CN110672838B - 检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的试剂盒及检测方法 - Google Patents

检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括11‑脱氢血栓烷B2单克隆抗体、11‑脱氢血栓烷B2竞争品、磁微粒和发光底物，可检测患者是否具有阿司匹林耐药性或抵抗，检测方法灵敏度高、准确性好、不易被生化指标影响，为临床给药提供了科学的参考依据，可应用于临床用药指导，降低临床患者由于出现阿司匹林抵抗导致抗血小板聚集治疗失败或效果不佳的问题。

Description

检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光检测试剂盒及检测方法。
背景技术
血栓烷素A2（TXA2）的代谢及11-脱氢血栓素B2（11-DH-TXB2）的检测意义
11-脱氢血栓素B2（11-dehydro-thromboxaneB2，11-DH-TXB2）是血栓烷素A2（thromboxaneA2，TXA2）的终末代谢产物，主要经肾排出，在止血及心血管疾病的发生过程中均起到重要作用。花生四烯酸在前列腺素H合成酶1和2（COX-1和COX-2）的作用下生成前列腺素H。前列腺素H化学性质不稳定，可在异构酶的作用下转化为多种具有生物活性的前列腺素类物质，包括TXA2、前列环素I2、前列腺素D2、前列腺素E2及前列腺素F2α等。TXA2主要经COX-1途径在血小板中合成，新生的血小板同时表达COX-1和COX-2，而成熟血小板仅表达COX-1，COX-2则主要表达于单核细胞、内皮细胞等有核细胞中。TXA2有强烈的缩血管作用，还可通过结合血栓烷素血小板受体（thromboxaneplateletreceptor，TPR）激活血小板，促进其聚集，从而发挥促血栓形成作用。除TXA2外，凝血酶、胶原和腺苷二磷酸（adenosinediphosphate，ADP）亦能通过其他通路激活血小板。TXA2高度不稳定，会迅速被水解为较稳定的血栓烷素B2（thromboxaneB2，TXB2）。TXB2随后在肝中被转化为半衰期更长的11dhTXB2，并经尿液排出。TXA2则是花生四烯酸在环氧合酶（cyclooxygenase，COX）作用下产生的具有促血小板聚集、收缩血管等生物活性作用的物质，在血栓形成过程中有重要作用。阿司匹林能通过不可逆地抑制COX-1活性，减少TXA2合成，从而抑制血小板聚集及其在冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）发展和急性冠状动脉综合征（acutecoronarysyndrome，ACS）发生中的作用。TXA2的代谢产物11dhTXB2水平能反映血小板活性及阿司匹林的抗血小板效果。
体外血小板激活会明显影响血清TXB2的测定结果，却对血清11dhTXB2水平无影响，同时尿液与血清中11dhTXB2的浓度有良好的相关性，因而测定尿液11dhTXB2的含量能更有效地反映体内TXA2的产生。11dhTXB2的检测方法包括放射免疫法（radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）及液相色谱-串联质谱法（liquidchromatography-tandemmassspectrometry，LC-MS/MS）。由于11dhTXB2的分子量较小，且在尿液中的浓度不高，目前多采用ELISA法进行测定。所使用的11dhTXB2抗体有单克隆抗体和多克隆抗体两种，测得的尿11-DH-TXB2浓度需用尿肌酸酐浓度进行校正，以排除尿液浓度和肾功能的影响，因此可用随机尿样本进行检测。虽然LC-MS/MS法应用时间较ELISA与RIA短，但能较为特异地检测11-DH-TXB2，检测结果变异率也更小。
阿司匹林的作用及血小板高反应性
动脉粥样硬化是缺血性心脏病和脑血管疾病的病变基础，动脉血栓形成是导致心肌梗死和缺血性卒中的主要原因。血小板是动脉血栓中的主要细胞成分，也参与了动脉粥样硬化的发生和发展过程。阿司匹林能使前列腺素H合成酶关键部位的丝氨酸发生乙酰化，从而抑制COX的活性，阻断TXA2的产生及血栓烷素诱导的血小板激活。虽然阿司匹林的半衰期仅为15～20min，但由于能不可逆地抑制血小板中的COX，且无细胞核的成熟血小板无法合成新的COX，因此其抗血小板作用可持续7～10d（即血小板的平均寿命）。阿司匹林对COX-1的抑制效果约为对COX-2的50～100倍，生理情况下，低剂量阿司匹林（30～75mg/d）可有效抑制95％的COX-1活性及TXA2产生量，但对主要经COX-2途径产生的前列环素I2及其扩血管、抗动脉粥样硬化、保护胃肠黏膜等作用无明显影响。阿司匹林在心脑血管疾病的一级及二级预防中均起到重要作用。
大型荟萃分析显示，阿司匹林可降低高风险人群23％的各类心血管事件（心肌梗死、卒中、血管性死亡）风险，其中剂量＜75mg/d可降低13％的心血管事件风险，75～150mg/d可降低32％的心血管事件风险，进一步增加阿司匹林剂量则无更多获益。曾患心肌梗死及卒中的患者亦可得到相似获益。
