PT2021796E - Diagnóstico de doença cardiovascular - Google Patents

Description

1 "DIAGNÓSTICO DE DOENÇA CARDIOVASCULAR"

Descrição CAMPO TÉCNICO

Esta invenção refere-se a métodos para detecção de insuficiência cardíaca e embolismo pulmonar em indivíduos com elevado índice de massa corporal (IMC) e aqueles com função renal comprometida.

ANTECEDENTES Níveis de peptídeos natriuréticos como peptídeo natriurético de tipo-B (BNP) e a prohormona N-terminal do BNP (NT-proBNP) foram demonstrados como diagnósticos de doença cardiovascular (Clerico e Erndin, Clin. Chem. 50:33-50 (2004)) . Contudo, é sabido e aceite no campo que determinados sujeitos têm níveis de peptídeo natriurético que são inferiores ao esperado em relação a um sujeito "normal" para o mesmo nível da doença. O mecanismo exacto para este fenómeno não é conhecido. Estes sujeitos incluem pessoas com função renal comprometida (Anwaruddin et al., J. Am. Coll.Cardiol. 47(1):91-7 (2006); MeCullough et al., Am. J. Kidney Dis. 41(3):571 -9 (2003)), e aqueles que têm excesso de peso (índice de massa corporal (IMC) de 25-29) ou obesos (IMC á 30) (Krauser et al., Am. Heart J. 149(14):744-50 (2005); McCord et al., Arch. Intern. Med. 164 (20); 2247-52 (2004)).

SUMÁRIO A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta surpreendente de que, ao contrário dos peptídeos natriuréticos (NPs), o biomarcador ST2 (também conhecido por Receptor tipo-1 da Interleucina 1 (IL1RL1)) não é afectado por um elevado índice de massa corporal (IMC) ou por função renal comprometida, e, portanto, proporciona melhor informação prognóstica e diagnóstica do que os NP's em sujeitos com elevado IMC ou função renal comprometida. Assim, os métodos descritos aqui incluem determinar se um 2 sujeito tem um elevado IMC e/ou tem insuficiência renal, e se o sujeito tem uma ou ambas condições patológicas, seleccionar o sujeito, e determinar os niveis de IL1LR1, e, opcionalmente, de BNP e/ou dimero-D no sujeito. Estes métodos podem ser usados para diagnosticar doença cardiovascular (DCV), por exemplo, sindrome coronária aguda (SCA), insuficiência cardíaca (IC), e embolismo pulmonar (EP) no sujeito, por exemplo, em sujeitos com dispneia.

Em algumas formas de realização, os métodos incluem determinar níveis de IL-33 além de determinar níveis de ST2.

Num aspecto, a invenção proporciona métodos para diagnosticar doença cardiovascular (DCV), por exemplo, sindrome coronária aguda (SCA), insuficiência cardíaca (IC), ou embolismo pulmonar (PE) num sujeito gue tem um índice de massa corporal (IMC) maior ou igual a 25. Os métodos incluem determinar o IMC do sujeito e se o IMC do sujeito é igual ou superior a 25, seleccionar o sujeito; e determinar níveis de ST2, e ambos níveis de BNP e de dímero-D, no sangue, plasma, ou soro do sujeito. A relação do nível de ST2 para um nível de referência de ST2, por exemplo, um nível de referência gue representa um nível de ST2 num sujeito gue não tem DCV, indica se o sujeito tem DCV. Em algumas formas de realização, se o nível de BNP do sujeito é inferior a 500 pg/mL, por exemplo, 100-500 pg/mL, e o nível de dímero-D é inferior a 500 pg/L, então a relação do nível de ST2 para um nível de referência de ST2, por exemplo, um nível de referência gue representa um nível de ST2 num sujeito gue não tem IC, indica se o sujeito tem IC. Em algumas formas de realização, se o nível de BNP do sujeito é inferior a 100 Pg/mL, e o nível de dímero-D é 500-4000 pg/L, então a relação do nível de ST2 para um nível de referência de ST2, por exemplo, um nível de referência que representa um nível de ST2 num sujeito que não tem EP, indica se o sujeito tem EP. 3

Num outro aspecto, a invenção proporciona métodos para diagnosticar doença cardiovascular (DCV), por exemplo, sindrome coronária aguda (SCA), insuficiência cardíaca (IC), ou embolismo pulmonar (EP) num sujeito que tem função renal comprometida. Os métodos incluem avaliar a função renal do sujeito, e se o sujeito tem função renal comprometida, seleccionar o sujeito; e determinar um nível de ST2, e opcionalmente um nível de BNP e/ou um nível de dímero-D, no sangue, plasma ou soro do sujeito. A relação do nível de ST2 para um nível de referência de ST2, por exemplo, um nível de referência que representa o nível de ST2 num sujeito que não tem DCV, indica se o sujeito tem DCV. Em algumas formas de realização, se o nível BNP do sujeito é inferior a 500 pg/mL, por exemplo, 100-500 pg/mL, e o nível de dímero-D é inferior a 500 pg/L, então a relação do nível de ST2 para um nível de referência de ST2, por exemplo, um nível de referência que representa um nível de ST2 num sujeito que não tem IC, indica se o sujeito tem IC. Em algumas formas de realização, se o nível BNP do sujeito é inferior a 100 pg/mL, e o nível de dímero-D é 500-4000 pg/L, então a relação do nível de ST2 para um nível de referência de ST2, por exemplo, um nível de referência que representa um nível de ST2 num sujeito que não tem EP, indica se o sujeito tem EP.

Em alguma forma de realização, o nível de referência representa um nível num sujeito que não tem DCV, por exemplo, não tem SCA, IC e/ou EP. Em algumas formas de realização, por exemplo, em que o nível do biomarcador de ST2 é medido usando um imunoensaio, por exemplo, um ensaio imunoenzimático (ELISA), por exemplo, tal como descrito no Exemplo 1, o nível de referência é aproximadamente 0,2 a 0,3 ng/ml, por exemplo, o nível pode ser 0,20, 0,23, 0,25, 0,27, ou 0,29 ng/ml de soro, e os valores acima desse nível indicam a presença de DCV, por exemplo, SCA, IC e/ou EP. Se for empregue uma técnica analítica, que não seja a ELISA 4 descrita no Exemplo 1, o nível de referência de ST2 pode ser diferente do que o descrito aqui. Contudo, os números específicos recitados aqui devem ser construídos de forma a serem equivalentes aos números correspondentes qerados usando outras técnicas analíticas.

Em qeral, determinar um nível de ST2, BNP, e/ou dímero-D num sujeito inclui obter uma amostra biolóqica do sujeito, contactar as composições de união com a amostra, as composições de união liqam-se especificamente a ST2, BNP e dímero-D, e medir ou determinar a liqação específica da composição de união à amostra. As composições de união podem ser, por exemplo, anticorpos que se ligam especificamente a polipeptídeos ST2, BNP, e dímero-D (por exemplo, um anticorpo anti-ST2, um anticorpo anti-BNP, e um anticorpo anti-dímero-D), ou sondas oligonucleotídeo que se ligam especificamente a polinucleotídeos ST2, BNP e dímero-D (por exemplo, uma sonda específica de ST2, uma sonda específica de BNP, e uma sonda específica de dímero-D).

Os métodos também podem incluir determinar níveis de um ou mais biomarcadores adicionais, por exemplo, NT-proANP, proANP, ANP, troponina, CRP, creatinina, azoto ureico no sangue (BUN), enzimas de função hepática, albumina, e endotoxina bacteriana.

Em algumas formas de realização, determinar se o sujeito tem função renal comprometida inclui determinar uma taxa de filtração glomerular (TFG) e/ou nível de creatinina no soro. 0 sujeito tem função renal comprometida leve, moderada, ou severa se têm uma TFG ou nível de creatinina no soro como se mostra no Quadro 1:

Quadro 1.

