JP5120843B2

JP5120843B2 - 自己免疫性膵炎の検査方法及び検査試薬

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Publication number: JP5120843B2
Application number: JP2008147059A
Authority: JP
Inventors: 哲郎小林; 登代志遠藤; 壮一滝澤
Original assignee: University of Yamanashi NUC
Current assignee: University of Yamanashi NUC
Priority date: 2008-06-04
Filing date: 2008-06-04
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2028-06-04
Also published as: JP2009294040A

Description

本発明は、自己免疫性膵炎（AIP）の検査方法及び検査試薬に関するものである。

現在、AIPの診断は2002年に日本膵臓学会が発表した「自己免疫性膵炎診断基準」に従って行われている。この基準によれば、血液検査の項目である、高γグロブリン血症、高IgG血症、自己抗体のいずれかを認める、ことが診断の十分条件になっている。さらに、高IgG血症のなかでも、IgG4サブクラスが特異的に上昇するとの報告があり、自己抗体としては抗核抗体、リウマチ因子が陽性になることもある、としている。

したがって、本疾患の血液検査では、これらγグロブリン、IgG、IgG4、抗核抗体（SS−A抗体及びSS−B抗体）及びリウマチ因子の測定を行わなければならず、非常に高コストとなることが問題となっている。また、これら検査項目は他疾患でも上昇、あるいは陽性となり、その診断的特異性は乏しい。さらに、本疾患は上記診断基準に従って診断したとしても膵癌との鑑別が非常に困難であり、不必要な手術が行われていると言う現実があるため、両疾患の確実な鑑別法が望まれている。

各研究者はAIPに特異的な自己抗体の探索を行っているが、これまでに、血中ラクトフェリン（LF）抗体及びカルボニックアンヒドラーゼII（CAII）抗体の活性があることを見出している。しかしながら、AIPにおける抗体陽性率はそれぞれ73％、53．8％と臨床的感度に欠けており、方法的な信頼性・再現性も乏しく、診断や鑑別診断には不適当である（非特許文献１、２）。

さらに言えば、AIPの治療の経過を血液検査によりモニタリングすることは投薬量や投薬時期の決定に必要であるが、先に述べた理由と同様に、検査費用が高コストであることが問題となっている。

一方、現在、FT1DMの診断は、2004年に日本糖尿病学会劇症型糖尿病調査委員会により提示された、「劇症1型糖尿病診断基準」により診断されている。それによれば、検体検査として、HbA1C、血糖値、尿中または血中C-ペプチドを測定する。さらに、参考所見として、GAD抗体、IA-2抗体などの自己抗体が陰性であることを確認し、血中膵外分泌酵素の上昇を見ることになっている。

したがって、本疾患においても検査項目数が多く、その診断には費用がかかること，検査が非特異的であることが問題である。

また、本疾患は、高血糖による症状が発現した後、数日でケトアシドーシスに陥ることが多く、確実に診断し治療を早急に開始しないと生命の危機にさらされる。また妊娠中に発症する例が多く、その際は胎児死亡をほとんどがきたす。したがって、通常の糖尿病の発症時にも上記検査項目の測定を行い、FT1DMと1型糖尿病及び2型糖尿病を鑑別するのが望ましいが、良い除外診断のためのFT1DMの検査マーカーがなく、検査項目数が多いため、実際には鑑別診断がなされていないと言うのが現状である。
N. Engl. J. Med. 2001, 344:732-8 J. Gastroenterol. 2001, 36:293-302

本発明は、このような従来の技術の問題点に鑑みてなされたものであり、自己免疫性膵炎(AIP)及び劇症１型糖尿病(FT1DM)の検査方法及び検査試薬を提供することを目的とする。

本発明者は、AIP及びFT1DMの患者並びにFT1DMの発症可能性の高い者の血清にヒートショックタンパク質の一種であるHSP10に対する抗体が存在することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）検体中の、HSP10と免疫学的に反応する抗体を検出することにより自己免疫性膵炎を検査することを特徴とする自己免疫性膵炎の検査方法。
（２）検体中の、HSP10と免疫学的に反応する抗体を検出することにより劇症１型糖尿病を検査することを特徴とする劇症１型糖尿病の検査方法。
上記（１）〜（２）の検査方法においては、前記抗体と免疫学的に反応する抗原を用いることにより前記抗体を検出することが好ましい。