虽然阿司匹林对心血管事件的预防作用已被广泛证实，但在标准阿司匹林治疗情况下，仍有部分患者发生动脉血栓事件，针对阿司匹林效应的实验室检查（包括测定COX-1途径相关的血小板聚集率及测定血及尿液中血栓烷素代谢产物的含量）亦提示人群对阿司匹林的反应存在较大的差异性，这种情况最初被称为阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）。然而导致真正阿司匹林“抵抗”的药物代谢障碍或基因缺陷一直未明确，AR的说法存在一定误导性，故目前多使用阿司匹林治疗下的血小板高反应性（highon-aspirinplateletreactivity，HAPR）来描述这种对阿司匹林反应不完全的状态。HAPR产生的机制尚未完全明晰，目前研究所提示的可能原因包括：（1）在糖尿病、严重外周动脉疾病等状态下血小板更新加快，不成熟血小板增多，聚集性增强，每日1次的低剂量阿司匹林不能及时抑制新生及不成熟血小板的COX-1及COX-2活性；（2）在炎症等状态下经单核巨噬细胞及血管内皮细胞COX-2途径产生的TXA2增加，无法被低剂量阿司匹林有效抑制；（3）血小板经非COX-TXA2途径激活；（4）某些可能影响血栓烷素代谢及血小板受体功能的基因多态性影响个体对阿司匹林的反应；（5）合并使用某些非甾体类抗炎药物，如布洛芬，可削弱阿司匹林的抗血小板作用。
11dhTXB2对阿司匹林效应的反映及其检测方法研究进展
荟萃研究显示，多种血小板功能检测方法（platelet function test，PFT）检出的HAPR患者发生心血管事件的风险较非HAPR患者高3～4倍（发生率分别为39％及16％，OR3.85，95％CI3.08～4.80）。因而明确存在HAPR的人群并相应调整抗血小板方案，对降低这一高危人群的不良事件发生率及改善心血管预后尤为重要。然而受检测机制、应用人群及阿司匹林用量等因素影响，不同PFT所检出的HAPR比例相差巨大（1％～60％），对不良事件的提示强度也各不相同，故确定最具指导意义的血小板检测方法一直是此领域中的研究热点。光学比浊法（light transmission aggregometry，LTA）一直作为血小板功能检测的金标准。但由于各实验室的检测方法缺乏统一标准，且检测结果易受多种因素干扰，其应用存在一定限制。尿11dhTXB2法使用随机尿作为检测标本，是一种无创的血小板功能检测方法，不受检测时间限制，能有效反映体内TXA2的产生并间接反映体内血小板活性。HOPE研究与CHARISMA研究（使用多克隆抗体ELISA检测）显示，应用阿司匹林患者的尿11dhTXB2高水平与卒中、心肌梗死和心血管死亡风险增加有关，提示尿11dhTXB2浓度所反映的应用阿司匹林后血小板活性能帮助识别心血管高危人群。
血栓烷素代谢受多种因素影响，加之各研究使用的检测方法不同，既往各文献报道的人群尿11dhTXB2水平存在一定差异，使得针对某一特定人群的不同研究间较难进行横向比较，有待设计良好的大型研究或荟萃研究进一步评估。各研究中亚组之间的比较显示了不同人群11dhTXB2水平的变化趋势，即健康人群低于高危（尤其是糖尿病患者）及稳定性冠心病人群，ACS患者高于稳定性冠心病患者，而经皮冠状动脉介入治疗（percutaneouscoronary intervention，PCI）会使11-DH-TXB2水平进一步升高。虽不同人群的尿11dhTXB2水平存在差异，但应用阿司匹林后抑制率相近，多为60％～80％。阿司匹林能通过抑制血小板COX-1活性有效抑制血小板功能，从而降低心血管事件风险。尿11dhTXB2浓度反映血栓烷素的整体合成水平，因而能直接反映阿司匹林对血栓烷素合成及对血小板功能的抑制效果。通过研究既往文献中冠心病及相关人群的尿11dhTXB2水平及阿司匹林反应性，得出以下结论：（1）冠心病危险人群及冠心病患者（尤其是ACS患者）基础（未应用阿司匹林时）尿11dhTXB2水平明显高于健康人群，且与危险因素水平有正相关趋势，提示血小板活性逐渐增加；性别、年龄、体重等因素也对血栓烷素代谢有一定影响；（2）应用阿司匹林能显著降低所有人群的尿11-DH-TXB2水平，抑制率为60％～80％；（3）高危人群及冠心病应用阿司匹林后的尿11-DH-TXB2水平亦明显高于健康人群，提示有更高的HAPR发生率及心血管不良事件发生风险；（4）PCI能显著提高尿11-DH-TXB2排泌，提示血小板大量激活，CABG术则没有这种效果；（5）多数预后研究支持应用阿司匹林后尿11-DH-TXB2高水平所提示的HAPR与心血管事件发生率增加有关。减少尿11-DH-TXB2排泌的措施可改善阿司匹林反应，或可降低心血管不良事件风险。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光检测试剂盒及其方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光检测方法及检测试剂盒的技术方案如下：