Grau TFG (ml/minuto) Creatinina no soro (μπιοΐ/litro) ligeiro 20-50 150-300 Moderado 10-20 300-700 grave <10 > 700 5

Também proporcionados aqui são kits para diagnosticar doença cardiovascular (DCV), que incluem três anticorpos diferentes que se ligam especificamente a polipeptideos ST2, BNP, e dimero-D, respectivamente, ou três sondas de ácidos nucleicos diferentes que se ligam especificamente a ácidos nucleicos que codificam ST2, BNP, e dimero-D, respectivamente, e instruções para uso num método descrito aqui. "Regulado positivamente," tal como usado aqui, refere-se a expressão aumentada de um gene e/ou do seu polipeptideo codificado. "Expressão aumentada" refere-se a um aumento de (isto é, até um nível detectável) replicação, transcrição, e/ou tradução de IL-33, uma vez que a regulação positiva de qualquer um destes processos resulta num aumento da concentração/quantidade do polipeptideo codificado pelo gene. Por oposição, "regulação negativa," ou "expressão diminuída" tal como usado aqui, refere-se a uma redução de replicação, transcrição, e/ou tradução do gene IL-33 e/ou do seu polipepetídeo codificado. A regulação positiva ou regulação negativa da expressão génica pode ser directamente determinada detectando um aumento ou diminuição, respectivamente, no nível de mRNA para o gene, do nível de expressão proteica do polipeptideo codificado pelo gene, usando quaisquer meios adequados conhecidos pela arte, tais como métodos de hibridização com ácido nucleico ou de detecção de anticorpos, respectivamente, e em comparação com controlos. "Expressão," tal como usado aqui, refere-se à expressão de ácido nucleico e/ou polipeptideo.

Tal como usado aqui, um "sujeito" é um mamífero, por exemplo, um humano. Em todas as formas de realização, os ácidos nucleicos humanos, polipeptideos e sujeitos humanos podem ser usados.

Tal como usado aqui, uma "amostra biológica" inclui uma ou mais de sangue, soro, plasma, urina, e tecido 6 corporal. Em algumas formas de realização, uma amostra é uma amostra de soro ou sangue. A menos gue definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como frequentemente compreendidos por alguém com habilitação comum na arte a que esta invenção pertence. Métodos e materiais são descritos aqui para uso na presente invenção; outros métodos e materiais adequados conhecidos na arte, também podem ser usados. Os materiais, métodos, e exemplos são meramente ilustrativos e não se pretende que sejam limitantes. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá.

Outras características e vantagens da invenção serão aparentes a partir das seguintes descrição detalhada e figuras, e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma curva de características de operação do receptor (ROC) do segundo estudo de avaliação de sobrevivência esperada aleatorizado Amlodipina (PRAISE-2), ilustrando as características da população alvo de estudo para a idade, peso, altura, IMC, fracção de ejecção do ventrículo esquerdo (LVEF), creatinina, ST2tl, norepinefrina (NEtl), epinefrina (Etl), dopamina (DAtl), angiotensina (ANGtl), malondialdeído (MDAtl), adrenolutina (ADRtl), ANPtl, e BNPtl. "tl" refere-se a um nível tomado pela primeira vez. A Figura 2 é uma curva ROC para BNP e razão de ST2 no estudo PRAISE-2; as duas medidas têm AUC semelhante, com o BNP algo mais elevado. A Figura 3 é uma curva ROC para utilidade prognóstica de BNP e razão de ST2 em indivíduos com elevado IMC; neste caso, a razão de ST2 tem um AUC mais elevado. A Figura 4 é um gráfico de caixa dos níveis de ST2 em sujeitos com vários IMC's (< 25, 25-29, e h 30), mostrando ausência de diferenças significativas nos níveis de ST2 7 entre IMC's.

As Figuras 5A e 5B são gráficos de caixa que ilustram a taxa de filtração glomerular média (TFG, 5A) e os níveis de ST2 (5B) numa população de 133 sujeitos com insuficiência renal moderada a severa.

A Figura 6 é um gráfico de barras que ilustra a distribuição dos níveis de ST2 na população descrita no Exemplo 3, que mostra que a grande maioria dos sujeitos na população têm níveis de ST2 que são inferiores a 0,2 ng/ml. DESCRIÇÃO DETALHADA A avaliação clínica de doença cardiovascular (DCV) usando peptídeos natriuréticos (NP's) em sujeitos com índice de massa corporal (IMC) elevado ou função renal comprometida é complicada pelo facto destes sujeitos apresentarem níveis de peptídeos natriuréticos inferiores aos esperados em relação a um sujeito "normal" para o mesmo nível da doença. 0 mecanismo exacto para este fenómeno não é conhecido. Contudo, uma teoria, que não se pretende que seja limitante, é que os níveis mais baixos de NP em sujeitos obesos e com excesso de peso e naqueles com função renal comprometida podem estar relacionados com mecanismos de limpeza para NP's, que podem ter uma componente tanto renal como epitelial. ST2, apesar de possivelmente produzida da mesma maneira que os NP's, não sofre destas limitações. Desta forma, os métodos aqui descritos, incluem o uso de ST2 (e IL-33, o ligando para ST2) nestes sujeitos especiais, para quem os NP's podem proporcionar informação equivocada.

Metodologia geral

Os métodos gerais para usar os níveis de ST2 para diagnóstico estão descritos, por exemplo, no Formulário da Patente U.S. N° 2004/0048286 para Lee et al. . Os métodos aqui descritos são particularmente úteis em populações de sujeitos para quem os NP's são menos úteis no diagnóstico e prognóstico de DCV. Estes sujeitos incluem aqueles com elavado IMC, por exemplo, sujeitos com excesso de peso (IMC de 25-29) ou obesos (IMC ^ 30). Assim, em algumas formas de realização, os métodos incluem determinar o IMC de um sujeito, e se o sujeito tiver excesso de peso ou for obeso, seleccionar o paciente (por exemplo, seleccionar os sujeitos com base no seu IMC). Estes sujeitos podem também incluir aqueles com debilitação renal. Assim, em algumas formas de realização, os métodos incluem determinar se o sujeito tem função renal comprometida, e se o sujeito tem função renal comprometida, seleccionar o paciente.

Em geral, os métodos aqui descritos incluem níveis de ST2 numa amostra biológica (por exemplo, uma amostra de sangue, soro, plasma, urina, ou tecido corporal), e opcionalmente BNP e/ou dímero-D num sujeito por exemplo, um mamífero, por exemplo, um humano. Estes níveis proporcionam informação relativa à presença de DCV, por exemplo, IC e/ou EP num sujeito. Por exemplo, um diagnóstico de DCV, por exemplo, IC num sujeito com um nível de BNP ambíguo pode ser confirmado pela presença de níveis elevados de ST2 e níveis baixos de dímero-D. Um diagnóstico de DCV, por exemplo, EP num sujeito com níveis ambíguos de dímero-D pode ser confirmado pela presença de níveis altos de ST2 e baixos de BNP.

Avaliar níveis circulantes de ST2, BNP, ou dímero-D num sujeito inclui tipicamente uma amostra biológica obtida do sujeito por exemplo, soro ou sangue. Os níveis de ST2, BNP, e dímero-D na amostra podem ser determinados através da medição dos níveis de polipeptídeo na amostra, usando métodos conhecidos na arte e/ou descritos aqui, por exemplo, imunoensaios tais como ensaios imunosorventes ligados a enzimas (ELISA). Em alternativa, os níveis de mRNA de ST2, BNP, e dímero-D podem ser medidos, de novo usando métodos conhecidos na arte e/ou descritos aqui, por exemplo, através de PCR quantitativa ou análise de Northern blotting. 9

Um anticorpo que "se liga especificamente a" um antigeno, liga-se preferencialmente ao antigeno numa amostra que contém outras proteínas. 0 termo "anticorpo", tal como usado aqui, refere-se a uma molécula de imunoglobulina ou a uma porção imunologicamente activa da mesma, isto é, uma porção ligante ao antigeno. Exemplos de porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina incluem fragmentos F (anticorpo) e F(anticorpo') 2 que podem ser gerados através do tratamento do anticorpo com uma enzima como a pepsina. 0 anticorpo pode ser policlonal, monoclonal, recombinante, por exemplo, um anticorpo quimérico ou humanizado, totalmente humano, não-humano, por exemplo, murino, monoespecifico, ou de cadeia simples. Em algumas formas de realização tem efeito ou função e pode fixar complemento.