また、本発明は、HSP10と免疫学的に反応する抗体と免疫学的に反応する抗原を含む、上記（１）〜（２）の検査方法に用いるための検査試薬を提供する。

抗HSP10抗体の測定による自己免疫性膵炎の診断は特異的である。従って、検査項目が1項目になることによる検査コストの削減、膵癌との鑑別診断が確実に行われること、治療経過観察が可能であること、による不必要な手術や投薬の削減により、医療費の大幅な削減が実現する。

劇症1型糖尿病と急性発症1型及び2型糖尿病の鑑別は、従来の技術の欄で説明したように、特異的なマーカーがなく、また除外診断のための検査項目数が多いために実際には行われていない。しかし、本発明による測定を行えば、わずか１項目の測定で確定診断及び鑑別診断を行うことができる。またイムノクロマト法をはじめとした簡易検査方法に本測定法を応用すれば、さらに迅速にその場で劇症１型糖尿病の診断を行うことができる。このようにして、従来は死に至っていた患者（さらに患者の胎児）を早期診断、救命することができるとともに、検査にかかる費用の削減及び重症化することによる医療費の削減に大きく寄与する。

以下、本発明の実施の形態を説明する。先ず、本発明検査方法について説明する。
本発明検査方法は、検体中の、HSP10と免疫学的に反応する抗体(以下、「抗HSP10抗体」とも表記する)を検出することにより自己免疫性膵炎(AIP)もしくは劇症１型糖尿病(FT1DM)を検査することを特徴とする。

検出の方法としては、抗HSP10抗体を検出できる限り限定されない。通常には、抗HSP10抗体と免疫学的に反応する抗原または抗体を用いる免疫学的方法が挙げられる。抗体よりも抗原の方が、調製が容易であることから、抗HSP10抗体と免疫学的に反応する抗原を用いる免疫学的方法が好ましい。免疫学的方法としては、一般に広く使用されているELISA法が挙げられる。

抗原は、検体に存在する抗HSP10抗体と免疫学的に反応するものであればよく、ヒトまたは動物から精製したHSP10分子を使用できる。リコンビナント技術によりHSP10分子を調
製してもよい。例えば、ヒトHSP10をコードする塩基配列が公知である（GenBankアクセッション番号NM_002157。コードされるアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、検体に存在する抗HSP10抗体と免疫学的に反応するものである限り、HSP10分子の部分断片を使用することもできる。

測定対象となる検体は、通常には、血清であるが、反応工程の反応を妨げる物質が含まれていない限り、特に限定はされない。

検出の条件は、従来の免疫学的方法と同様の条件で行うことができる。すなわち、各反応物質の添加順序や量、反応温度、反応時間等の条件は、従来の免疫学的方法と同様でよく、例えば、ビーズ、チューブまたはプレート等などの固相に固定した抗原と、血清を反応させ、血清中に含まれる未結合のIgGを除去した後、抗原に結合した抗体に、酵素標識した抗IgG抗体を結合させ、酵素の反応により検出する方法が挙げられる。

抗HSP10抗体の量は、通常には、標識の測定値として算出される。あるいは、既知濃度の抗HSP10抗体を含む標準試料により検量線を作成して検量線により濃度を求めてもよい。

陽性の判定は、健常人の値と比較することによって行うことができる。同時に測定した、あるいは、予め測定された健常人の値から有意に値が高い場合（例えば、２SD以上高い、統計学的テストにより有意に高い）に、陽性と判定できる。

本発明検査方法により測定される抗HSP10抗体の上昇は、AIPやFT1DMに特異的なため、本発明検査方法によれば、AIPやFT1DMが疑われる場合において、１項目の測定により特異的にAIPやFT1DMを検査できる。

次に、本発明検査試薬について説明する。本発明検査試薬は、本発明検査方法を実施するためのものであって、抗HSP10抗体と免疫学的に反応する抗原を含む。

抗HSP10抗体と免疫学的に反応する抗原については、本発明検査方法に関し説明した通りである。

さらに、本発明検査試薬は、免疫学的測定に必要な試薬類、例えば、陽性コントロール、緩衝液等を必要に応じ含んでいてもよく、キットとして提供することもできる。

本発明検査試薬の各構成要素は、溶液状態であってもよいし、凍結乾燥品などの乾燥状態であってもよい。乾燥状態である場合には、使用前に溶液状態にするための緩衝液等をさらに本発明検査試薬に含めてもよい。各構成要素の量や形態は、測定方法の条件に合わせて調整される。