本发明提供了阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光检测试剂盒，试剂盒通过检测受试者尿样中的11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）含量来测定阿司匹林的响应度，所述试剂盒包括结合11-脱氢血栓烷B2的单克隆抗体、11-脱氢血栓烷B2竞争品、磁微粒和发光底物，其中单克隆抗体为鼠单抗，鼠单抗轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述鼠单抗轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸由基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示的基因序列表达。
优选的，所述鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示的氨基酸由基因序列如序列表SEQ ID NO.3所示的基因序列表达。
优选的，所述11-脱氢血栓烷B2竞争品为碱性磷酸酶标记的11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）。
优选的，所述试剂盒还包括质控品或校准品11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）。
优选的，所述磁微粒为链霉亲和素包被的磁微粒。
优选的，所述发光底物为酶促发光底物。
优选的，所述鼠单克隆抗体为生物素（Biotin）标记的鼠单克隆抗体。
优选的，所述待测样品中的11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）与AP标记的11-DH-TXB2竞争结合单克隆抗体；通过链霉亲和素与生物素结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直接吸附沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离，清洗复合物后，加入酶促化学发光底物，检测发光强度计算样本中11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）浓度，从而指示患者体内的阿司匹林代谢速率。
本发明还提供了用于评估心血管相对危险的患者中阿斯匹林代谢能力的方法，所述11-DH-TXB2浓度的判断方法包括如下步骤：
1)分别制备11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）校准品、生物素结合的鼠单克隆抗体、碱性磷酸酶结合的11-DH-TXB2竞争品；
2)向步骤1）制备的生物素结合的鼠单克隆抗体中同时加入碱性磷酸酶结合的11-DH-TXB2竞争品和待测11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）样品，竞争反应；
3)向完成步骤2）的体系中加入包被链霉亲和素的磁微粒，外加磁场吸附沉淀；
4)取步骤3）中的沉淀，清洗后加入酶促发光底物；
5)检测发光强度，发光强度与待测样本中的11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）成反比；
6)采用四参数Logistic方程拟合可计算出样本中11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）浓度。
上述方法也可以用于阿司匹林代谢检测及血小板高反应性检测，或样本中11-DH-TXB2浓度的检测。所述检测方法通过待测11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）与酶标11-DH-TXB2竞争品竞争结合鼠单克隆抗体，以检测待测11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）的含量。
优选的，所述方法包括给予所述患者第一剂量的阿司匹林，收集患者的生物流体样品；确定样品中的11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）浓度；从而判断患者体内的阿司匹林代谢速率。
优选的，给予所述患者与第一剂量阿司匹林不同剂量的第二剂量阿司匹林，第二剂量与第一剂量之间的差值至少为50mg，检测患者体内的对应11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）浓度，当第一剂量11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）浓度与第二剂量11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）浓度之间的差值不显著时，认为该剂量差值未引起阿司匹林的代谢变化。
优选的，所述生物流体样本为尿液样本。
所述血小板高反应性的体外检测系统采用化学发光法检测待测样本中的11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）浓度，进而获得待测者的阿司匹林药物代谢能力。
本发明还提供了阿司匹林疗效动态检测系统及方法，所述系统采用本发明中所述的阿司匹林代谢能力检测方法和/或检测试剂盒。所述方法通过检测样品中的11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）浓度，检测阿司匹林在患者体内的代谢速率，进而获得待测者的阿司匹林药物代谢能力。
