WO2009099228A1

WO2009099228A1 - 心不全の予知および検査方法と検査試薬およびキット

Info

Publication number: WO2009099228A1
Application number: PCT/JP2009/052130
Authority: WO
Inventors: Zensuke Ogawa
Original assignee: School Juridical Person Kitasato Institute
Priority date: 2008-02-08
Filing date: 2009-02-09
Publication date: 2009-08-13
Also published as: JP2009183247A

Abstract

　心臓組織において糖代謝に関与する酵素であるホスホグルコムターゼ２ｅ、２ｆおよび／もしくは３またはその断片の体液（例、ヒト血清または血漿）中での濃度または活性を測定することにより、急性心筋梗塞や他の心不全を検査する。この検査は迅速かつ簡便に実施でき、発症前の予知ならびに発症直後や予後の判定が可能で、急性心筋梗塞と他の心不全とを識別できる。本発明は検査試薬および検査キットにも関する。

Description

心不全の予知および検査方法と検査試薬およびキット

　本発明は、心不全の予知および検査方法とこの方法に用いる心不全検査試薬およびキットに関する。

　心不全、特に不安定型狭心症と急性心筋梗塞とを含む急性冠症候群、さらに各種の心筋症は、現在の心臓病の中で大きなウェートを占める重要な病気であり、その診断ニーズはますます増加している。中でも急性心筋梗塞（ＡＭＩ：acute myocardial infarction）は、近年の食生活等の欧米化により、日本においても急激に増加している。急性心筋梗塞の経過は早く、約50％が病院到着前に死亡し、約25％が病院到着から24時間以内に死亡している。従って、救命のためには、迅速かつ的確な判定とそれに対応した適切な処置を施すことが重要である。

　しかし、特に急性心筋梗塞の場合、典型的な強い胸部痛ではなく、左肩や顎への放散痛、歯痛や腕のしびれのみが症状として現れることもある。糖尿病患者では痛みなどの自覚症状の乏しいこともあり、めまい、嘔吐、心窟部痛（みずおちの痛み）など不定愁訴として症状が現れることも多い。さらに、症状を訴えない患者が20％存在する。

　急性心筋梗塞の判定自体は、心電図検査等で比較的容易に行い得るが、生死にかかわる病気であるため、特に明確な症状がない場合には、患者も軽々に異常を訴え難いという問題がある。このため、緊急に判定が必要とされる疾患であるにもかかわらず、症状が見過ごされて死に至るケースも少なくない。

　従って、より簡便な方法、例えば、生化学的マーカーの測定によって心不全の判定が簡易かつ迅速に行えるようになれば、症状が明確でない場合でも早期に他の疾患との鑑別が可能となり、救命率の改善につながると考えられる。

　心臓の造影法は、心筋梗塞予後の経過を見るための適確かつ必要不可欠な検査法である。例えば、冠動脈の狭窄が発生し、ステントを導入した患者では、一定期間後に冠動脈造影を行って狭窄部位の狭窄程度を再確認している。心臓の造影では、ヘパリンの大量投与が必要である。ところが、ヘパリンは心筋梗塞誘発物質であるプラスミノーゲンアクチベータインヒビター（ＰＡＩ－１：plasminogen activator inhibitor-1）と極めて類似した構造を有することから、ヘパリンによる心筋梗塞誘発が問題視されている。しかも、およそ90％の患者では、ステント導入により狭窄部位が改善されており、あえて危険を伴う造影を行う必要性がない。このため、造影の必要性を判断できる検査の確立は大変有用であり、心筋梗塞予後の検査を行なう上でも生化学的マーカーの利用が求められている。

　従来、急性心筋梗塞等の生化学的マーカーとしては心筋逸脱酵素、心筋構造蛋白、および心筋細胞質蛋白が知られている。具体的には、心筋逸脱酵素としてはクレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ－ＭＢ：creatine kinase-MB）、アスパラギン酸アミノトランスフエラーゼ（ＡＳＴ：aspartateaminotransferase）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ：lactate dehydrogenase）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ：phosphoglyceric acid mutase）等が知られている。また、心筋構造蛋白としてはミオシン軽鎖（ＭＬＣ：myosin light chain）、トロポニンＴ（ＴｎＴ：troponin T）、トロポニンI（ＴｎＩ：troponin I）等が、また心筋細胞質蛋白としては、ミオグロビン（Ｍｂ：myoglobin）、心筋型脂肪酸結合蛋白（Ｈ－ＦＡＢＰ：heart-type fatty acid-binding protein）等が知られている。

　しかし、これらの生化学的マーカーは、急性心筋梗塞発症後の経過において、それぞれ特徴的な血中への出現および消失パターンを示し、現実的には、１つのマーカーのみでの正確な急性心筋梗塞の判定は困難である。そこで、実際の臨床の場では、複数のマーカーを測定し、それらの値を総合的に判断して急性心筋梗塞の判定が行なう必要がある。