Uma "sonda" é um ácido nucleico que tem, pelo menos, 10, e menos de 200 (tipicamente menos do que aproximadamente 100 ou 50) pares de bases de comprimento. Uma sonda que "se liga especificamente a" um ácido nucleico alvo hibridiza com o alvo sob condições de elevado rigor. Tal como usado aqui, o termo "hibridiza sob condições de elevado rigor" descreve condições para hibridização e lavagem. Tal como usado aqui, condições de elevado rigor são 0,5M de fosfato de sódio, 7% SDS a 65°C, seguido de uma ou mais lavagens a 0,2X SSC, 1% SDS a 65°C. Métodos para realizar ensaios de hibridização com ácido nucleico são conhecidos por aqueles com habilitações na arte e podem ser encontrados em Ausubel et al., Eds., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. grupos A detecção pode ser facilitada através de acoplamento (por exemplo, colando fisicamente) do anticorpo ou sonda a uma substância detectável (por exemplo, etiquetagem do anticorpo). Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais 10 fluorescentes, material luminescente, materiais bioluminescentes, e materiais radioactivos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolnesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem streptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, dioclorotriazinilamina de fluoresceina, cloreto de dansil, pontos quânticos, ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aquorina, e exemplos de materiais radioactivos adequados incluem 1251, 1311, 35S ou 3H.

Os ensaios diagnósticos podem ser usados com matrizes biológicas tais como células vivas, extractos celulares, lisatos celulares, células fixas, culturas celulares, fluidos corporais, ou amostras forenses. Anticorpos conjugados úteis para fins diagnósticos ou de kit, incluem anticorpos acoplados a tintas, isótopos, enzimas, e metais, ver, por exemplo, Le Doussal et al., New Engl. J. Med. 146:169-175 (1991); Gibellini et al., J. Immunol. 160:3891-3898 (1998); Hsing e Bishop, New Engl. J. Med. 162:2804-2811 (1999); Everts et al., New Engl. J. Med. 168:883-889 (2002). Existem vários formatos de ensaios, tais como os radioimunoensaios (RIA), ELISA, e laboratório num chip (Patentes U.S. N°s 6.176.962 e 6.517.234). Técnicas conhecidas em bioquímica e biologia molecular podem ser usadas nos métodos aqui descritos (ver, por exemplo, Maniatis et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Sambrook e Russell, "Molecular Cloning", 3a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Wo, "Recombinant DNA", Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif (1993); e Ausbel 11 et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc, New York, N.Y. (2001)).

Assim que um nível de ST2 tenha sido determinado, o nível pode ser comparado com um nível de referência, ou directamente correlacionado com um valor conhecido para corresponder à presença ou ausência de DCV. Em algumas formas de realização, o nível de referência representará um nível limiar, acima do qual o sujeito tem DCV, por exemplo, SCA, EP, ou IC, e/ou tem uma determinada severidade de DCV, por exemplo, SCA, IC, ou EP, por exemplo, doença severa. O nível de referência escolhido pode depender da metodologia utilizada para medir os níveis de ST2. Por exemplo, em algumas formas de realização, em que os níveis circulantes de ST2 solúvel são determinados usando um imunoensaio, por exemplo, como descrito aqui, o nível de referência é aproximadamente 0,2 a 0,3 ng/ml, por exemplo, 0,20, 0,23, ou 0,29 ng/ml de soro, e um nível de ST2 acima desse nível de referência indica que o sujeito tem DCV, por exemplo, SCA, EP, ou IC, e/ou tem DCV severa, por exemplo, SCA, EP, ou IC severa; estes níveis de referência aplicam-se quando os níveis são determinados usando o método aqui descrito no Exemplo 1. Em algumas formas de realização, o nível de referência é um intervalo de níveis.

Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos incluem determinar níveis de IL-33 além de ST2. Em alguma modalidade, tanto os níveis de ST2 como de IL-33 são determinados, e a informação proveniente da comparação de ambos os biomarcadores com os seus níveis de referência respectivos proporciona informação cumulativa com respeito à presença de DCV, e/ou presença de DCV severa no sujeito. Em algumas formas de realização, a razão de ST2 para IL-33 pode ser determinada, e a razão comparada com uma razão referência que representa uma razão limiar acima da qual o sujeito tem DCV, e/ou tem DCV severa. Em alternativa ou adicionalmente, a presença e/ou níveis de complexos IL- 12 33/ST2 podem ser determinados e comparados com um nivel de referência para proporcionar informação com respeito à presença de DCV, por exemplo, SCA, EP, ou IC, num sujeito; por exemplo, níveis do complexo acima de um limiar seleccionado indicariam que o sujeito tem DCV, por exemplo, SCA, EP, ou IC.

Em algumas formas de realização, os métodos incluem o uso de métodos de diagnóstico adicionais. Quaisquer métodos de diagnóstico conhecidos na arte podem ser usados, e alguém habilitado na arte será capaz de seleccionar métodos diagnósticos que são apropriados para os sintomas do sujeito. Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos incluem outros métodos de diagnóstico além de, ou em alternativa à medição de outros biomarcadores, por exemplo, medições físicas da função pulmonar ou função cardíaca tal como conhecidos na arte.

Assim, os métodos aqui descritos também podem incluir a medição dos níveis de ST2, opcionalmente BNP e/ou dímero-D, e um ou mais biomarcadores adicionais, por exemplo, biomarcadores que ajudem ao diagnóstico do sujeito. Como um exemplo, para um sujeito que tem uma dor no peito ou dispneia, os biomarcadores indicadores de doença cardíaca ou cardiovascular podem ser medidos, por exemplo, troponina cardíaca (cTn), por exemplo, cTnl ou cTnT, NT-proBNP, proBNP, NT-proANP, proANP, e/ou ANP; em alternativa, ou além destes, podem ser medidos biomarcadores adicionais de doença pulmonar. Assim, em sujeitos que apresentem sintomas que incluem enfarte do miocárdio (EM) nos seus diagnósticos diferenciais, os métodos podem incluir a medição dos níveis de cTnl, para determinar se o sujeito está a ter um EM. Alguém habilitado na arte apreciará a existência de um número de métodos de diagnóstico adicionais que podem ser usados, dependendo da situação e da condição do sujeito.

Também incluídos aqui estão os kits que incluem um reagente para a detecção de polipeptídeos ou ácido nucleico 13 de ST2, BNP, e dímero-D, por exemplo, anticorpos (isto é, anticorpos que se ligam especificamente a um dos polipeptídeos de ST2, BNP, e dímero-D) , ou sondas de ácido nucleico (isto é, sondas que são complementares a todos ou parte de um dos ácidos nucleicos de ST2, BNP, e dímero-D) e instruções para uso num método aqui descrito.

Os métodos aqui descritos são úteis no diagnóstico de sujeitos com DCV, por exemplo, SCA, EP, ou IC. Nos métodos aqui descritos, se um sujeito com excesso de peso ou obeso (por exemplo, um sujeito com um IMC de 25-29, ou 30 ou superior) tem BNP ambíguo, por exemplo, baixo ou moderado, (isto é, < 500 pg/ml de soro) , níveis de dímero-D inferiores a 500 pg/L de plasma, e níveis elevados de ST2 (por exemplo, níveis acima de uma referência, por exemplo, 0,2 ng/ml de soro), então o sujeito pode ser diagnosticado com DCV, por exemplo, IC e tratado em conformidade, por exemplo, com intervenção cirúrgica ou farmacêutica, e/ou alteração do estilo de vida, apesar dos níveis de BNP baixos ou moderados.

