,阿司匹林抵抗与不良预后相关,但这些实验室方法无法相互比较。因此,阿司匹林治疗期间,仍具有高血小板活性或血小板抑制率很低的患者,应采用何种治疗才能有效,目前尚未确定。
根据Gum等的研究发现,测定服用阿司匹林患者的血小板功能反应性与死亡、心肌梗死及脑血管事件的预后具有良好的相关性。
目前临床上对阿司匹林抵抗主要的检测方法是检测血小板(PLT)功能,需要使用专用的血小板聚集仪。操作步骤如下:血小板聚集实验用光比浊法,以1000rmp/min(离心半径6mm),离心10min,提取富含血小板的血浆(PRP);再以3000rmp/min(离心半径6mm)离心20min,提取缺乏血小板的血浆(PPP),PLT=10~20×109/L。再以PPP做空白对照,用PPP调整PRP至200-300×109/L,用血小板聚集检测仪光比浊法进行不同诱导剂的血小板聚集试验,同时检测血常规和生化指标。
众所周知,血小板离开人体后,聚集功能就已经启动,所以体外检测血小板功能需要严格的控制程序,且易受干扰,实验的重复性很差。
最近的研究显示,与无症状的患者相比,冠心病患者服用阿司匹林后尿液中11dhTxB2水平显著升高。原因是阿司匹林可以在血小板环氧合酶-1(COX-1)上不可逆转的添加乙酰基,这样可以抑制它的活性从而延长血小板的寿命。低剂量阿司匹林可抑制95%的血小板COX-1活性,从而抑制血栓素A2(TxA2)生成。血栓素A2(TxA2)经裂解,形成稳定的11dhTxB2、11dh2和3DinorTxB2,经尿液排出。尿液中含有丰富的血栓素A2(TxA2)的代谢物,其中11dhTxB2是最稳定的代谢物之一,具有相对较长的循环时间,约为45分钟。
目前用于检测11dhTxB2含量的方法有酶联免疫法,具体操作如下:标准物和样本添加至包被了羊抗鼠IgG抗体的孔内,再添加11dhTxB2指示剂和11dhTxB2单克隆抗体,2小时孵育后,清洗孔并添加底物,30分钟添加终止液,使用微板读数器读数。光密度与样本或标准物内的11dhTxB2数量成反比。
检测开始时向孔内放入标准物和样本,添加11dhTxB2指示剂。指示剂是11dhTxB2与碱性磷酸酶共轭物,然后添加鼠单克隆11dhTxB2抗体开始反应。在两小时孵育期间,11dhTxB2和11dhTxB2指示剂会竞争结合到鼠抗11dhTxB2抗体上,抗体被包被的羊抗鼠IgG抗体捕捉至孔上,清洗微量滴定板孔除去未结合的酶。接下来检测人员添加p-硝基苯磷酸(pNPP)底物,孵育30分钟,再添加0.1M的终止液乙二胺四乙酸(EDTA)结束颜色反应,然后此板在标准微量滴定板读数器405nm下进行读数。
对于含有较高水平的11dhTxB2样本,会有较少的11dhTxB2指示剂结合至单克隆抗体,结果产生较低的光密度(OD)。样本中的11dhTxB2较少时,会有较多的指示剂结合至抗体,产生较高的OD读数。11dhTxB2的真正浓度是通过对比临床样本OD值和包装随带的定标液建立的参考曲线获得的。该检测方法用时在4小时左右,且精密度低。
以上两种方法检测阿司匹林抵抗都需要耗费大量的人力、物力和时间,且成本高,很难实现批量自动化检测。
发明内容
因此,需要提供一种11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,这样就可用生化分析仪实现大批量自动化检测,大大缩短了检测时间。
为此,本发明提供了一种一种11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,所述试剂盒包括:
试剂R1,其包含0.01%-2%的以w/v计的11dhTxB2抗体和缓冲液;
试剂R2,其包含0.1%-2%的以w/v计的包被了11dhTxB2蛋白的纳米胶乳微粒的缓冲液;
校准品,其为11dhTxB2蛋白和缓冲液;以及
质控品,其为溶于人工尿液中的11dhTxB2蛋白。
本发明11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒的检测原理为通过11dhTxB2抗体与抗原结合,生成具有特异性的大分子蛋白产物,使尿液样本中的11dhTxB2先与试剂R1中11dhTxB2抗体反应,反应完成后,剩余的11dhTxB2抗体与试剂2中包被了11dhTxB2的纳米胶乳微粒进行特异性反应结合,其反应量的多少与尿液中11dhTxB2蛋白成反比。反应产生的浊度带入11-脱氢-血栓素B2校准品测定的校准曲线,计算尿液样本中11dhTxB2的含量。