　しかも、これら既知のマーカーによる測定では、発症の予知は無論のこと、発症直後の疾患の判定も難しい。これらのマーカーの中で急性心筋梗塞発症後に比較的速やかに血中へ出現するのはミオグロビン（Ｍｂ）であるが、それでも、Ｍｂの血中濃度は発症後１～３時間で上昇し、６～10時間で最高値になる程度である。また、そもそも梗塞部位では血流量が著しく低下している。実際、ＣＫ－ＭＢ、ＡＳＴ、ＬＤ、トロポニン、ミオシン軽鎖などは、再灌流後に大量のマーカーが流出してくる現象が知られている。従って、心筋特異性の高いマーカーであっても、血流量が極めて低下していると、血中で検出されない。このため、従来のマーカーは、発症から少なくとも数時間経過しないと判定ができないものであった。

　以上のほか、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ：C-reactive protein）も心筋梗塞の予知が可能であることが報告されている。心筋梗塞も炎症疾患の一つで、心筋梗塞発症後の壊死細胞にＣＲＰが付着していることから、心筋梗塞発症前の炎症発症時に肝臓からのＣＲＰ輸送が活発となることから予知物質になると報告されている。しかし、心筋梗塞前の変化が小さいのに対して、様々な炎症疾患による変化が大きいため、正確に心筋梗塞を予知することは困難である。

　また、心筋逸脱酵素やＣＲＰは、心筋から逸脱した物質であるため、予後の狭窄程度の確認や検査を行なうためのマーカーとしては適当ではない。

発明の概要

　本発明は、発症前から発症直後の時点も含めて急性心筋梗塞をはじめとする心不全を簡便かつ迅速に判定することができる心不全の予知および検査方法、並びにこの方法に用いるための試薬およびキットを提供することを目的とする。

　本発明者は、血液中の心不全マーカー、心筋梗塞マーカーや各種酵素活性を検討した結果、細胞のエネルギー源であるグルコース代謝・供給系の酵素のうち、血液の供給が乏しくなった場合に誘導されるある種の酵素が、心不全（急性心筋梗塞に限られない）の発症「以前」に血中に出てくること、これらの酵素活性または蛋白量を測定することによって心不全の予知と検査が可能であることを発見した。

　１側面において、本発明は、心臓組織において糖代謝に関与する酵素またはその断片の体液中における濃度または活性を測定することを特徴とする、心不全の予知および／または検査方法である。

　別の側面では、本発明は、心臓組織において糖代謝に関与する酵素またはその断片を定性的および／または定量的に検出する試薬から構成された、心不全の予知および／または検査のための試薬である。

　さらに別の側面では、本発明は、心臓組織において糖代謝に関与する酵素またはその断片を定性的および／または定量的に検出することができる試薬の心不全の予知および／または検査のための使用である。

　さらに別の側面では、本発明は、心臓組織において糖代謝に関与する酵素またはその断片を定性的および／または定量的に検出することができる試薬の心不全の予知および／または検査用製品の製造への使用である。

　さらに別の側面では、本発明は、心臓組織において糖代謝に関与する酵素またはその断片を定性的および／または定量的に検出することができる試薬を含む、心不全の予知および／または検査のためのキットである。

　本発明の方法、試薬、使用、およびキットは下記の好適態様を含む：
　・前記酵素が、冠動脈血流量の低下に起因して誘導される酵素である；
　・前記酵素が、ホスホグルコムターゼ２ｅ（ＰＧＭ２ｅ）、ホスホグルコムターゼ２ｆ（ＰＧＭ２ｆ）、およびホスホグルコムターゼ３（ＰＧＭ３）から選ばれた１種または２種以上である；
　・体液が人血清または人血漿である
　・被検者から採取した体液試料を電気泳動により分離し、分離物に対して前記酵素に対応する活性染色法を適用することにより体液中における前記酵素またはその断片の濃度または活性を測定する；
　・被検者から採取した体液試料の濃度または活性を、抗原抗体反応を用いて免疫学的に測定する；
　・前記試薬が、前記酵素が触媒する反応の基質および酵素反応の進行に応じて構造の変化を起こして反応の進行量を表示することができ物質を含む；
　・前記試薬が、前記酵素またはその断片に親和性を有する１種または２種以上の抗体を含む；
　・前記抗体がモノクローナル抗体またはポリクロナール抗体である；
　・急性心筋梗塞の予知、発症直後における他の疾患からの鑑別、予後における再狭窄の検査に用いられる。

　本発明では、心不全の発症「以前」から血中に現れる心不全マーカーを測定する。また、本発明で用いる心不全マーカーは、血流遮断による血中濃度低下の影響を受けにくく、他の臓器の不全から明確に区別できる特異性を有する。このため、発症直後の段階において迅速な判定を行うことができ、発症前の検査による発症の予知も可能である。さらに、本発明では、心不全や冠動脈狭窄患者における冠動脈血流量の低下を検出できるため、処置ないし術後の狭窄程度の確認にも有効に用いることができる。