Nos métodos aqui descritos, se um sujeito (por exemplo, um sujeito com um IMC de 25-29, ou 30 ou superior) tem baixo BNP (isto é, < 100 pg/ml de soro), níveis ambíguos de dímero-D, por exemplo, 500-4000 pg/L de plasma, e níveis elevados de ST2 (por exemplo, níveis acima de uma referência, por exemplo, 0,2 ng/ml de soro), então o sujeito pode ser diagnosticado com DCV, por exemplo, EP, e tratado em conformidade, por exemplo, com terapia anticoagulante, apesar dos seus níveis ambíguos de dímero-D. ST2/ Receptor tipo-1 da Interleucina 1 (ILlRLl) O gene ST2 é um membro da família de receptores da interleucina-1, cujo produto proteico existe tanto sob uma forma transmembranar, como sob a forma de um receptor solúvel que é detectável no soro (Kieser et al., FEBS Lett. 372(2-3): 189.93 (1995); Kumar et al., J. Biol. Chem. 14 270(46):27905-13 (1995); Yanagisawa et al., FEBS Lett. 302(1) :51-3 (1992) ; Kuroiwa et al. , Hybridoma 19(2) :151-9 (2000)). O ST2 foi recentemente descrito como sendo marcadamente regulado positivamente num modelo experimental de insuficiência cardíaca (Weinberg et al., Circulation 106(23):2961-6 (2002)), e os resultados preliminares sugerem que as concentrações de ST2 podem ser elevadas naqueles com IC crónica severa (Weinberg et al., Circulation 107(5):721.6 (2003)) bem como naqueles com enfarte do miocárdio (EM) agudo (Shimpo et al., Circulation 109 (18) :2186-90 (2004)) .

Pensa-se que a forma transmembranar de ST2 desempenha um papel na modulação das respostas das células T auxiliares tipo 2 (Lohning et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 95(12):6930-5 (1998); Schmitz et al., Immunity 23(5):479-90 (2005)), e podem desempenhar um papel no desenvolvimento da tolerância em estados de inflamação severa ou crónica (Brint et al., Nat. Immunol. 5 (4): 373-9 (2004)), enquanto que a forma solúvel de ST2 é regulada positivamente em fibroblastos de crescimento estimulado (Yanagisawa et al., 1992, supra). Dados experimentais sugerem que o gene ST2 é marcadamente regulado positivamente em estados de alongamento miocítico (Weinberg et al., 2002, supra) de uma maneira análoga à indução do gene BNP (Bruneau et al., Cardiovasc. Res. 28(10): 1519-25 (1994)).

Tominaga, FEBS Lett. 258:301-304 (1989), isolaram genes murinos que eram expressos especificamente por estimulação do crescimento em células BALB/c-3T3; designaram um destes genes como St2 (para Gene expresso por estimulação de crescimento 2). O gene St2 codifica dois produtos proteicos: ST2 (IL1RL1), que é uma forma solúvel excretada; e ST2L, um receptor transmembranar muito semelhante aos receptores da interleucina-1. O Comité de Nomenclatura HUGO designou o homólogo humano do ST2, cujo 15 clone foi descrito por Tominaga et al., Biochim. Biophys. Acta. 1171 :215-218 (1992), como Receptor-Tipo 1 da Interleucina 1 (IL1RL1) . Os dois termos são usados alternadamente aqui. A sequência de mRNA da isoforma solúvel mais curta de ST2 humano pode ser encontrada no GenBank Acc. N° NM_0 03 8 56.2, e a sequência polipeptídica está no GenBank Acc. N° NP_003 8 4 7.2; a sequência de mRNA para a forma mais longa de ST2 humano está no GenBank Acc. N° NM_016232.4; a sequência polipeptídica está no GenBank Acc. N° NP_05 7316.3. Informação adicional está disponível nas bases de dados públicas em GenelD: 9173, MIM ID #601203, e UniGene N° Hs.66. Em geral, nos métodos aqui descritos é medida a forma solúvel do polipeptídeo de ST2. Métodos para detectar e medir ST2 são conhecidos na arte, por exemplo, como descrito nas publicações das Patentes U.S. N° 2003/0124624, 2004/0048286 e 2005/0130136. Os kits para medir o polipeptídeo ST2 estão também disponíveis comercialmente, por exemplo, o kit ELISA ST2 fabricado pelos Laboratórios Medicai & Biological Co., Ltd. (MBL International Corp., Woburn, MA), n° 7638. Além disso, os dispositivos para medir ST2 e outros biomarcadores estão descritos na publicação da Patente U.S. N° 2005/0250156.

Em algumas formas de realização, o nível de ST2 é determinado uma vez, por exemplo, na apresentação. Em algumas formas de realização, o nível de ST2 é determinado em uma ou mais de 2, 4, 6, 8, 12, 18, e/ou 24 horas, e/ou 1-7 dias após o despoletar dos sintomas.

Em algumas formas de realização, o nível de ST2 é determinado mais do que uma vez; nesse caso, a medição mais alta pode ser usada. Em formas de realização em que o nível de ST2 é determinado mais do que uma vez, o nível mais elevado pode ser usado, ou a alteração nos níveis pode ser usada. Níveis de ST2 também podem ser determinados várias vezes para avaliar a resposta de um sujeito a um 16 tratamento. Por exemplo, um nível de ST2 tomado após administração de um tratamento, por exemplo, uma ou mais doses ou rondas de um tratamento, pode ser comparado com níveis de ST2 antes do tratamento ter sido iniciado, por exemplo, um nível padrão. A alteração nos níveis de ST2 indicaria se o tratamento foi eficaz; por exemplo, uma redução dos níveis de ST2 indicaria que o tratamento foi eficaz.

Em algumas formas de realização, os métodos incluem determinar a identidade da sequência nucleotídica em RefSNP ID: rsl041973 .

Interleucina-33 (IL-33)

Nos métodos aqui descritos, IL-33 pode ser medida além de ST2. IL-33 foi recentemente identificada como o ligando para ST2, e foi descrita a presença de níveis aumentados de IL-33 em vários distúrbios inflamatórios (ver Schmitz et. al., Immunity 23 (5):479-90 (2005); Publicação da Patente U.S. N° 2005/0203046). A razão de ST2 para IL-33 também pode ser determinada. A proteína IL-33 é expressa como uma molécula inactiva, pre-IL-33, que é activada após clivagem pela Caspase I resultando no peptídeo IL-33 activo bem como no produto peptídeo da clivagem, pro-IL-33, Assim, os métodos aqui descritos podem incluir medir um, dois, ou todos os três dos IL-33, pre-IL-33, e/ou pro-IL-33 maduros, estando todos incluídos no termo "IL-33." A sequência do ácido nucleico de IL-33 pode ser encontrada no GenBank Acc. N° NM_033439.2, e a sequência polipeptídica está no GenBank Acc. N° NP_254274.1. Informação adicional está disponível em bases de dados públicas em GenelD: 90865, MIM ID #*608678, e UniGene N° Hs.348390. IL-33 é também conhecido como estrutura de leitura aberta 26 do cromossoma 9 (C90RF26); factor nuclear das vénulas endoteliais altas (NFHEV); e interleucina 33, 17 ver também Backkevold et al., Am. J. Path. 163: 69-79 (2003) .

Os métodos para medir níveis de polipeptídeo e ácido nucleico IL-33 são conhecidos na arte, ver, por exemplo, Schmitz et al., Immunity 23(5):479-90 (2005); Publicação da Patente U.S. N° 2005/0203046. índice de massa corporal (IMC) A obesidade influencia a expressão de BNP em IC crónica. Sabe-se que existe uma relação inversa significativa entre o índice de massa corporal (IMC) e os níveis de BNP. O IMC é determinado pelo peso relativo à altura, e é igual ao peso de uma pessoa em quilogramas dividido pela altura em metros quadrados (IMC = kg/m2) . Interpretações aceites são dadas no Quadro 2.