本发明所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其中,所述试剂R1和试剂R2还包含10mmol-50mmol/L缓冲液、以w/v计的0.2%-2%稳定剂。进一步,所述试剂R1还包含以w/v计的0.1%-5%增乳剂。进一步,所述试剂R1、试剂R2和校准品还包含防腐剂。其中,所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种;其PH在5.0-10.0之间;所述稳定剂为:乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、聚乙二醇4000和聚乙二醇6000中一种或多种;所述增乳剂为:聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、吐温80、十六烷基三甲基溴化铵、或IPTG中一种或多种;所述防腐剂为:叠氮钠、硫柳汞、苯酚和procline300中一种或多种。
本发明所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其中,所述11dhTxB2蛋白为重组11dhTxB2蛋白,所述11dhTxB2抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其中,所述包被了11dhTxB2蛋白的纳米胶乳微粒为30nm-400nm纳米胶乳微粒偶联物,进一步所述的纳米胶乳微粒为聚苯乙烯、二乙烯基苯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯和乙烯基甲苯中一种材质或多种材质且其化学基团被修饰过的胶乳微粒,被修饰的化学基团与11dhTxB2蛋白的氨基缩合形成偶联物。
本发明所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其中,所述校准品的各校准点浓度在0-7000pg/ml之间优选地至少6个校准点。
本发明也提供了上述11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒在确定服用小剂量阿司匹林患者对阿司匹林耐药性中用途。进一步地,该11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒与患者尿液中测定的尿肌酐的量联合使用,以计算11dhTxB2的生产率。
本发明的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒提高了检测尿液中11-脱氢-血栓素B2含量的灵敏度和线性范围,检测灵敏度可以达到775pg/ml,线性范围可以达到0-6300pg/ml。是一种灵敏度高、特异性好、准确性高、精密度好、稳定性好的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒(免疫比浊法)。
本发明的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒可以快速、准确的测定尿液中11-脱氢-血栓素B2含量,通过结合肌酐的量,如11dhTxB2结果(pg/mL)除以患者样本的肌酐结果(mg/dL),然后再乘以100,换算成11dhTxB2的生产率,即血栓素A2(TxA2)的代谢率。
血栓素A2(TxA2)的代谢率越高说明血液中血栓素A2(TxA2)含量越多,则血小板的聚集功能越强,进而确定患者对阿司匹林是否抵抗。通过检测服用阿司匹林患者的尿液中11dhTxB2的生产率,反映血小板的聚集功能的强弱,从而判断服用阿司匹林患者是否存在阿司匹林抵抗。
下面通过参考附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。所述实施例仅仅是示意目的,不意指对本发明的任何限制。所述的实验材料和试剂若无特别说明,均是可以通过商购得到,所述实验方法若无特别说明,均为本领域常规的实验方法。
附图说明
图1是标准尿液样本线性实验。
图2是本发明试剂盒与对照酶联免疫法试剂盒的正常样本的相关性实验。
图3是本发明试剂盒与对照酶联免疫法试剂盒的异常样本的相关性实验。
图4是本发明试剂盒的测定的尿液中11-脱氢-血栓素B2量与测定的尿肌酐的量联合使用,计算的11dhTxB2生产率的标准检测结果。
具体实施方式
11-脱氢-血栓素B2单克隆和多克隆抗体,购自艾美捷科技有限公司(为美国Cayman Chemical生产)。纳米胶乳微粒,购自西安凯新生物科技有限公司。人工尿液,购自东莞科鸿化工有限公司。11dhTxB2蛋白是委托专业生产公司按《重组11dhTxB2蛋白技术要求》用常规方法制备的重组11dhTxB2蛋白。