図１Ａは心筋梗塞患者の血清ＰＧＭのアイソザイムを比較した電気泳動図（図中、１および２は心筋梗塞患者血清であり、３および４はウシ心臓ホモジェナイズ）であり、図１Ｂは肝疾患患者の血清ＰＧＭのアイソザイムを比較した電気泳動図（図中、１および２は肝疾患患者血清であり、３は正常血清）である。図２Ａは対照ラット心臓抽出液の２次元電気泳動図、図２ＢはＬ－ＮＡＮＥ急性投与ラット心臓抽出液の２次元電気泳動図、及び図２Ｃはウサギ筋肉由来ＰＧＭの２次元電気泳動図である。心筋梗塞発症患者におけるＰＧＭおよびＣＫ活性の経時変化を示すグラフ。図４Ａは図３の心筋梗塞発症患者におけるＰＧＭ活性のアイソエンザイム像（アガロース電気泳動図）であり、図４Ｂは図３の心筋梗塞発症患者におけるＣＫ活性のアイソエンザイム像（アガロース電気泳動図）である。

発明を実施するための形態

　I．心不全の予知および検査方法
　本発明の心不全の予知および検査方法は、心臓組織において糖代謝に関与する酵素またはその断片の体液中濃度または活性を測定することを特徴とする。

　体液としては、血液、尿、唾液等が挙げられるが、特に血液が好ましく、血清や血漿を用いるのが最も好ましい。従って、前記体液中濃度は、ヒト血清または血漿のような体液試料を検体として用いて測定される。

　心筋内では、心筋の収縮を伝達する神経組織がグリコーゲンからエネルギーを獲得する性質がある。このため、他組織に比べてグリコーゲン利用頻度が高い。また、神経組織に沿ったグリコーゲンの蓄積も知られている。一方、冠動脈の狭窄は、様々な問題の原因となる。また、狭窄を起こしている血管内皮表面が粥状化していることが心筋梗塞発作の誘発に繋がることも周知の事実である。このような狭窄は血液運搬の低下を来すため、心筋への糖供給が低下し、心筋中に蓄えられているグリコーゲンを消費するが、この時、心筋細胞にグリコーゲン代謝酵素の誘発が生じると考えられる。

　α－ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ：phosphoglucomutase；ＥＣ５.４.２.２）は、動物の組織中にかなり普遍的に存在し、特に肝臓組織中では活性が高く、蛋白質としても多いことが知られている酵素である。本発明者は心不全患者の発作前からの血清におけるグリコーゲン代謝酵素であるＰＧＭ活性を追跡し、発作前から急激にＰＧＭ活性が上昇するという現象を発見した。そのＰＧＭ活性を電気泳動で詳しく調べたところ、心臓組織由来のＰＧＭアイソザイムが血中に多く出現していた。また、ラットの心臓を薬物により狭窄したところ、同様な酵素が出現し、狭窄によるエネルギー代謝への影響により、ＰＧＭやホスホリラーゼ（ＧＰＬ：glycogen phosphorylase）の誘導が生じており、これら心臓由来のＰＧＭやＧＰＬを測定することによって、心不全や心臓発作の直前の予知が可能であることを見出した。

　従って、本発明において、心臓組織において糖代謝に関与する酵素の好ましい例としては、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）およびホスホリラーゼ（ＧＰＬ）の心筋特異的なアイソザイムが挙げられる。

　例えば、ヒトホスホグルコムターゼのアイソザイムとしては、ＰＧＭｌ～ＰＧＭ４の４種のアイソザイムのタイプが知られており、各タイプはそれぞれ複数のアイソザイム（例、ＰＧＭｌａ～ＰＧＭｌｄ、ＰＧＭ２ｅ～ＰＧＭ２ｇ等）に分けられる（例えば、日本臨床第53巻．1995年増刊号pp. 210-214参照）。これらのうち、本発明において有用な心臓組織に特異的なアイソザイムとしては、ホスホグルコムターゼ２ｅ（ＰＧＭ２ｅ）、ホスホグルコムターゼ２ｆ（ＰＧＭ２ｆ）、および３（ＰＧＭ３）が挙げられる。これらのアイソザイムは、アガロースゲル電気泳動法にて区別できる。なお、ここでアルファベット記号は原点側をａとして付されている（上記文献p. 211参照）。

　以下の説明では、心臓組織において糖代謝に関与する酵素またはその断片を、単に「本発明マーカー」という。断片は、心臓組織に特異的に存在するアイソザイムに特徴的な部位を含んでいればよい。

　体液試料中の本発明マーカーの検出は、それが可能な任意の方法により実施できる。
　例えば、急性心筋梗塞の判定は、検出された体液試料中の本発明マーカー量を健常者の場合と比較し、その値よりも高い場合に急性心筋梗塞に罹患していると判定することができる。また、本発明マーカーの検出限界が健常者レベル以上である本発明マーカーの定性的な検出方法を採用すれば、急性心筋梗塞の陽性、陰性の判定も可能である。さらに、予め求めておいた本抗原量と梗塞巣の大きさとの関係から、本疾患の重症度を推定することもできる。