本发明还提供了经基因编辑的鼠单克隆抗体，用于结合11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2），所述鼠单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述鼠单抗重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，所述鼠单抗重链可变区氨基酸序列由如序列表SEQ ID NO.3所示的基因序列表达。
与现有技术相比，本发明采用化学发光检测试剂盒及其方法，对检测阿司匹林代谢及血小板高反应性从而判断患者是否具有阿司匹林耐药性或抵抗，具有快速、准确、灵敏度高等特点，且不易被肌酐等生化指标影响，为临床给药提供了科学的参考依据。通过临床实验发现，本试剂盒可以大大降低临床患者由于出现阿司匹林抵抗导致抗血小板聚集治疗失败或效果不佳的问题。
附图说明
图1为鼠单克隆抗体轻链可变区基因序列示意图；
图2为鼠单克隆抗体重链可变区基因序列示意图；
图3为Western blot电泳图结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
本实施例公开的阿司匹林疗效的化学发光检测方法，是采用化学发光法检测人体尿液中的11-DH-TXB2含量。本实施例中的化学发光法采用竞争法原理，以磁微粒作为免疫反应的固相，利用化学发光免疫分析方法与化学发光类测定仪配合，检测11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）含量。
为了获得更加优异的检测效果，本实施例对检测11-脱氢血栓烷B2（11-DH-TXB2）的鼠单抗结构进行了基因编辑，鼠单克隆抗体轻链可变区基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其表达的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；鼠单克隆抗体重链可变区基因序列如序列表SEQ ID NO.3所示，其表达的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
鼠单克隆抗体轻链可变区基因序列（SEQ ID NO.1）具体如下：
ATGG AGAC AGAC ACAC TCCT GTTA TGGG TACT GCTG CTCT GGGT TCCA GGTT CCACTGGT
GACA TTGT GCTG ACAC AGTC TCCT GCTT CCTT AGCT GTAT CTCT GGGG CAGA GGGCCACC
ATCT CGTG CAGG GCCA CCCC CAAC ACAC TGTG CGAC GAAT TCAA AGCC ATGC ACTGGTAC
CAAC AGAA ACCA GGAC AGTC ACCC AAAC TCCT CATC TATG ACGA CTCC AACC TAGAATCT
GGGG TCCC TGCC AGGT TCAG TGGC AGTG GGTC TGGG ACAG ACTT CACC CTCA ACATCCAT
CCTG TGGA GGAG GAGG ATGC TGCA ACCT ATTA CTGT AAAG GCGC TTGC CTGC TCCCTAAA
ATCT TCGG AGGG GGGG ACCA AGCT GGAA ATAA AA
其表达的轻链氨基酸序列（SEQ ID NO.2）具体如下：
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Thr Pro Asn
35 40 45
Thr Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
鼠单克隆抗体重链可变区基因序列（SEQ ID NO.3）具体如下：
ATGC TGTT GGGG CTGT CTCA GCCA CTCT GATC TACA GGAT ATCA AGGT GTGC ATTG
TGAG GTGC TGCT TGTT GAGT CTGG TGGA GGAT TGGT GCAG CCTC TCTC TGTG GCTC
TCTC TGCT CCTT CTTA TCTT CTCG TCTG CTGA GTCT GCTG GAAG ATGA ACTG GGTC
CGCA GGCT CCAG GAAA GGGT TTGG AATG GGTT GCTC GCGC TAAA AGAG TAAC AGGC
ATGA GGGT CGTC ATTA TGCC GATT CAGT GAAA GACA GGTT CACC ATCT CCAG AGAT
GATT CACA TAGC ATGC TCTC TCTG CAGT TGTC TTCT CCAC CACT CTCT GGAG CTAG
GGAT CATG GGTC ATGT GGTT TCTC CAAC AAAG GCTT GTCA CAAC ACTC CTTT GGGG
TATG GCTA TTTC AAAC AACA AGCT CTAT
其表达的重链氨基酸序列（SEQ ID NO.4）具体如下：