实施例1:11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒的制备
1.试剂R1的制备:
称取该11dhTxB2单克隆抗体0.015mg溶于100ml 10mmol/L Tris缓冲液中,使得其溶解完全,经0.22μm的滤膜过滤后,制成0.015%(W/V)的试剂R1。
2.试剂R2的制备:
使用30nm的羟基化聚苯乙烯纳米胶乳微粒,在PH=6.0的MES缓冲液中加入EADC:Sulfo-NHS:纳米胶乳微粒,其质量比为1:0.5:0.1,超声2-3秒,混匀,经室温在旋转摇床上活化2小时,17000rpm离心30分钟,用PH=6.0的MES缓冲液洗涤3次,然后将微球悬于PH=8.0HEPES缓冲液中,制成微粒悬液,测粒径及CV值。
在30nm的微粒悬液中,加入质量为纳米胶乳微粒1/3重的11dhTxB2蛋白,超声2-3秒,立即混匀,使HEPES缓冲液的最终浓度为25mg/ml,室温旋转摇床孵育4小时。再分别加入0.2%的乙醇胺,0.1%的牛血清白蛋白,0.1%的叠氮钠,0.02%甘氨酸的封闭液,室温旋转摇床孵育1小时。在2-8℃的条件下17000rpm离心30分钟,弃上清液,沉淀物分别用终浓度的HEPES缓冲液(PH=8.0),0.1%的叠氮钠,0.02%甘氨酸的洗涤液重悬,再离心,如此洗涤3次,制成30nm微粒交联的11dhTxB2蛋白偶联物。用20mmol/L的HEPES缓冲液(PH=8.0)重悬偶联物,使其终浓度为0.1%(W/V),制成试剂R2。
3.校准品的制备方法:
使用重组11dhTxB2蛋白分别溶于0.02mol/L的PBS缓冲液(PH=7.4)中,制成779pg/ml、1561pg/ml、2410pg/ml、3147pg/ml、6301pg/ml的5个浓度,使用0.02mol/L的PBS缓冲液(PH=7.4)为0点空白校准。
4.质控品的制备方法:
精密称取11dhTxB2蛋白,溶于含人工尿液的0.02mol/L PBS缓冲液(含1.8%尿素,0.05%尿酸,1.1%的无机盐)中。使其终浓度分别约为791pg/ml、1588pg/ml和2385pg/ml的低、中、高三个浓度的质控品。
实施例2:11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒的制备
与实施例1不同之处在于制成2%(W/V)的试剂R1以及2%(W/V)的试剂R2,其中试剂R2制备中使用了400nm的羟基化丙烯酸酯纳米胶乳微粒。
实施例3:11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒的制备
与实施例1不同之处在于制成1%(W/V)的试剂R1以及1%(W/V)的试剂R2,其中试剂R2制备中使用了200nm的羟基化二乙烯基苯纳米胶乳微粒。
实施例4-6:11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒的制备
实施例4与实施例1不同之处在于试剂R1和试剂R2分别地添加了0.2%(W/V)乙二胺四乙酸二钠以及0.1%(W/V)的叠氮钠;试剂R1添加了0.1%(W/V)聚乙二醇2000;校准品添加了0.1%(W/V)的苯酚。以及其中试剂R1中所使用抗体为11-脱氢-血栓素B2多克隆抗体。
实施例5与实施例2不同之处在于试剂R1和试剂R2分别地添加了2%(W/V)牛血清白蛋白以及0.1%(W/V)的硫柳汞;试剂R1添加了5%(W/V)聚乙二醇6000、吐温80和IPTG混合物;校准品添加了0.1%(W/V)的procline 300。以及其中试剂R1中所使用抗体为11-脱氢-血栓素B2多克隆抗体。
实施例6与实施例3不同之处在于试剂R1和试剂R2分别地添加了1%(W/V)聚乙二醇4000以及0.1%(W/V)的硫柳汞。试剂R1添加了2%(W/V)十六烷基三甲基溴化铵;校准品添加了0.1%(W/V)的叠氮钠。以及其中试剂R1中所使用抗体为11-脱氢-血栓素B2多克隆抗体。
实施例7:11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒的制备
另外对实施例1-6中的缓冲剂进行了替换,分别用pH5、pH7和pH10三个PH值的下列一种缓冲液:碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液,替换实施例1-6的相应缓冲液,进行试剂盒的制备。