　例えば、血清などの体液試料を電気泳動し、ホスホグルコムターゼの基質（Ｇ１Ｐ、Ｇｌ、６Ｐ）、およびＧ６ＰＤＨとその基質（ＮＡＤＰ）、ジアホラーゼとその基質（ＭＴＴ）が入った活性染色液にて活性染色し、ＰＧＭ２ｅ、２ｆ、３に相当する各位置の活性を検出すればよい。電気泳動は、プレート上に展延したゲルを用いたものでもよいし、毛管電気泳動でもよい。

　また、本発明マーカーを認識する抗体、ポリクロナール抗体や特にモノクローナル抗体が有する特異反応を利用する免疫学的方法により検査を行うこともできる。抗体の作成法は当業者には周知である。例えば人心臓組織または人血清を精製して、これらの心臓組織特異的な酵素を取得し、または該酵素を遺伝子組み換え技術により製造し、この抗原を適当なアジュバントとともに、例えば、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ等に免疫して血液を採取し、ＩｇＧ画分を精製することによりポリクロナール抗体を得ることができる。モノクローナル抗体は、上記のような動物の皮下に注射して免役し、抗体価が上昇したところで、その脾臓からＢ細胞を取り出して、肝癌細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生する細胞をマウスの腹腔内に注射して増殖させるか、または通常の細胞培養液中にて培養して細胞を増殖し、産生する抗体を取得する手法が用いられる。

　用い得る免疫学的方法としては、標識抗体を用いる方法と、それを用いない方法の両者が含まれる。標識抗体を用いる免疫学的な方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法などが挙げられる。この中で好ましいのはＥＩＡ法である。２種類の抗体、特にモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＩＡ法が、抗原に対する特異性および検出操作の容易性において更に好ましい。

　サンドイッチＥＩＡ法による本発明マーカーの検出は、本発明マーカーの異なるエピトープを認識する２種類の抗体、すなわち固相化抗体と酵素標識抗体との間に本発明マーカーを挟み込み（サンドイッチ）、本発明マーカーに結合した標識抗体の酵素量を測ることにより行うことができる。例えば、ホスホグルコムターゼ２ｅ（ＰＧＭ２ｅ）の例で言えば、ホスホグルコムターゼに共通の抗体を固相化抗体として用い、アイソザイム２ｅ（ＰＧＭ２ｅ）に特異的なモノクローナル抗体などを標識抗体とすることができる。あるいは、上記のようにして得られた抗体を固相化し、検体を添加して抗原抗体反応させ、洗浄後、酵素標識化されたポリクロナール抗体または固相化された抗体とは違うエピトープを持つモノクローナル抗体を反応させた後、これら動物抗体に対する酵素標識化された別の動物抗体を反応させ、最終的に標識酵素に基質を反応させて酵素反応によるシグナルを検出する。酵素基質としては、選択した標識酵素に応じて適当なものが選ばれる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを選択した場合は、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）等が挙げられる。パーオキシダーゼを選択した場合は、基質として過酸化水素が挙げられ、発色剤としてＯ－フェニレンジアミン、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）などが用いられる。

　固相化担体は、目的に応じて適当なものを用いればよく、例えば９６穴マイクロプレートのような所定数の穴（ウェル）を設けたプレート等を用いることができる。
　サンドイッチ法を原理とする別の方法として、いわゆるイムノクロマト法がある。本方法の実施には特別な測定機器は不要であるため、迅速な診断を必要とする本疾患の判定には有利な方法である。

　標識抗体を用いない免疫学的方法としては、抗体感作ラテックス粒子と抗原との凝集反応を利用したラテックス凝集法、抗原抗体複合体形成に伴う濁度を測定する比濁法、抗体固相膜電極を利用し、抗原との結合による電位変化を検出する酵素センサー電極法等があり、いずれの方法によっても本発明マーカーを検出することができる。

　なお、以上に挙げた方法は例示であって、このほかにも、表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＳＰＲセンサー、例えば、特開平11－023575参照）等を利用することも可能である。

　本発明の予知および検査方法は、ヒトおよび心不全を発症する他のすべての動物に対して適用可能であるが、特に、ヒトの心不全に対して有用性が高い。
　本発明において、「心不全」とはうっ血性心不全、即ち、心筋の収縮力が低下して、心拍出量が減少した症状を意味し、急性および慢性の心筋梗塞および各種の心筋症を含む。これらの疾病は、冠状動脈内の血管壁の変化による血液流路の狭窄、心臓内部での血液の停滞、血管外部からの圧迫による血液流路の狭窄等、その発生機序は異なるが、本発明では心筋への血流の低下すべてを検知できるため、いずれの疾患にも適用可能である。本発明は、特に急性心不全、その中でも不安定型狭心症と急性心筋梗塞とを含む急性冠症候群の予知と検査に有用である。特に有利には、本発明は、急性心筋梗塞の予知、その発症直後における他の疾患からの鑑別、その予後における再狭窄の検査に用いることができる。