例えば、ELISAのキットの場合、抗原を固定した固相プレート、洗浄液、検体希釈液、酵素標識抗HSP10抗体溶液、基質液、及び、反応停止液を含むキットとすることができる。また、イムノクロマト法のキットでは、反応デバイス及び展開液を含むキットとすることができる。

以下、実施例により本発明を説明する。なお、実施例中、「％」は、特記しない限り重量％を示す。

［参考例１］ヒト膵臓からのｃＤＮＡのクローニング
ヒト膵臓ｃＤＮＡライブラリー（λTriplEx2ヒト膵臓ラージインサートｃＤＮＡライブラリー、BD Bioscience Clontech）及びE. coli XL-1コンピテント細胞（BD Bioscience Clontech）を用いた。プレート上のプラークを、10 mMイソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)に予め浸したニトロセルロース膜に転写し、0.05% Tween 20を含むTris緩衝食塩水(TBST)で洗浄し、１％ウシ血清アルブミンを含むTris緩衝食塩水でブロッキングした。膜を、慢性膵炎(AIP)患者（６７歳、男性）から提供された血清（TBSTで500倍に希釈）と共に、一晩、４℃でインキュベートした。TBSTで４回洗浄し、ヤギセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ（American Qualex、TBSTで2000倍に希釈）と、室温で30分、反応させた。TBSTで４回洗浄し、3,3'-ジアミノベンチジンで陽性反応を検出した。

以上の方法により、AIP患者の血清を用いて得た2×10⁶個のプラークをスクリーニングして、陽性クローンを得た。

陽性クローンのcDNA断片を、センスプライマー5'- ATGGGGATCCGCAGGACAAGCGTTTAGA-3'（配列番号２）及びアンチセンスプライマー5'- CTTCGAAT TCTCAGTCTACGTACTTTCC -3'（配列番号３）を用いてPCRで増幅した。PCR産物をBamHI及びEcoRIで消化し、pTrcHisB (Invitrogen)に連結した。挿入cDNAの配列決定及びホモロジー検索により、１０クローンのうち一つはヒトHSP10の配列に一致した。Monziniら(Biochim. Biophys. Acta. 1218:478-480, 1994)によりクローニングされたヒトHSP10の配列と比較した結果、全長のコード配列を含んでいた。

［参考例２］ヒトHSP10に対する抗体を用いるウェスタンブロッット分析及びELISA
参考例１に示すように、スクリーニングに用いたAIP患者のIgGは、HSP10を認識した。E. coli BL21を用いて、ヒスチジンタグを付けたHSP10を調製した。具体的には、配列決定後、プラスミドをE. coli BL-21 (Novagen)にトランスフェクトし、組換えタンパク質は、1 mM IPTGで誘導して生成させ、His Bondカラムクロマトグラフィーにより精製した。

調製したタンパク質0.1%SDS-15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜への転写を、Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:774-779, 2006に記載された方法を下記のように改変して行った。膜を、2%BSA及び2%ヤギ血清を含むTris緩衝食塩水(TBS)でブロックし、0.1%BSAを含むTBSで1000倍に希釈したAIP患者の血清と室温で１時間インキュベートした。TBSTで５回洗浄し、ヤギセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ（American Qualex、1%BSAで2000倍に希釈）と、室温で30分、反応させた。参考例１と同様にして陽性反応を検出した。

結果を図１（ａ）に示す。患者の血清（レーン１）は明確に14kDa組換えタンパク質を認識したが、健常人の血清（レーン２及び３）は認識しなかった。患者の血清を組換えタンパク質と４℃で一晩、予めインキュベートすると免疫染色は消失した（図１（ｂ）、はめ込み図）。

Diabetes Care 24:1661-7, 2001に記載されたELISAに準じて、調製したタンパク質をプレートにコートし、血清中の抗HSP10抗体を検出するELISAを構築した。具体的には以下の通りである。マイクロタイタープレート(Coster 3590, Corning Inc.)を、組換えヒトHSP10の0.1μg(50μl)により、一晩４℃でコーティングした。0.05% Tween 20を含むリン酸緩衝食塩水(PBST)で３回洗浄し、リン酸緩衝液中10%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液の200μlと共に30分インキュベートした。PBSTで洗浄後、測定に用いた。測定は、患者の血清を、1%BSAで200倍に希釈して３連で行った。結合した抗体を、ヤギセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ（American Qualex、1%BSAで2000倍に希釈）と、室温で30分、反応させた。PBSTで洗浄後、プレートを、1-Step Slow TMB-ELISA (PIERCE) 100μlと共に30分インキュベートした。100μlの1 M H₂SO₄を加えて反応を停止し、450nmの吸光度
を測定した。