实施例8:11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒(免疫比浊法)的性能
试验分析方法:两点终点法。取实施例1的试剂R1:120μl,加入24μl质控品,于37℃孵育5分钟后,加入实施例1的试剂R2:40μl,37℃保温45秒读第一点,反应5分钟后,再次读点,得到吸光度差值ΔA。
分析仪器:迪瑞CS-1300型全自动分析仪。
[基本参数]:
检测方法: 终点法
主波长: 700nm
反应温度: 37℃
操作步骤: 单位:ul
[结果计算]
计算校准吸光度差值(A2-A1),并建立校准液吸光度-浓度工作曲线。
1.灵敏度试验
检测20次水,记录吸光度差值(ΔA水),计算平均值(X水)和标准偏差(SD水);检测浓度为791pg/ml的质控品20次,记录吸光度差值(ΔA样),计算平均值(X样)和标准偏差(SD样),用如下公式计算灵敏度。
灵敏度=791×(X样+3×SD样)/X水
测定次数 | ΔA水 | ΔA样(浓度791pg/ml) |
1 | 0.2132 | 0.1900 |
2 | 0.2198 | 0.1849 |
3 | 0.2241 | 0.1876 |
4 | 0.2098 | 0.1932 |
5 | 0.2083 | 0.1921 |
6 | 0.2216 | 0.1976 |
7 | 0.2178 | 0.1827 |
8 | 0.2089 | 0.1841 |
9 | 0.2065 | 0.1870 |
10 | 0.2126 | 0.1875 |
11 | 0.2033 | 0.1912 |
12 | 0.2085 | 0.1941 |
13 | 0.2168 | 0.1921 |
14 | 0.2264 | 0.1874 |
15 | 0.2166 | 0.1881 |
16 | 0.2127 | 0.1863 |
17 | 0.2188 | 0.1938 |
18 | 0.2249 | 0.1918 |
19 | 0.2284 | 0.1937 |
20 | 0.2270 | 0.1879 |
均值 | 0.2163 | 0.189665 |
SD | 0.007505 | 0.003891 |
本发明试剂灵敏度=791×(0.189665+3×0.007505)/0.2163=775pg/ml。
2.标准尿液样本线性实验
用高浓度11dhTxB2蛋白标准液,制成浓度为0.0pg/ml,393.81pg/ml,787.625pg/ml,1575.25pg/ml,3150.5pg/ml和6301pg/ml的6个标准样本,每个浓度的样本用本发明实施例1的阿司匹林测定试剂盒测定3次,取其平均值。对测定值进行相关分析,如图1所示,图中X轴表示理论值(pg/ml),Y轴表示实测值(pg/ml),R2=0.99963。
3.精密度实验
用本发明实施例1所制备的试剂盒检测质控品11dhTxB2的高浓度、低浓度样本各20次,计算批内精密度;用3个批次的试剂盒检测同一浓度11dhTxB2质控品20次,计算批间精密度。实验结果如下表所示:
本发明试剂盒的批内精密度分别为:9.1%,3.1%。批间精密度为:11.3%。说明本发明具有良好的精密度。
4.干扰试验:
取未服用阿司匹林的健康人标本,制成混合尿液。精密称取胆红素、抗坏血酸、肌酐、葡萄糖、水杨酸,制成5组高浓度干扰物溶液。分别精密量取高浓度干扰物溶液与尿液混合,制成不同干扰物浓度的尿液,将配制好的尿液样本用本发明实施例1所制得的测定试剂盒分别进行测定,每个样本重复测定3次,取其平均值,以未加干扰物的样本测定均值为100%,计算干扰度。
干扰度=加干扰物样本均值/未加干扰物样本均值×100%
干扰度在90%-110%之间的示为可接受结果。
结果显示:当胆红素浓度小于30mg/dl、抗坏血酸浓度小于200mg/dl、肌酐浓度小于1000mg/dl、葡萄糖浓度小于2000mg/dl、水杨酸浓度小于200mg/dl时,各干扰物对本发明试剂盒测定影响无明显影响。
本试剂盒使用方法:两点终点法。取试剂R1:120ul,加入24ul样本,于37℃孵育5分钟后,加入试剂R2:40ul,37℃保温45秒读第一点,反应5分钟后,再次读点,得到吸光度差值ΔA。所测得吸光度差值ΔA代入由测得的标准品ΔA标所绘制的标准曲线方程,计算样本的浓度值。(用标准品ΔA标所绘制的标准曲线方程,计算质控品ΔA质控,质控品浓度必须在规定的范围内。)
5.相关性实验