Quadro 2. Categoria IMC Abaixo do peso < 18,5 Peso normal 18,5 - 24, 9 Excesso de peso 25 - 29,9 Obeso > 30

Assim, os métodos aqui descritos podem incluir determinar a altura de um sujeito, determinar o peso de um sujeito, e calcular o IMC a partir dos valores assim determinados. Em alternativa, os métodos aqui descritos podem incluir a revisão do historial médico de um sujeito para determinar o seu IMC.

Em algumas formas de realização, os métodos aqui descritos incluem a selecção de sujeitos que têm um IMC de 30 ou superior (isto é, sujeitos obesos).

Função renal

Medidas da função renal podem incluir resultados de creatinina no soro bem como da taxa de filtração glomerular (TFG) estimada (ver, por exemplo, Levey et al., Ann. Intern. Med. 130(6):461-70 (1999)). A debilitação renal é 18 normalmente dividida em três graus, apresentados no Quadro 3,

Quadro 3.

Grau TFG (ml/minuto) Creatinina no Soro (pmol/litro) ligeiro 20-50 150-300 moderado 10-20 300-700 grave < 10 > 700

Assim, os métodos aqui descritos podem incluir a determinação dos níveis de creatinina no soro e/ou TFG. Em alternativa, os métodos aqui descritos podem incluir a revisão do historial médico de um sujeito para determinar os níveis de creatinina no soro e/ou TFG.

BNP 0 peptideo natriurético de tipo B (BNP) é um marcador de insuficiência cardíaca. Níveis de BNP podem ser determinados, por exemplo, em todo o sangue ou soro usando metodologia padrão. Por exemplo, um número de kits de ensaio estão comercialmente disponíveis, por exemplo, o Teste de Triagem BNP (Biosite, inc., San Diego, CA), um ensaio ponto-de-atenção com todo o sangue ou plasma e produz resultados em aproximadamente 15 minutos; um imunoensaio quemiluminescente de tipo sandwich (Bayer Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY) para BNP que é nm nas plataformas ADVIA Centaur e SCA:180; um imunoensaio baseado em micropartículas (Laboratórios Abbott, Abbott Park, 1L) para BNP que é corrido numa plataforma AxSYM; e um ensaio imunoenzimático quemiluminescente (Biosite, Inc., San Diego, CA) para BNP que é corrido nas seguintes plataformas Beckman Coulter: Access, Access 2, Synchron LXI e a UniCel DXI. Um ensaio electroquemiluminescente (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) disponível para medir NT-proBNp.

Os intervalos de referência para BNP e NTproBNP variam 19 em função de um número de factores. Os seguintes intervalos são para uso quando os niveis de BNP são medidos usando um método tipo ELISA, e alguém habilitado na arte será capaz de determinar que niveis obtidos usando outros métodos são equivalentes. Se o nivel de BNP é >500 pg/mL, a IC é altamente provável. Niveis de BNP de 100-500 pg/mL são com frequência descritos como "zona cinzenta" na qual o diagnóstico é menos seguro. Em sujeitos magros, se o BNP é < 100 pg/mL, então a IC é improvável, contudo, a obesidade influencia a expressão de BNP na IC crónica (Mehra et al., J Am Cell Cardiol. 43(9):1590-1595 (2004)), por isso os niveis < 100 pg/mL não excluem a possibilidade de insuficiência cardiaca em sujeitos obesos (Sliver et al., Cong. Heart Fail. 10(5 suppl. 3):1-30 (2004)).

Dímeros-D

Um dimero-D é um produto final adequado da degradação da fibrina. Níveis aumentados de dimeros-D no sangue estão associados com formação acentuada de fibrina e fibrinólise, e são, assim, diagnósticos das condições associadas com estes processos.

Métodos para avaliar os níveis de dímero-D no sangue são conhecidos na arte. Kits de ensaios comercialmente disponíveis incluem a Exclusão dímero-D com VIDAS (bioMérieux, Durham, NC) um ELISA rápido, automatizado; Minutex® dimero-D, Biopool Auto-Dimer™ (um ensaio imunoturbidimétrico automatizado para leituras de análises a comprimentos de onda de 540 - 880 nm) , MiniQuant™, AMAX Auto dimero-D™ (ensaio dímero-D automatizado para instrumentos AMAX), e ensaios Accuclot dímero-D™ (um ensaio semiquantitativo) (Trinity Biotech, Bray, Co. Wicklow, Irlanda); e o ensaio HemosIL™ dimero-D (Laboratório Instrumentation, distribuído por Beckman Coulter), um ensaio imunoturbidimétrico inteiramente automatizado.

Os niveis de dimero-D no plasma acima de 4000 pg/L estão altamente correlacionados com a presença de EP aguda, 20 e níveis abaixo de 500 podem ser usados para excluir EP (ver, por exemplo, Perrier et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 156(2):492-496 (1997)). Níveis de dímero-D no plasma de 500-4000 pg/L são mais ambíguos, devido ao número de condições que activam a coagulação e processos fibrinolíticos.

Outros biomarcadores

Os métodos aqui descritos podem também incluir a medição de níveis de outros biomarcadores além de ST2 e/ou IL-33. Biomarcadores adequados incluem NT-proBNP, proBNP, BNP, NT-proANP, proANP, ANP, troponina, CRP, creatinina, dímeros-D (produtos da degradação de fribrina de ligação cruzada, cujo nível se torna elevado após formação de coágulo), BUN (azoto ureico no sangue), enzimas de função hepática, albumina, IL-6 e/ou endotoxina bacteriana. Métodos para medir estes biomarcadores são conhecidos na arte, ver, por exemplo, Publicação da Patente U.S. N° 2004/0048286 e 2005/0130136 para Lee et al.; Dhalla et al., Mol. Cell Biochem. 87: 85-92 (1989); Moe et al., Am. Heart J, 139-587-95 (2000). As enzimas de função hepática incluem alanina transaminase (ALT); aspartato transaminase (AST) fosfatase alcalina (ALP) e bilirrubina total (TBIL).

Nestas formas de realização, os níveis de ST2 e um ou mais biomarcadores adicionais são determinados, e a informação proveniente da comparação dos biomarcadores com os seus níveis de referência respectivos proporciona informação adicional com respeito à presença de DCV no sujeito, e/ou do nível de severidade da DCV no sujeito. EXEMPLOS A invenção é, ainda, descrita nos seguintes exemplos, que não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.

Exemplo 1: Ensaio ELISA tipo Sandwich

Este exemplo usa o Kit ELISA ST2 fabricado pelos Laboratórios Medicai & Biological Co., Ltd. (MBL 21

International Corp., Woburn, MA), n° 7638. Este kit é um ensaio ELISA tipo sandwich que utiliza anticorpos monoclonais tanto para a captura como para a detecção. Pretende-se que este procedimento analise uma placa completa de amostras replicadas ensaiadas com um factor de diluição de 1:3 e segue rigorosamente o protocolo do fabricante. Os kits devem ser armazenados a 4°C até serem usados. 0 procedimento descrito neste exemplo é optimizado para soro ou plasma humano recolhido em tubos anti-coagulantes de EDTA ou citrato. 0 plasma recolhido em tubos anti-coagulantes de heparina não deve ser usado neste ensaio uma vez que a heparina se liga com ST2 e inibe a medição por este protocolo ELISA. As amostras de plasma ou soro podem ser usadas frescas ou congeladas armazenadas. Este ensaio não é adversamente afectado por até 3 ciclos de congelação-descongelação das amostras de plasma.