　急性心筋梗塞の予知の場合、概ね発症前の数日から数時間以内に本発明マーカーの顕著な上昇が見られるため、本発明の方法によるモニタリングは極めて有効である。また、このように、本発明マーカーは、急性心筋梗塞の発症以前から増加し、発症時において既に相当量が血中に存在しているため、心筋梗塞の判定に極めて有効である。さらに、本発明マーカーは、心筋の壊死等に至る以前の血流の低下を示すため、各種の心不全の予後における検査にも有効に用いることができる。

　ＩＩ．心不全の予知および／または検査のための試薬およびキット
　本発明の検査試薬は、上記の説明に従って構成することができる。この試薬は、本発明マーカーである酵素（またはその断片）を定性的および／または定量的に検出できる物質を含んでいる。上述したように、検出は酵素反応または免疫学的反応（抗原抗体反応）により行うことができる。

　酵素反応による検出のための試薬は、本発明マーカーである酵素が触媒する反応の基質と場合により酵素反応の進行に応じて構造の変化を起こして反応の進行量を表示する検査試薬とを含む。免疫学的な検出のための試薬は、本発明マーカーである酵素またはその断片に親和性を有する（従って、これを認識する）１種または２種以上の抗体を含む。

　酵素反応による検査試薬の例は、上述したホスホグルコムターゼの基質（Ｇ１Ｐ、Ｇｌ、６Ｐ）である。あるいは、これにＧ６ＰＤＨとその基質（ＮＡＤＰ）およびジアホラーゼとその基質（ＭＴＴ）を組み合わせて含有させた活性染色液を検査試薬とすることもできる。検査試薬として使用できる上記抗体の例としては、前述した標識または非標識のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が挙げられる。

　また、本発明の検査試薬は、必要に応じて、他の部材(化学薬品、生物学的材料および／または機材)を組み合わせてキットを構成してもよい。例えば、検査が電気泳動による分離工程を含む場合は、キットは電気泳動に必要なプレートや毛管を含むことができる。免疫学的方法で検査する場合には、キットは一次抗体等を担持するためのマイクロウェルプレートやビーズ、ストリング、ラテックス粒子等を含み得る。キットはまた、使用説明書などの文書を含みうる。

　キットに含まれる検査試薬は、本発明マーカーの検査試薬のみでもよいが、これに他の心不全マーカーの検査試薬を組み合わせてもよい。また、本発明マーカー自体も２種以上を組み合わせて検出に用いることが好ましく、従って試薬は対応して２種以上のマーカーを検出できるものを使用することが好ましい。

　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明を制限するものではない。なお、以下の例において、ＰＧＭの確認のためには、アガロースゲル電気泳動（図１および図４ではホルマザン染色）を用いた。

　参考例１：ＰＧＭアイソエンザイムの測定
　図１Ａおよび図１Ｂに、心筋梗塞患者と肝疾患患者の血清、また、対照としてウシ心臓の抽出液と健常人の血清を電気泳動し、活性染色を行った泳動像を示す。これらの試料と各図中の符号の対応は以下の通りである；
　図１Ａ中の１と２：心筋梗塞患者血清、
　図１Ａ中の３と４：ウシ心臓の抽出液（ホモジナイズ）、
　図１Ｂ中の１と２：肝疾患患者血清、
　図１Ｂ中の３：健常者血清。

　図１Ａと図１Ｂは一つの電気泳動の結果を示すものであり、図１Ａと図１Ｂを横方向に連続して見る。図中、上側から下側に向けて電気泳動を行っており、図で２ｆとして示した下側には有意なスポットは認められなかったため、図示を省略した。

　ウシ心臓の試料については、これを前記文献（日本臨床第53巻．1995年増刊号pp.210-214）記載の方法での結果と対比することにより、図示のように、３つのスポットが上からそれぞれＰＧＭ１、ＰＧＭ２ｅ、およびＰＧＭ２ｆ（図ではそれぞれＩ，ＩＩｅ，ＩＩｆと表示）であることを確認した。

　図１の結果に見られるように、ＰＧＭ１はどの泳動像にも見られた。しかし、心筋梗塞患者およびウシ心臓抽出液ではＰＧＭ１以外に２つのバンド（ＰＧＭ２ｅとＰＧＭ２ｆ）が認められた。すなわち、図１Ａの３と４より、心臓中には、ＰＧＭ１、ＰＧＭ２ｅおよびＰＧＭ２ｆの３種類のアイソザイムが存在することがわかる。また、図１Ａの１と２より、心筋梗塞患者では、血清中にこれらの３種のアイソザイムが存在することがわかる。

　一方、図１Ｂの３（健常者血清）ではＰＧＭ１は認められるものの、ＰＧＭ２ｅとＰＧＭ２ｆは認められない。つまり、健常者の血清にはＰＧＭ２ｅとＰＧＭ２ｆは認められない。従って、上述の図１Ａの結果と合わせて考えると、ＰＧＭ２ｅとＰＧＭ２ｆは心筋梗塞患者ではこの疾患に起因して血清中に存在する可能性が考えられる。さらに、図１Ｂの１と２（肝疾患患者であって心筋梗塞患者でない者の血清）でも、ＰＧＭ２ｅとＰＧＭ２ｆは認められない。