Met Leu Leu Gly Leu Ser Gln Thr Leu Val Ile Asp Gly Thr Gln Gly
1 5 10 15
Val His Cys Glu Val Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Leu Ser Val Ala Leu Ser Ala Pro Ser Thr Leu Leu Val Cys Val
35 40 45
Val Cys Trp Lys Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ala Lys Arg Val Asp Asn Met Arg Val Val Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
His Ser Met Leu Ser Leu Gln Leu Ser Ile Thr Thr Leu Ser Gly Ala
100 105 110
Arg Glu Ser Trp Val Met Trp Phe Leu Gln Gln Arg Leu Val Thr Thr
115 120 125
Leu Leu Trp Gly Tyr Ala Asp Ser Asn Asn Lys Leu Thr
130 135 140
11-DH-TXB2的单抗的上述轻链序列如图1所示，上述重链序列如图2所示。制备好的单抗经电泳分析，确定制备的单抗中活性片段大小正确，电泳图如图3所示，泳道1为小鼠IgG全长，泳道2为Fc片段，泳道3为Fab片段。
本实施例采用上述序列的单克隆抗制备了检测试剂盒，所述试剂盒采用竞争法原理，以磁微粒子作为免疫反应的固相，利用化学发光免疫分析方法与化学发光类测定仪配合，用于测定人体尿液中的11-DH-TXB2含量。
1.鼠单克隆抗体试剂盒组成
Ra：包被链霉亲和素的磁微粒、含防腐剂的50mM Tris缓冲液；
Rb：碱性磷酸酶（AP）标记的11-DH-TXB2竞争品，含防腐剂的50mM PBS缓冲液；
Rc：生物素（Biotin）标记的鼠单克隆抗体，含防腐剂的50mM PBS缓冲液；
校准品（选配）：校准品1~6各1瓶，分别添加不同量的11-DH-TXB2抗原，含防腐剂的50mM Tris缓冲液；
质控品（选配）：质控1～2各1瓶，分别添加了不同量的11-DH-TXB2抗原，含防腐剂的50mM Tris缓冲液。
2.配套试剂
本产品中不包含但检测必须用到以下配套试剂：
全自动免疫检验系统用底物液：可以被免疫试剂中的标记酶催化产生光子，从而可以使用化学发光免疫分析仪器检测发光强度。该试剂由湖南远璟生物技术有限公司提供。
清洗液：稀释后用于反应体系的清洗。该试剂由湖南远璟生物技术有限公司提供。
管路清洗液：稀释后用于加样针及管路的清洗。该试剂由湖南远璟生物技术有限公司提供。
3.校准品溯源性
校准品可溯源至Corgenix 酶联免疫分析系统。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
4. 样本要求
1)本试剂盒适用的样本推荐使用尿液样本，检测前样本需恢复至室温。
2)为保证试验需求，样本量要求不少于200μL。
3)储存样本，保持样本完全封闭，在室温（15℃～25℃）条件下不超过8小时。
4)如果8小时内不能完成检测，应立即置2℃～8℃冰箱冷藏，样本在2℃～8℃可储存24小时，长期储存应先分装，-20℃可储存30天，-80℃可储存一年，避免反复冻融。
本实施例采用上述试剂盒进行的检测方法是将待测样本、校准品或质控品种的11-DH-TXB2与碱性磷酸酶（AP）标记的11-DH-TXB2竞争结合生物素（Biotin）标记的鼠单克隆抗体，随后加入包被链霉亲和素的磁微粒，通过链霉亲和素与生物素结合使抗原抗体复合物连接在磁微粒上，在外加磁场中直接吸附沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离，清洗复合物后，加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时发出光子，形成发光反应，即可使用化学发光仪检测反应的发光强度。在检测范围内，发光强度与样本中的11-DH-TXB2的含量成反比，使用改良的四参数Logistic方程拟合可计算出样本中11-DH-TXB2浓度。具体方法如下：
5. 检验方法
检验工作条件要求：室温（15℃～35℃）；相对湿度≤80%。
1） 试验前准备
A） 在试验前需将所有试剂放至室温，仪器开机预热至少30分钟；
B） 按系统操作指引，进行反应管（杯）的装载，配套试剂的添加或更换，废液，废管的清理和液路充满操作。
2） 试剂、样本装载
A） 在试剂装载前，将要用到的试剂放置在混匀设备上充分混匀，目视检查试剂溶液组分应澄清，无异物、沉淀物和絮状物，磁微粒试剂应为均匀悬浊液，无明显凝集；
B） 按照系统操作指引，扫描试剂条形码，完成磁微粒试剂、抗试剂的装载；
C） 校准品、质控品混匀后移至仪器专用的反应杯中，装载于仪器样本位，离心所得尿液样本扫描后直接装载于仪器样本位。
3） 检测步骤
按照全自动化学发光测定仪操作手册操作。检测反应流程及相关参数已被预先定义在仪器操作软件中。
4） 校准曲线与定标