Os reagentes devem ser preparados frescos a partir de um kit novo imediatamente antes de realizar os ensaios. Permitir que o kit equilibre com a temperatura ambiente antes do seu uso. Os reagentes não discutidos explicitamente a seguir são providenciados pelo fabricante prontos a usar. 1. Solução de lavagem - a solução de lavagem é providenciada pelo fabricante como uma solução concentrada 10X. Para fazer 1 litro de solução de lavagem diluir 100 ml do concentrado 10X providenciado com 900 ml de água destilada. 2. Solução detectora - a solução detectora é preparada diluindo o concentrado do detector 1:101 com o diluente do detector. Para uma placa completa de 96 poços de amostra são necessários 10 ml de solução detectora. Para preparar 10 ml de solução detectora usar uma pipeta para transferir 10 ml do diluente do detector corado de azul para um tubo com tampa laranja de 15 ml de polipropileno. Adicionar 100 PI do concentrado do detector para este volume de diluente 22 do detector. a. NOTA: este reagente deve ser preparado durante o primeiro passo de incubação do ensaio. 3. Estoque calibrador - reconstituir a proteína calibradora dissolvendo a proteína liofilizada na quantidade de água destilada definida pelo fabricante para este lote de fabrico para produzir uma solução de estoque de 8 ng/ml. Esta especificação de volume está incluída na inserção do produto.

Preparação de padrões e amostras: • Todos os seguintes devem ser preparados em tubos rotulados de 1,5 ml de polipropileno para serem transferidos para a placa do ensaio com a pipeta P200. Padrões: A curva padrão é preparada fazendo diluições em série 2 vezes da solução-mãe 8 ng/ml. 1. Usando uma pipeta P1000 transferir 250 PI de diluente de ensaio para 8 tubos de 1,5 ml de polipropileno rotulados S1-S8 2. Usando a mesma pipeta P1000 transferir 250 PI da solução calibradora de estoque 8 ng/ml para o tubo Sl. Este tubo é agora proteína calibradora 4 ng/ml. a. Misturar completamente pipetando gentilmente 3 vezes, sendo cuidadoso para não criar bolhas de ar. 3. Usando a mesma pipeta P1000 e uma ponta limpa para cada uma das seguintes transferências do reagente 250 PI do tubo Sl ao tubo S2, repetir a mistura. 4. Repetir passo 3 para S2 para S3, S3 para S4, S4 para S5, S5 para S6 e S6 para S7, S8 será o branco pelo que não transferir a proteína calibradora para este poço. a. Os tubos S1-S6 e S8 terão agora 250 PI de reagente e o tubo S7 terá 450 Pl.

Amostras A placa é montada de maneira a que cada amostra é analisada como uma diluição 1:3 em duplicado. Uma montagem 23 ilustrativa é apresentada em baixo no Quadro 4. 1. Rotular um tubo de 1,5 ml de polipropileno para cada amostra. 2. Usando uma pipeta de P200 transferir 160 PI do diluente de ensaio para cada tubo. 3. Usando uma pipeta de P200 transferir 80 PI ou soro ou plasma da amostra 1 para o tubo 1. Misturar cuidadosamente pipetando 3 vezes sem fazer bolhas de ar. 4. Continuar a transferência das amostras para os tubos de amostra repetindo o passo 2 para cada amostra.

Procedimento: 1. Usar a pipeta de P200 para transferir os padrões e o alinhamento das amostras rapidamente para a placa de ensaio com 96 poços.

a. Colocar a pipeta de P200 em 100 PI b. Transferir 100 PI das diluições da curva padrão para cada uma das colunas 1 & 2 da placa de ensaio c. Transferir 100 PI de cada uma das amostras de soro para a placa de ensaio exactamente nas mesmas posições como se mostra no mapa da placa abaixo. 2. Cobrir a placa de ensaio com o escudo providenciado e incubar à temperatura ambiente durante 60 minutos. 3. Usando a auto-lavagem da placa lave as placas 4 vezes. 4. Detector: usando a pipeta multicanal de 8 canais transferir 100 μΐ da solução de detecção para cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 60 minutos. a. NOTA: este reagente deveria ser preparado durante o primeiro passo da incubação. b. NOTA: usar um recipiente descartável de reagente para esta adição de reagente. Usar SEMPRE um recipiente limpo descartável do reagente para cada reagente. Não é necessário mudar as pontas da pipeta durante este passo. 5. Lavar a placa do passo 3 6. Substrato: usando a pipeta multicanal de 8 canais transferir 100 PI do substrato para cada poço e incubar à 24 temperatura ambiente durante 30 minutos. a. O reagente do substrato é providenciado pronto a usar pelo fabricante. 7. Paragem: quando a incubação do substrato estiver finalizada usando a pipeta multicanal de 8 canais transferir 100 Pl de solução de paragem a cada poço. a. O reagente da solução de paragem é providenciado pronto a usar pelo fabricante. 8. Ler a placa a 450 mn com correcção de fundo a 620 nm. a. A placa deve ser lida até 30 minutos após a paragem da reacção. 9. Inserir as leituras de absorvância na folha de cálculo providenciada para a análise.

Quadro 4: Mapa da Placa de Ensaio de 96 poços ilustrativa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 40 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 B 2,0 2 2 10 10 18 18 26 26 34 34 C 1,0 3 3 11 11 19 19 27 27 35 35 D 0,5 4 4 12 12 20 20 28 28 36 36 E 0,25 5 5 13 13 21 21 29 29 37 37 F 0, 125 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 6 0,0625 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 Tubo H 0,0 8 8 16 16 24 24 32 32 40 40

Exemplo 2 : PRAISE-2 O segundo estudo de avaliação de sobrevivência esperada aleatorizado Amlodipina (PRAISE-2) foi um ensaio aleatório, duplo-cego, prospectivamente designado para identificar prognosticadores ecocardiográficos de sobrevivência em pacientes com cardiomiopatia não-isquémica e insuficiência cardíaca e para determinar se componentes da ecocardiografia e informação prognóstica para informação padrão demográfica e clínica (Cabell et al., Am. Heart J. 147(1):151-7 (2004)). Uma centena de pacientes participou 25 no estudo ecocardiográfico PRAISE-2; destes, 93 tinham exames outonais ecocardiográficos interpretáveis. As amostras de soro foram recolhidas no padrão e às 2 semanas, e os níveis de IL1LR1 foram determinados como descrito no Exemplo 1. A análise da curva das características de operação do receptor (ROC) foi feita usando o software Analyse-It (Analyse-It, Ltd, Leeds. UK) . A curva ROC é apresentada na Figura 1, e a informação da AUC (área debaixo da curva) para os mesmos parâmetros mostrada na Figura 1 é dada a seguir no Quadro 5. A análise ROC providencia um sumário de todos os marcadores que foram avaliados para valor prognóstico ao padrão (II). Uma AUC indicaria um resultado neutro; qualquer resultado acima de 0,5 indica um aumento na precisão da previsão baseada nessa medição, enquanto que um resultado abaixo de 0,5 indica uma perda de precisão (isto é, a variabilidade desse marcador é alta), e nenhuma correlação com o parâmetro medido.

Quadro 5: Resultados de ROC do PRAISE

Variável AUC Idade 5, 620 C, C2 7 Altura 0,562 0, 250 Peso 0,425 0, 168 SMI 0,391 0, 043 LVEF 0, 421 0, 146 Creatinina 0,599 0, 066 ST2t 1 0,611 0, 040 NEt 1 0,632 0, 015 Btl 0,456 0, 941 DAt 1 0,637 0, 012 ANGtl 0, 471 0,587 MDAtl 0,541 0, 451 ADRtl 0,504 0, 934 26 ANPtl 0,811 0, 000 BNPtl 0, 779 0, 000 0 valor de ST2 para previsão do ponto final foi comparada com outros marcadores em três grupos de IMC. Os resultados, mostrados no Quadro 6, a seguir, indicam gue para pacientes com elevado IMC, o ST2 (por exemplo, a razão de ST2) é um prognosticador mais potente do que o BNP. Os números negativos no grupo de peso médio para ST2 podem ser devidos à presença de níveis anómalos em alguns sujeitos.