　図１Ａ中の１と２の試料を採取した患者においては、心筋梗塞以外には共通する疾患が診断されていないことから、図１Ａ中の１と２におけるＰＧＭ２ｅとＰＧＭ２ｆは心筋梗塞に起因して血清中に存在していると考えられる。

　つまり、ＰＧＭ２ｅとＰＧＭ２ｆは心筋梗塞に特異的なマーカーとして利用できることが示された。
　なお、ＰＧＭ３は存在するとすれば、図示していない範囲に現れるが、この電気泳動においてはほとんど確認できなかった。

　参考例２：人為的に冠動脈を狭窄させたラット心臓に誘発された蛋白の確認
　一酸化窒素ＮＯは冠動脈の拡張作用を有することが知られている。そこで、L-NAME（ＮＯＳ阻害剤、Ｎ^G-ニトロ-Ｌ-アルギニンメチルエステル塩酸塩）を摂取させることにより血管の拡張を阻害し、人為的に心筋梗塞を発症させることができる。

　このようにして人為的に心筋梗塞を発症させたラットの心臓組織200 mgをライシス緩衝液（pH 8.9、参考例３に記載のものと同じ）中でホモジナイズし、3,000 rpmにて遠心分離した上清を寒天ゲル（pH 5～8、ATTO）にスポッティングし、１次元目として電気泳動システムで300 Vの定電圧で210分間泳動した。続いて２次元目としてe-PAGE（ATTO）にて20 mA定電流で90分間泳動し、活性染色した。染色法は後述する実施例１と同様であった。結果を図２Ｂに示す。

　また、L-NAMEを摂取させず、従って、心筋梗塞に罹患していない対照（コントロール）ラットについても同様の実験を行なった。結果を図２Ａに示す。
　なお、スポットを同定するため、市販されているウサギ骨格筋由来のＰＧＭ（骨格筋中に含有されているＰＧＭ）についても上記の２例と同様に２次元電気泳動像を行なった。結果を図２Ｃに示す。

　これらの図を比較すると、図２Ｂおよび２Ｃには、印で示す部位にＰＧＭ活性スポットが認められるのに対し、図２Ａでは対応する箇所（同じく矢印で示す）にはスポットは認められない。参考例１のウシ心臓ホモジェナイズの例で示されるように、心筋中には本来、ＰＧＭは含有されているはずであり、図２Ａの健常ラットでＰＧＭ活性スポットが認められないのは、試料の量が少ないためと考えられる。にもかかわらず、心筋梗塞ラットでＰＧＭ活性スポットが認められるのは、健常ラットに比べ、多量のＰＧＭが生成しているためであろう。すなわち、健常ラット心臓中のＰＧＭ量は実質的に確認できない程度に微量であるのに対し、心筋梗塞ラットでは、心臓中のＰＧＭ量が明確に判定できる程度に増大していることがわかる。

　参考例３：ＰＧＭ２および３に対するポリクロナール抗体の取得
　ヒト心臓由来の組織約10 gを、ライシス緩衝液（10 mmol/L Tris、0.5％ CHAPS、2 mmol/L チオ尿素、10 mol/L オルトバナジン酸ナトリウム、10％グリセリン、5 mmol/L EDTA-Mgを含有）10 ml中でホモジナイズし、18,000 gにて15分遠心分離して得た上清をMinicon B15（MILLIPORE社）にて５倍に濃縮し、DISMIC-13 cp 酢酸セルロース膜0.45μm（ADVANTEC）で濾過した。濾液を、DEAE-5PW（TOSO）を用いてクロマト分画した。溶出液として次の２液を用いてグラジェント溶出を行った（流速1.O ml/min、０～20分で緩衝液Ｂを０％から20％に増加）:
　緩衝液Ａ：pH＝8.0、10 mmol/L Tris－HCl、2 mmol/Lチオ尿素、8％グリセリン、1 mmol/L EDTA-Mg、
　緩衝液Ｂ：緩衝液Ａに250 mmol/L NaClを溶解。

　ＰＧＭ２およびＰＧＭ３はNaCl濃度220～280 mol/Lの画分に出現した。
　得られた画分をAmicon MW 30Kに入れ、TOMY社RX-200遠心分離器で4,400rpmにて40分間遠心した。この濃縮サンプルを、さらにヒドロキシアパタイトカラム（TONEN社）を用いて、緩衝液Ｃ、Ｄにてグラジェント溶出して、目的物を精製した。流速は0.7 ml/minで、緩衝液Ｄを０％から100％に増加させて溶出を行った:
　緩衝液Ｃ：20 mmol/L MOPS（pH＝6.8、0.5％ CHAPSを含む）、
　緩衝液Ｄ：緩衝液Ｃに100 mmol/L KPO₄を溶解。

