JP2008530547A - 心不全の診断 - Google Patents
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Abstract
哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定する、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別する、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象の心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断の方法であって、該方法は、該哺乳動物対象からの体液試料中のミエロペルオキシダーゼ(MPO)のレベルを測定することを含む。哺乳動物対象の心臓健康をモニタリングする方法をさらに含む。また、前記方法を実行するためのキットを含む。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、ヒトなどの哺乳動物対象における心不全の診断方法に関するものである。特に、体液試料中のミエロペルオキシダーゼ(MPO)のレベルを測定する前記方法に関するものである。
(背景)
心不全は、心臓が体に効率的に血液を拍出するほど強くない場合に生じ、かつ年齢とともに増加しつつある。結果として、体液が肺及び体組織に集まり、うっ血(目詰まり)を生じる。多くの場合、うっ血性心不全の原因はわかっていない。1つの共通した原因には、冠状動脈疾患があり得る。別の共通した原因には、高血圧があり得る。また別の共通した原因には、心臓弁膜症(特に大動脈疾患、及び僧帽弁疾患)があり得る。また他の原因には下記のものがあり得る:ウイルス(ヒト免疫不全ウイルスを含む)、細菌、及び寄生生物による感染;薬剤(例えばドキソルビシン[アドリアマイシン]、シクロホスファミド[Cytoxan]、コカイン);アルコール;結合組織疾患;浸潤性疾患(例えばアミロイド症、サルコイドーシス、血色素症、悪性疾患);頻脈;閉塞性心筋症;神経筋疾患(例えば筋ジストロフィー又は筋強直性ジストロフィー、フリートライヒ運動失調);代謝障害(例えば2型糖原病[ポンペ病]、及び5型糖原病[マッカードル病]);栄養障害(例えば脚気、クワシオルコル);褐色細胞腫;放射線;心内膜心筋線維症;好酸球性心内膜疾患;高拍出量性心不全(例えば心内短絡、心房瘻(atrioventricular fistula)、脚気、妊娠、パジェット病、甲状腺機能亢進症、貧血);産辱性心筋症;及び拡張特発性心筋症(dilated idiopathic cardiomyopathy)である。しかし、主な因子は年齢である:年齢を伴う心臓衰弱、及び血管狭窄である。従って、55歳を超えるヒトが最も発症する。
心不全は、心臓が体に効率的に血液を拍出するほど強くない場合に生じ、かつ年齢とともに増加しつつある。結果として、体液が肺及び体組織に集まり、うっ血(目詰まり)を生じる。多くの場合、うっ血性心不全の原因はわかっていない。1つの共通した原因には、冠状動脈疾患があり得る。別の共通した原因には、高血圧があり得る。また別の共通した原因には、心臓弁膜症(特に大動脈疾患、及び僧帽弁疾患)があり得る。また他の原因には下記のものがあり得る:ウイルス(ヒト免疫不全ウイルスを含む)、細菌、及び寄生生物による感染;薬剤(例えばドキソルビシン[アドリアマイシン]、シクロホスファミド[Cytoxan]、コカイン);アルコール;結合組織疾患;浸潤性疾患(例えばアミロイド症、サルコイドーシス、血色素症、悪性疾患);頻脈;閉塞性心筋症;神経筋疾患(例えば筋ジストロフィー又は筋強直性ジストロフィー、フリートライヒ運動失調);代謝障害(例えば2型糖原病[ポンペ病]、及び5型糖原病[マッカードル病]);栄養障害(例えば脚気、クワシオルコル);褐色細胞腫;放射線;心内膜心筋線維症;好酸球性心内膜疾患;高拍出量性心不全(例えば心内短絡、心房瘻(atrioventricular fistula)、脚気、妊娠、パジェット病、甲状腺機能亢進症、貧血);産辱性心筋症;及び拡張特発性心筋症(dilated idiopathic cardiomyopathy)である。しかし、主な因子は年齢である:年齢を伴う心臓衰弱、及び血管狭窄である。従って、55歳を超えるヒトが最も発症する。
多くの場合、心不全は左室の収縮機能障害(LVSD)の結果である。臨床的心不全の患者の40%ほどが、正常な収縮機能とともに拡張機能障害を有する。さらに、収縮機能障害患者の多くが、拡張機能障害の因子を有し得る。収縮機能障害が原因で、心室のポンプ機能に障害が生じる。拡張機能障害が原因で、心室充満に欠陥が生じる。心室拡張機能は、左室の圧力対容量(pressure-to-volume)の関係に依存する。左心室壁のコンプライアンスの低下は、所定の拡張期容積のための高い圧力をもたらす。最終的に、障害性心室充填、左心房及び肺静脈の不適切な圧力増加、及び心拍出量増加の減衰の結果となる。これらの機能障害は、心不全の臨床的症候群をもらたし得る。