Quadro 6: Previsão do ponto final do PRAISE em 3 grupos de

IMC

Grupo IMC Prognosticador R Erro- padrão Significância Inferior a 25 Log BVP no tempo 0 2, 472 1,301 0, 058 Idade 0, 032 0, 032 0,319 Sexo 0,274 0,986 0, 781 Razão de ST2 3, 094 1,957 0, 121 25 a 30: Log BNP no tempo 0 4, 031 1,467 0, 005 Idade 0, 043 0,037 0,258 Sexo 0,516 0,960 0,591 Razão de ST2 0, 764 1,643 0,642 30 final Log ENP no tempo 0 1,283 0,966 0, 184 Idade 0, 008 0, 039 0, 844 Sexo 2, 128 1, 056 0, 044 Razão de ST2 6, 531 2,539 0, 010 A ROC do UPRAISE para BNP e a razão de ST2 também foi calculada. Os resultados, apresentados na Figura 2 e Quadro 27 7, indicam que a razão de ST2 é comparável com BNP ao longo de toda a população PRAISE, que incluiu tanto sujeitos sem excesso de peso e sujeitos não obesos, como sujeitos nos quais a IC estava estabilizada; os níveis de ST2 tendem a voltar à linha padrão quando a IC é estabilizada.

Quadro 7: ROC para BNP e Razão ST2

Prognosticador AUC Erro-padrão P Inferior Superior BNPtl 0, 783 0,043 0, 000 0, 698 0, 868 Razão de ST2 0, 660 0,054 0, 004 0, 555 0, 766 A utilidade prognóstica de BNP e da razão de ST2 foi calculada para aqueles indivíduos com elevado IMC; os resultados, apresentados no Quadro 8 e Figura 3, demonstram que a razão de ST2 é um prognosticador melhor do que o BOP no grupo com elevado IMC, com uma AUC maior e uma correlação melhor,

Quadro 8: Utilidade Prognóstica de BNP e Razão de ST2 em indivíc luos com elevados IMC Grupo IMC Prognosticador AUC BE Inferior Superior Inferior a 25 Linha padrão de BNP 0, 788 0,077 0, 002 0,637 0, 939 Razão de ST2 0, 7F7 0, 082 0, 022 0,555 0,878 25 - 35 Linha padrão de BNP 0,864 0, 055 0, 000 0, 756 0,972 Razão de ST2 0,521 0, 097 0, 829 0,330 0, 711 30 e superior Linha padrão de BNP 0,669 0, 100 0, 103 0,473 0,865 Razão de ST2 0, 772 0, 083 0, 003 0,609 0,534

Estes resultados indicam que o ST2 é preditivo do resultado num paciente com insuficiência cardíaca compensada quando usado como uma alteração ao longo do tempo, e providencia resolução prognóstica adicional em pacientes com elevado IMC.

Exemplo 3: ST2 não é afectado pelo IMC 28 600 sujeitos sem fôlego foram incorporados no estudo PRIDE para analisar a utilidade do NT-proBNP para diagnóstico e prognóstico de insuficiência cardíaca aguda (IC) . No momento da incorporação, uma amostra cega de sangue foi obtida, repousada e congelada a -80°C. Para a análise de ST2, uma aliquota de sangue citrado foi descongelada (segundo ciclo de congelação-descongelação) e analisada para concentração de proteína ST2. O efeito do IMC nos níveis de ST2 foram analisados.

Os resultados são apresentados na Figura 4 e Quadro 9. Os valores medianos de ST2 foram os mesmos ao longo dos três grupos IMC e o IQR foi também praticamente idêntico.

Quadro 9: IMC e níveis de ST2 IMC ST2 (mediana, ng/ml) Intervalo interquartil (ng/ml) < 25 n=77) 0,56 0,31-1,39 25-29,9 (n=65) 0,49 0,23-1,13 > 30 (n=66) 0, 48 0,23-1,04

Estes resultados revelam que, ao contrário do BNP, os níveis de ST2 não são afectados pelo IMC.

Exemplo 4. As concentrações de ST2 não são afectadas pela debilitação renal O efeito da debilitação renal nas concentrações de ST2 foi avaliado numa população de 135 pacientes com insuficiência renal leve a severa. Nenhum dos pacientes fazia diálise e a nenhum tinha sido previamente diagnosticada DCV. Todos os pacientes foram avaliados usando a taxa de filtração glomerular (TFG em mls/min) como determinado pelo método de Modificação da Dieta em Doença Renal (MDRD) como uma medida da função renal. Foram também efectuadas medições de cálcio na artéria coronária (CAC) e ecocardiografias em cada sujeito para detectar DCV latente. Também foram avaliados biomarcadores múltiplos. 29 A estatística descritiva para esta cohorte apresenta-se no Quadro 10; a TFG média e ST2 estão ilustradas graficamente nas Figuras 5A e 5B. 30

Quadro 10: Taxa de Filtração Glomerular (TFG) e níveis de ST2 TFG Níveis de ST2 (ng/ml) Média 34,5 0,122 Mediana 34 0,107 Erro-padrão 0, 989 0, 005 De svio-padrão 11, 4 0, 059 Coeficiente de variação 33,3 48,346 Limite de confiança inferior a 95% 32,5 0, 112 Limite de confiança superior a 95% 36,4 0,132 Percentil 25 27 0,090 Percentil 75 43 0,127 Mínimo 9 0,068 Máximo 59 0,476 Contagem (N) 135 135

Nesta cohorte de pacientes com doença crónica, estável apenas dez (8%) tinham níveis de ST2 acima dos 0,2, o mais alto dos quais foi 0,476 ng/ml. Esta distribuição de valores de ST2 apresenta-se na Figura 6. Esta foi como esperado nesta população de folhas com insuficiência renal crónica administrada; não se esperaria ver níveis de ST2 muito elevados. A análise de correlação de Pearson foi realizada nesta população para determinar se existia uma correlação entre os níveis de ST2 e a função renal, tal como medida tanto pela TFG ou limpeza de creatinina. Os resultados apresentam-se nos Quadros 11 e 12. 31

Quadro 11: Resultados da Correlação de Pearson - TFG e ST2

Estatística descritiva Variável Média De svio-padrão Erro-padrão N TFG 34,5 11,5 0, 989 135 ST2 (ng/mL) 0,122 0, 059 0, 005 135 Matriz de Correlação(R) TFG ST2 (ng/mL) TFG 1,000 0, 028 ST2 (ng/mL) 0,028 1, 000 Significância da Correlação (P) TFG ST2 (ng/mL) TFG — 0, 748 ST2 (ng/mL) 0, 748 -

Quadro 12: Resultados da Correlação de Pearson - Limpeza de

Creatinina e ST2

Estatística Descritiva Variável Média Desvio-padrão Erro-padrão N Classificação Cr 2, 175 0,859 0,081 113 ST2 (ng/mL) 0, 122 0, 058 0,006 113 Matriz de Correlação(R) Classificação Cr ST2 (ng/mL) Classificação Cr 1, 000 -0,018 ST2 (ng/mL) -0,018 1,000 Significância da Correlação(P) Classificação Cr ST2 (ng/mL) Classificação Cr — 0, 851 ST2 (ng/mL) 0, 851 — 32

Estes resultados demonstram que, tal como esperado nesta população de objectos com insuficiência renal crónica administrada, não existe uma correlação entre os niveis de ST2 e a TFG (p = 0,75) nem a limpeza de creatinina (p = 0,851) nesta população. Isto indica que a insuficiência renal, por si só, não provoca um aumento dos niveis de ST2.

Realizaram-se as mesmas análises numa população de 139 sujeitos no Hospital Administrativo Veterano de San Diego. Todos os sujeitos tinham sido previamente diagnosticados com insuficiência cardíaca aguda descompensada (ADHF), e o nível médio de ST2 era aproximadamente o dobro do observado na população de pacientes com insuficiência renal crónica mas sem IC (ver Quadros 11-12).