　ＰＧＭ２、３は、NaCl濃度約40～75 mmol/Lの画分に分離して出現した。画分は酵素活性にて確認し、最終的には脱塩した。
　得られたＰＧＭ２およびＰＧＭ３をマウスまたはヤギに免役し、免疫力価が上昇したものから血清を採取し、常法にて精製抗体（ポリクローナル抗体）を取得した。

　実施例１
　心筋梗塞を２回連続して発症した患者の発作前から発作後、再発作前後に至る各種時点にて採取した血清を用いて、ＰＧＭ活性およびＣＫ活性を測定した（図３）。活性は、各マーカーの濃度の基準値（ＰＧＭについては参考値）を１とした時の相対値で示す。

　図中、黒色の縦棒として示したものがＰＧＭであり、白色の縦棒として示したのが、従来から心筋梗塞の生化学的マーカーとして使用されているクレアチンキナーゼ（ＣＫ－ＭＢ；クレアチンキナーゼにもいくつかのアイソザイムが存在するが、心筋梗塞の生化学的マーカーとして用いるのはＣＫ－ＭＢである；以後、特に混乱を招かない限り、単にＣＫという）である。

　この図からわかるように、血清中のＣＫ濃度は、最初の発作（first attack）の前24時間（図中、横軸の「－24」）では低い（濃度の基準値に対する相対値（以下同じ）でほぼ0.5）が、発作が起こった時点では急速に濃度が増大し、以後、急速に濃度が低減し、矢印の時点では（第１回発作後96時間）正常値（ほぼ0.5）に復帰している。血清中ＣＫ濃度は第２回発作（second attack）でも同様の推移を示している。即ち、ＣＫ濃度は第２回発作前48時間（図中、横軸の「－48」）では低いが、発作が起こった時点で急速に増大し、その後は急速に低減している。この患者は２回目の大きな発作後に死亡した。

　これに対して、血清中のＰＧＭ濃度は、最初の発作前24時間（横軸の「－24」）で既に高い値（ほぼ７）を示している。むしろ発作前（黒枠で囲った）の方が発作時点よりもＰＧＭ濃度が高い。その後、矢印の時点で（第１回発作後96時間）ＰＧＭ濃度はほぼ正常値（ほぼ１）に復帰しているが、ＣＫ濃度とは異なり、ＰＧＭ濃度は、第２回発作前48時間（横軸の「－48」）で再び増大（ほぼ２に）を示した。

　以上の結果から、ＰＧＭ濃度では極めて特異な現象として、濃度が発症後ではなく、発症前から既に増加し始めていることがわかる。
　同じ試料を、参考例１と同様に電気泳動し、染色した結果を図４Ａおよび図４Ｂに示した。

　図４Ａの黒枠内はＰＧＭ２eとＰＧＭ２ｆに相当する領域であり、最初の発作（first attack）前24時間、第２回発作（second attack）前48時間以後はいずれも有意なスポットが認められる（図中矢印）。一方、図４Ｂでは、図中下側にＣＫ－ＭＢに相当する領域が存在するが、ＣＫ－ＭＢがかろうじて認められるのは２回目の発作の後に採血された２回の試料で観察した場合（黒枠内）のみである。

　以上の結果から、本発明における生化学マーカーであるＰＧＭ（心筋梗塞特異的にはＰＧＭ２eとＰＧＭ２ｆ）は、心筋梗塞の起こる以前から血中濃度の増大が認められ、診断マーカー、特に予知マーカー（発作発生が迫った状態を示すマーカー）として極めて有効であることがわかる。

　上記電気泳動では、バルビタール緩衝液（pH 8.6）に寒天を溶解したゲルに試料をスポッティングし、電気泳動システムで120 Vの定電圧で20分泳動した。ＰＧＭ活性染色は、試薬１として、0.1％のTriton-X 100、0.4 mmol/LのNADP、75 mmol/LのEDTA-Mg、0.24 mmol/LのＮ-アセチルシステイン、120μmol/LのG1.6P、2.4 U/mLのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを含有する100 mMのTris-HCl緩衝液（pH 8.0）、試薬２として15 mmol/LのG1P、0.1％のTriton-X 100を含有する100 mMのTris-HCl緩衝液（pH 8.0）を用意し、試薬１／試薬２＝８／１に混合した液に、ジアホラーゼを5 U／mL、MTTを0.01 mg/mL溶解して染色液とした。染色条件は37℃、30分であった。ＣＫ活性は、ヘレナ研究所より市販されているアガロースゲルと蛍光測定用試薬を用い、指示された方法に従って測定した。

　実施例２
　心筋梗塞発作を発生した患者から採取した血清試料について、実施例１と同様に電気泳動および活性染色を行なった。発作発生から発作発生５時間以内に採血できた32例の全例において、ＰＧＭ２とＰＧＭ３のバンドが共に確認できた。