分别使用本发明实施例1所制得的测定试剂盒和对照酶联免疫法试剂盒(市售某公司同类产品)对50份正常样本(未使用阿司匹林药物人的尿液)和50份异常样本(使用阿司匹林药物人的尿液)进行相关性实验和相关性分析。其中50份正常样本中男性23人,女性27人,最小年龄21岁,最大年龄67岁,平均年龄43.12;50分异常样本中男性26人,女性24人,最小年龄44岁,最大年龄85岁,平均年龄65.74。试验结果如图2和图3所示,图中X轴为对照试剂盒测定值,Y轴为本发明试剂盒测定值,其中正常样本中两试剂盒的相关系数R2=0.98255,异常样本中两试剂盒的相关系数为R2=0.99535。结果表明,本发明试剂盒与对照酶联免疫法试剂盒的检测数据图呈直线关系,两试剂盒具有显著的相关性。
实施例9
阿司匹林抵抗的临界值实验
11dhTxB2检测试剂盒的临界值评估研究涉及到201份样本来自服用阿司匹林的个体;204份样本来自未服用阿司匹林个体。其中包括166名服用ASA控制剂量前和/或后明显健康的成人。测量了11-脱氢-血栓素B2的浓度,并将浓度除以肌酐浓度得到标准检测结果。下图4所示为405份样本的频率分布图。根据这些频率,确定临界值是1500pg 11dhTxB2/mg尿肌酐。
另外,也如实施例8所述实验了本发明实施例2-7所制备的试剂盒,结果与实施例8相似,在此不再赘述。
Claims (11)
1.一种11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒:其特征在于,所述试剂盒包括:
试剂R1,其包含0.01%-2%的以w/v计的11dhTxB2抗体和缓冲液;
试剂R2,其包含0.1%-2%的以w/v计的包被了11dhTxB2蛋白的纳米胶乳微粒的缓冲液;
校准品,其为11dhTxB2蛋白和缓冲液;以及
质控品,其为溶于人工尿液中的11dhTxB2蛋白;
该试剂盒的线性范围为0-6300pg/ml。
2.根据权利要求1所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1和试剂R2还包含10mmol-50mmol/L缓冲液,以及以w/v计的0.2%-2%稳定剂。
3.根据权利要求1所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1还包含以w/v计的0.1%-5%增乳剂。
4.根据权利要求1所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1、试剂R2和校准品还包含防腐剂。
5.根据权利要求1所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其特征在于,所述11dhTxB2蛋白为重组11dhTxB2蛋白,所述11dhTxB2抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其特征在于,所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液其中的一种或多种;其PH在5.0-10.0之间。
7.根据权利要求2所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其特征在于,所述稳定剂为:乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、聚乙二醇4000和聚乙二醇6000中一种或多种。
8.根据权利要求3所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其特征在于,所述增乳剂为:聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、吐温80、十六烷基三甲基溴化铵、或IPTG中一种或多种。
9.根据权利要求4所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其特征在于,所述防腐剂为:叠氮钠、硫柳汞、苯酚和proclin 300 中一种或多种。
10.根据权利要求1所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其特征在于,所述包被了11dhTxB2蛋白的纳米胶乳微粒为30nm-400nm纳米胶乳微粒偶联物。
11.根据权利要求1所述的11-脱氢-血栓素B2测定试剂盒,其特征在于,所述校准品的各校准点浓度在0-7000pg/ml之间,所述校准点为至少6个。
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