Existe uma correlação quase ubíqua entre a insuficiência renal e a insuficiência cardíaca, com quase 80% de confluência de pacientes com IC em estado III/IV apresentando também função renal comprometida (Fonarow e Heywood, Am. J. Med. (2006) 119(12A):S17-S2S. Assim, porque a ADHF está correlacionada com os níveis de ST2, esperar-se-ia observar uma correlação entre a insuficiência renal (tal como medida pela TFG) e os níveis de ST2. Isto foi exactamente o que foi observado, tal como apresentado nos Quadros 13 e 14.

Quadro 13: Resultados da Correlação de Pearson - TFG e ST2 em ADHF

Estatística Descritiva Variável Média De svio-padrão Erro-padrão N CFR 59,1 25,3 2, 143 139 ST2 (ng/mL) 0,283 0,332 0, 028 139 Matriz de Correlação(R) TFG ST2 (ng/mL) TFG 1,000 -0,062 ST2 (ng/mL) -0,062 1, 000 33

Significância da Correlação(P) TFG ST2 (ng/mL) TFG — 0,470 ST2 (ng/mL) 0,470 -

Quadro 14: Resultados da Correlação de Pearson - TFG e

Razão de ST2 em ADHF

Estatística Descritiva Variável Média De svio-padrão Erro-padrão N TFG 59,1 25,3 2, 143 139 Razão ST2 1,038 3, 038 0, 258 139 Matriz de Correlação(R) TFG Razão ST2 TFG 1,000 -0,161 Razão ST2 -0,161 1, 000 Significância da Correlação(P) TFG Razão ST2 TFG - 0, 058 Razão ST2 0,058 -

Estes resultados demonstram que, em sujeitos com ADHF, os valores de ST2, seja representados como um único nível ou como uma razão, estão correlacionados com medidas de insuficiência renal, mas são independentes da insuficiência renal; assim, não existe uma relação causal entre os dois. Em vez disso, ambas variáveis estão relacionadas com e interagem independentemente com um terceiro parâmetro (neste caso, insuficiência cardíaca).

OUTRAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

Deve ser entendido que enquanto a invenção foi descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a 34 descrição antecedente pretende-se que ilustre, e não limite, o âmbito da invenção, que é definido pelo âmbito das reivindicações anexas. 35

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição •US 20040048286 A, Lee [0019] [0038] [0058] • US 6176962 B [0025] • US 6517234 B [0025] • US 20030124624 A [0038] • US 20050130136 A [0038] [0058] • US 20050250156 A [0038] • US 20050203046 A [0043] [0046]

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Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método in vitro para diagnosticar doença cardiovascular (DCV) num sujeito que tem uma ou duas das caracteristicas seguintes: (i) um índice de massa corporal (IMC) igual ou superior a 25, ou (ii) compromisso da função renal, o método compreendendo: um ou ambos de: (A) determinar o IMC do sujeito, e se o IMC do sujeito é igual ou superior a 25, seleccionar o sujeito; ou (B) avaliar a função renal do sujeito, e se o sujeito tiver a função renal comprometida, seleccionar o sujeito; e determinar níveis de péptido natriurético tipo-B (BNP), dímero-D, e receptor tipo 1 da interleucina 1 (ST2) numa amostra biológica do sujeito; em que o nível de BNP do sujeito, nível de dímero-D, e nível de ST2 indicam se o sujeito tem DCV. 2. 0 método da reivindicação 1, em que a DCV é insuficiência cardíaca (IC) ou embolismo pulmonar (EP). 3. 0 método da reivindicação 1, em que o nível de BNP, nível de dímero-D, e nível de ST2 são detectados numa amostra biológica compreendendo sangue, plasma, ou soro. 4. 0 método da reivindicação 1, em que se o nível de BNP do sujeito é inferior a 500 pg/mL, e o nível de dímero-D é inferior a 500 yg/L, então a relação do nível de ST2 para um nível de referência de ST2 indica se o sujeito tem IC.

5. O método da reivindicação 1, em que se o nível de BNP do sujeito é inferior a 100 pg/mL, e o nível de dímero-D é 500-4000 yg/L, então a relação do nível de ST2 para um nível de referência de ST2 indica se o sujeito tem EP. 2 6. 0 método da reivindicação 4, em que o nivel de referência de ST2 representa um nivel num sujeito que não tem IC. 7. 0 método da reivindicação 4, em que o nivel de referência de ST2 é aproximadamente 0,2 a 0,3 ng/ml de soro, e valores acima desse nivel indicam a presença de IC. 8. 0 método da reivindicação 5, em que 0 nível de referência de ST2 representa um nivel num sujeito que não tem EP. 9. 0 método da reivindicação 5, em que o nível de referência de ST2 é aproximadamente 0,2 a 0,3 ng/ml de soro, e valores acima desse nível indicam a presença de EP.

10. O método da reivindicação 1, em que o nível de BNP do sujeito é 100-500 pg/mL.

11. O método da reivindicação 1, compreendendo ainda a determinação de um nível num sujeito de um ou mais outros biomarcadores.

12. O método da reivindicação 11, em que os outros biomarcadores são seleccionados a partir do grupo que consiste em NT-proANP, ANP, troponina, CRP, creatinina, azoto ureico no sangue (BUN), enzimas da função hepática, albumina, e endotoxina bacteriana.

13. O método da reivindicação 1, em que determinar se um sujeito tem função renal comprometida compreende determinar a taxa de filtração glomerular (TFG) e/ou o nível de creatinina no soro, e o sujeito tem função renal comprometida se tiverem a TFG ou o nivel de creatinina no soro apresentados no quadro seguinte: 3 Grau TFG (ml/minuto) Creatinina no soro(pmol/litro) ligeiro 20-50 150-300 moderado 10-20 300-700 grave < 10 > 700 14. 0 método da reivindicação 1, em que um sujeito tem função renal comprometida se tem uma TFG de menos de 50 ml/minuto.

15. O método da reivindicação 1, em que o sujeito tem um IMC superior ou igual a 30.

16. O método da reivindicação 1, em que o sujeito tem um IMC de 25 a 29.

17. Um método in vitro para diagnosticar doença cardiovascular (DCV) num sujeito que tem a função renal comprometida, o método compreendendo: avaliar a função renal do sujeito, e se o sujeito tiver a função renal comprometida, seleccionar o sujeito; e determinar um nível de ST2 numa amostra biológica do sujeito; em que a relação do nível de ST2 para um nível de referência de ST2 indica se o sujeito tem DCV.

18. O método da reivindicação 17, em que o nível de referência de ST2 representa um nível num sujeito que não tem DCV.

19. O método da reivindicação 17, em que o nível de referência de ST2 é de aproximadamente 0,2 a 0,3 ng/ml de soro, e valores acima desse nível indicam a presença de DCV. 4

20. O método da reivindicação 17, em que a DCV é uma insuficiência cardíaca (IC) ou embolismo pulmonar (EP).

21. O método da reivindicação 17, em que a amostra biológica compreende sangue, plasma, ou soro.

22. O método da reivindicação 17, compreendendo ainda a determinação de um nível num sujeito de um ou mais outros biomarcadores.

23. O método da reivindicação 22, em que os outros biomarcadores são seleccionados a partir do grupo que consiste em BNP, dímero-D, NT-proANP, ANP, troponina, CRP, creatinina, azoto ureico no sangue (BUN), enzimas da função hepática, albumina, e endotoxina bacteriana. 24. 0 método da reivindicação 17, em que determinar se o Grau TFG (ml/minuto) Creatinina no soro(pmol/litro) Ligeiro 20-50 150-300 Moderado 10-20 300-700 Grave < 10 > 700 sujeito tem a função renal comprometida compreende determinar a taxa de filtração glomerular (TFG) e/ou o nível de creatinina no soro, e o sujeito tem a função renal comprometida se tiver uma TFG ou um nível de creatinina no soro como apresentados no quadro seguinte:_