　一方、脳性Na利尿ペプチドが上昇した不安定狭心症に罹患している心不全患者30名から採取した血清試料の測定でも、ほとんどの患者でＰＧＭ２が確認され、ＰＧＭ３も検出された。ただし、急性心筋梗塞患者に比べると、反応は特にＰＧＭ３において弱くなる傾向が認められた。

　一方、健常人58名の同様な検査では、ＰＧＭ２とＰＧＭ３のいずれも認めることができなかった。
　以上の結果を表１にまとめて示す。これらの結果から、ＰＧＭ２およびＰＧＭ３が、心不全マーカーとして一般的に有用であることがわかる。

実施例３
　フナコシ（株）の販売しているヒト由来ＰＧＭ２およびＰＧＭ３に対するモノクローナル抗体を使用し、NUNC社マイクロプレートに常法で固相化し、非特異結合性を除くためにＢＳＡにてブロッキングして、固相化マイクロプレートを得た。一方、参考例３で得られた抗ヒトＰＧＭ２、ＰＧＭ３ヤギポリクロナール抗体を、同仁化学社製パーオキシダーゼ標識キットを使用して標識し、標識抗体を得た。

　実施例２で使用した検体の一部を使用し、ＰＢＳで10倍希釈して血清サンプルとした。一方、参考例３で取得した精製ＰＧＭ２および３をそれぞれＰＢＳで10倍希釈して、ＰＧＭ２および３の標準サンプルとした。

　上記固相化マイクロプレートにサンプル（標準サンプルまたは血清サンプル）を入れ、37℃で１時間反応させ、ＰＢＳにＢＳＡを1 mg/dLの量で溶解させた液を洗浄液として用いて２回洗浄し、次に上記標識抗体を反応させ、さらに同じ洗浄液で２回洗浄した。パーオキシダーゼの発色基質として市販オルトフェニレジアミン溶液を添加して、37℃で30分間反応させ、発色した色素を450 nmにてマイクロプレートリーダーで測定したところ、次表に示す結果を得た。表中の「心不全」患者は上記の通り、不安定狭心症患者を指す。

　この結果に示されるように、本発明の検出試薬を用いれば、心筋梗塞発作患者を確実に識別可能である。また、ＰＧＭ２とＰＧＭ３とを組み合わせれば、心筋梗塞患者とその他の心不全患者との識別も可能である。

　以上に本発明を特定の態様について説明したが、上記説明は例示を目的とし、制限を意図していない。本発明の範囲内において各種の変更が可能である。

Claims

　心臓組織において糖代謝に関与する酵素またはその断片の体液中における濃度または活性を測定することを特徴とする、心不全の予知および／または検査方法。
　前記酵素が、冠動脈血流量の低下に起因して誘導される酵素である、請求項１に記載の方法。
　前記酵素が、ホスホグルコムターゼ２ｅ（ＰＧＭ２ｅ）、ホスホグルコムターゼ２ｆ（ＰＧＭ２ｆ）、およびホスホグルコムターゼ３（ＰＧＭ３）から選ばれた１種または２種以上である、請求項２に記載の方法。
　体液が人血清または人血漿である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
　被検者から採取した体液試料を電気泳動により分離し、分離物に対して前記酵素に対応する活性染色法を適用することにより体液中における前記酵素またはその断片の濃度または活性を測定する請求項１～３のいずれかに記載の方法。
　被検者から採取した体液試料の濃度または活性を、抗原抗体反応を用いて免疫学的に測定する請求項１～３のいずれかに記載の方法。
　心臓組織において糖代謝に関与する酵素またはその断片を定性的および／または定量的に検出することができる試薬から構成された、心不全の予知および／または検査のための試薬。
　心臓組織において糖代謝に関与する酵素またはその断片を定性的および／または定量的に検出することができる試薬を含む、心不全の予知および／または検査のためのキット。
　前記酵素が、冠動脈血流量の低下に起因して誘導される酵素である請求項７に記載の試薬または請求項８に記載の試薬キット。
　前記酵素が、ホスホグルコムターゼ２ｅ（ＰＧＭ２ｅ）、ホスホグルコムターゼ２ｆ（ＰＧＭ２ｆ）およびホスホグルコムターゼ３（ＰＧＭ３）から選ばれた１種または２種以上である、請求項７に記載の試薬または請求項８に記載の試薬キット。
　前記試薬が、前記酵素が触媒する反応の基質および酵素反応の進行に応じて構造の変化を起こして反応の進行量を表示することができる物質を含む、請求項７に記載の試薬または請求項８に記載の試薬キット。
　前記試薬が、前記酵素またはその断片に親和性を有する１種または２種以上の抗体を含む、請求項７に記載の試薬または請求項８に記載の試薬キット。
　前記抗体がモノクローナル抗体またはポリクロナール抗体である、請求項１２に記載の試薬または試薬キット。
　急性心筋梗塞の予知、発症直後における他の疾患からの鑑別、予後における再狭窄の検査に用いられる、請求項７に記載の試薬または請求項８に記載の試薬キット。