正常血清と比較して、患者血清は、強いシグナルを生じた。このシグナルは、患者の血清(1000倍希釈、1 ml)をHSP10 (1μg)と、４℃で一晩、予めインキュベートすると消失した。三連で行われた測定結果を図１（ｂ）に示す。

［実施例１］膵臓疾患患者におけるヒトHSP10に対する自己抗体の存在率
参考例のELISAを用いて種々の膵臓疾患患者（AIP 12例、アルコール性慢性膵炎 13例、膵腫瘍[膵臓癌２例、膵菅内乳頭腫瘍(IPMT)６例]）及び健常人（71例）におけるヒトHSP10に対する自己抗体の存在率を測定した（図２）。健常人の平均値+3SDを超えるときを陽性としたとき、AIP患者(治療前)は12例中10例（95%）でHSP10に対して陽性であった。しかし、その他の血清では、健常人で１例陽性になった他は全て陰性であった。また、コルチコステロイドで治療したAIP患者では８例中５例（63%）が陰性となった。

以上の結果から、本検査方法はAIPの確定診断に非常に有効な方法であることが示された。

［実施例２］DM患者におけるヒトHSP10に対する自己抗体の存在率
参考例２のELISAを用いて種々の型のDM患者（劇症１型DM 16例、急性１型DM 40例、２型糖尿病 50例）、FT1DM患者の第１度近親者 21例、橋本病患者５４例及び健常人 71例におけるヒトHSP10に対する自己抗体の存在率を測定した（図３）。FT1DM患者16例中13例(81%)で陽性を示した。しかし、急性発症１型DM患者及び健常人では、低頻度で検出された（それぞれ、10％及び2％）。２型糖尿病患者では全て陰性であった。代表的な器官特異的自己免疫疾患である橋本病の患者では１例(2%)が陽性であった。FT1DM発症患者の第1度近親者では１例（５％）で本抗体が陽性であった。

以上の結果から、本検査方法がFT1DMの診断に有用であることが示された。

［実施例３］AIP患者及びFT1DM患者における抗HSP10抗体の経時変化
上記ELISAを用いて、AIP患者及びFT1DM患者における抗HSP10抗体の経時変化を調べた。AIP患者（２例）では12~14月、FT1DM患者（２例）では７〜１０週、それぞれ経過を観察した。。三連で行われた測定結果を図４に示す。AIP患者では、発症時から陽性であり、コルチコステロイド治療を開始するまで陽性が継続し、コルチコステロイド治療を開始後、抗体価が低下または消失した（図４（ａ））。FT1DM患者では、発症時は陽性であったが、経過と共に抗体価が低下した（図４（ｂ））。

以上の結果から、本検査方法はAIP及びFT1DMの経過観察に非常に有効な方法であることが示された。

参考例２の測定結果を示す（電気泳動写真）。（ａ）ウェスタンブロット分析、（ｂ）ELISA。実施例１で得られた、種々の膵臓疾患患者におけるヒトHSP10に対する自己抗体の存在率の測定結果を示す。AIP：自己免疫性膵炎（before: コルチコステロイド治療前、after: コルチコステロイド治療後）、CP：アルコール性慢性膵炎、PT：膵腫瘍、N：健常人。図中、点線は、健常人の平均値＋３SDを示す。実施例２で得られた、種々の糖尿病患者におけるヒトHSP10に対する自己抗体の存在率の測定結果を示す。FT1DM：劇症１型、AT1DM：急性１型、T2DM：２型、N：健常人、FDR：FT1DM患者の第１度近親者、Hashimoto：橋本病。図中、点線は、健常人の平均値＋３SDを示す。実施例３で得られた、AIP患者及びFT1DM患者における抗HSP10抗体の経時変化を示す。（ａ）AIP（図中矢印は、コルチコステロイド治療開始時を示す）、（ｂ）FT1DM。図中、点線は、健常人の平均値＋３SDを示す。

Claims

検体中の、HSP10と免疫学的に反応する抗体を検出することにより自己免疫性膵炎を検査
することを特徴とする自己免疫性膵炎の検査方法。
前記抗体と免疫学的に反応する抗原を用いることにより前記抗体を検出する請求項１に記載の検査方法。
前記抗体と免疫学的に反応する抗原を含む、請求項１記載の検査方法に用いるための検査試薬。