校准曲线的获得包括扫描主曲线卡直接生成，或直接检测6个校准品点拟合生成。
由于试剂活性漂移及通用试剂批次更换，校准后的工作曲线在使用一定期限后需要再定标。当出现下述情况后应重新定标：使用同一批号试剂1个月后（28天）；使用新的批号试剂整盒或者发光底物液；质控值不在质控范围之内时；或测定仪每次维护后。
5） 结果输出
测定仪借助于由标准曲线经两点定标而得到的一条工作曲线，自动地计算每一个样本的11-DH-TXB2浓度，结果以pg/mL表示。
6） 质量控制
A） 应在进行样品检测的每天同时对两个水平的质控品进行测定，将质控品视为病人样品处理；
B） 本试剂盒质控品的质控范围、使用方法以及质控周期参见试剂盒质控单，如果质控结果与预期不符，提示检测结果不可靠，不应出具检测报告。
如果测定结果在系统可接受的质控范围内，则检测结果令人满意，否则提示检测结果不可靠，不应出具检测报告。
6. 参考区间
在确定本试剂盒的参考区间时，从医院或健康检验中心收集健康人（或正常人）尿液标本400例，其中男性110例，女性290例，年龄15~75岁。计算正常人样本检测值的单侧95%（上限为95%）作为参考值。
计算所得本试剂盒参考区间：
11-脱氢血栓烷B2/肌酐＞1500 pg/mg : 提示阿斯匹林（ASA）作用缺乏
11-脱氢血栓烷B2/肌酐≤1500 pg/mg : 提示阿斯匹林（ASA）作用存在
不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测，所测得的11-DH-TXB2水平也会有所不同，因此，建议各实验室建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的11-DH-TXB2值作出诊断，应结合临床其他资料分析结果，包括病人的具体情况和治疗状况。
7.检测结果
采用上述实施例中所述的方法，取样检测后结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中，线性范围（300.0～4000.0）pg/mL，相关系数r≥0.9900。准确度相对偏差在±10.0%范围内。空白限应不大于300.0 pg/mL。重复性变异系数CV应不大于8.0%。批间差变异系数CV应不大于15.0%。
由于方法学或抗体特异性等原因，使用不同生产商的试剂对同一份样本进行检测可能会得到不同的检测结果，因此，用不同试剂检测所得结果不应直接相互比较，以免造成错误的医学解释。超出试剂盒测定范围的测定结果是通过校准品曲线外延得出的计算结果，报告此类结果时，请务必加以注意。如果欲得到确切测值，请将样本进行适当稀释后再进行检测。质控品可作为当次实验结果可信度的参考依据，其测定值应在本批产品的质控单允许的范围之内。检验结果应根据参考值范围与其他临床因素和结果综合进行判定，当检测结果靠近参考值范围的上限值时，可考虑对样本进行确认试验。
序列表
<110> 湖南新开源菲思特精准医疗科技有限公司
<120> 检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的试剂盒及检测方法
<130> 2019
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 394
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(394)
<400> 1
atggagacag acacactcct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120
atctcgtgca gggccacccc caacacactg tgcgacgaat tcaaagccat gcactggtac 180
caacagaaac caggacagtc acccaaactc ctcatctatg acgactccaa cctagaatct 240
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtaaag gcgcttgcct gctccctaaa 360
atcttcggag ggggggacca agctggaaat aaaa 394
<210> 2
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(131)
<400> 2
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Thr Pro Asn
35 40 45
Thr Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asp Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 3
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(420)
<400> 3
atgctgttgg ggctgtctca gccactctga tctacaggat atcaaggtgt gcattgtgag 60
gtgctgcttg ttgagtctgg tggaggattg gtgcagcctc tctctgtggc tctctctgct 120
ccttcttatc ttctcgtctg ctgagtctgc tggaagatga actgggtccg caggctccag 180
gaaagggttt ggaatgggtt gctcgcgcta aaagagtaac aggcatgagg gtcgtcatta 240
tgccgattca gtgaaagaca ggttcaccat ctccagagat gattcacata gcatgctctc 300
tctgcagttg tcttctccac cactctctgg agctagggat catgggtcat gtggtttctc 360
caacaaaggc ttgtcacaac actcctttgg ggtatggcta tttcaaacaa caagctctat 420
<210> 4
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(141)
<400> 4
Met Leu Leu Gly Leu Ser Gln Thr Leu Val Ile Asp Gly Thr Gln Gly
1 5 10 15
Val His Cys Glu Val Leu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Leu Ser Val Ala Leu Ser Ala Pro Ser Thr Leu Leu Val Cys Val
35 40 45
Val Cys Trp Lys Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ala Lys Arg Val Asp Asn Met Arg Val Val Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
His Ser Met Leu Ser Leu Gln Leu Ser Ile Thr Thr Leu Ser Gly Ala
100 105 110
Arg Glu Ser Trp Val Met Trp Phe Leu Gln Gln Arg Leu Val Thr Thr
115 120 125
Leu Leu Trp Gly Tyr Ala Asp Ser Asn Asn Lys Leu Thr
130 135 140

Claims (8)

1. 一 种 检 测 阿 司 匹 林 代 谢 及 血 小 板 高 反 应 性 的 化 学 发 光试 剂 盒 ，其 特 征 在 于：所 述 试 剂盒包括用于结合11-脱氢血栓烷B2的单克隆抗体、11-脱氢血栓烷B2竞争品、磁微粒和发光底物，用于结合11-脱氢血栓烷B2的单克隆抗体为生物素标记的鼠单抗，鼠单抗轻链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，重链可变区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，所述11-脱氢血栓烷B2竞争品为碱性磷酸酶标记的11-脱氢血栓烷B2。
2.根据权利要求1所述一种检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括质控品或校准品。
3.根据权利要求1所述一种检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光试剂盒，其特征在于：结合11-脱氢血栓烷B2的鼠单抗轻链可变区基因序列为SEQ ID NO.1。
4.根据权利要求1所述一种检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光试剂盒，其特征在于：结合11-脱氢血栓烷B2的鼠单抗重链可变区基因序列为SEQ ID NO.3。
5.根据权利要求1所述一种检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光试剂盒，其特征在于：所述发光底物为酶促发光底物。
6.根据权利要求1所述一种检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的化学发光试剂盒，其特征在于：磁微粒为链霉亲和素包被的磁微粒。
7.权利要求1~6任一项所述试剂盒用于检测阿司匹林代谢及血小板高反应性的方法，其特征在于：检测待测样本中11-脱氢血栓烷B2的浓度从而获得阿司匹林的代谢能力。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)分别制备11-脱氢血栓烷B2校准品、生物素结合的鼠单克隆抗体、碱性磷酸酶结合的11-DH-TXB2竞争品；
2)向步骤1)制备的生物素结合的鼠单克隆抗体中同时加入碱性磷酸酶结合的11-脱氢血栓烷B2竞争品和待测11-脱氢血栓烷B2样品，竞争反应；
3)向完成步骤2)的体系中加入包被链霉亲和素的磁微粒，外加磁场吸附沉淀；
4)取步骤3)中的沉淀，清洗后加入酶促发光底物；
5)检测发光强度，发光强度与待测样本中的11-脱氢血栓烷B2成反比。
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