心不全及びLVSDは、死亡及び罹患の重大な原因であるが、一般社会における診断には、問題が残されている。なぜなら、心エコー図の手段が、費用、訓練された人材の欠如、及び設備により制限されるためである。LVSDのためのスクリーニングは、その罹患率、無症候性対象の存在、及び治療有効性により支持される。最近の証拠は、ナトリウム利尿ペプチド、例えばB型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、及びその前駆体であるN-末端プロBNP(N-BNP)が、幾つかの研究においては性能が次善である可能性があった(Vasanらの論文, JAMA 2002;288: 1252-1259)が、LVSDスクリーニングに有用であることを示唆している(McDonaghらの論文, Lancet 1998;351:9-13;Hobbsらの論文, BMJ 2002;324: 1498-1500;Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782)。しかし、LVSDを除外するための感度及び高い陰性予測値(NPV)を有するが、BNP、及びN-BNPは、とりわけ特異的ではなく、かつ低い陽性予測値(PPV)を有する。
特に炎症性マーカを用いるマルチマーカアプローチ(Multimarker approaches)は、C-反応性タンパク質(CRP)及びミエロペルオキシダーゼ(MPO)が利用される場合、例えば急性冠症候群の重症度分類において、予測の特異性の促進に有用であり得る(Sabatineらの論文, Circulation. 2002;105: 1760-3;Brennanらの論文, N Engl J Med. 2003;349: 1595-604)。CRPは、将来の心血管系疾患を予測する(Ridkerらの論文, N Eng J Med 1997;336: 973-979;Ridkerらの論文, N Eng J Med 2000;342: 836-43)。また、心不全の発症において、CRPが、非代償性の症例における大きな値とともに上昇するという幾つかの証拠がある(Vasanらの論文, Circulation 2003;107: 1486-91;Yinらの論文, Am Heart J 2004;147(5): 931-8)。
MPOは、冠状動脈疾患において役割を有し(Zhangらの論文, JAMA. 2001;286: 2136-42)、かつ梗塞後心室リモデリング(Askariらの論文, J Exp Med. 2003;197:615-24)に関係している可能性があるが、ヒト心不全において、MPOは調査されていない。
MPOは、冠状動脈疾患において役割を有し(Zhangらの論文, JAMA. 2001;286: 2136-42)、かつ梗塞後心室リモデリング(Askariらの論文, J Exp Med. 2003;197:615-24)に関係している可能性があるが、ヒト心不全において、MPOは調査されていない。
US 特許出願第2002/0164662号は、白血球及び血液MPOのレベルが、環状動脈疾患患者において上昇することを開示している。この知見に基づき、著者らは、MPOが一般に心不全を含む心血管系疾患の診断薬になり得ることを提案している。しかし、MPOが心不全を示すという主張を支持するデータはない。さらに、MPOの放出をもたらす好中球の動員及び活性化の結果として、MPOが冠状動脈に放出されることは知られているが、心不全においてMPOが放出されることは明らかなことではない。(安定な又は循環血液量増加での)心不全において、MPOの測定が、診断又は予後となることを示唆するデータはない。実際に、本明細書中に示したデータは、虚血性心疾患(IHD)の存在が、MPOレベル上昇の存在を独立に予測することはないが、心不全の存在が、MPOレベル上昇の存在を独立に予測することを証明している。本明細書中の実施例における心不全患者は、高血圧(心不全患者の約1/3)を含む、心不全の根底にある様々な原因を有していた。しかし、MPOはそれでも、患者が現在IHD又心不全の発端としてはIHDを有しているかどうかとは無関の心不全の診断となった。本明細書中に、MPOが非IHD患者からIHD患者を識別することはないが、IHD患者から心不全患者を、及び非IHD患者から心不全患者を識別することを示す。従って、MPOが冠状動脈内で上昇することに基づいて、MPOを心不全患者の診断に使用することができると合理的に言うことはできない。De Pasqualeらの論文, Am J Physiol Hart Circ Physiol 2003, 284: H2136-H2145は、虚血性心筋障害が心不全を導く場合、MPOが、浮腫肺組織(oedematous lung tissue)内の好中球の集積のために肺組織内に含まれることを開示している。上記のこの理由、特に、ある割合の症例において、IHDのみが心不全の原因に起因するという事実のために、これが、心不全マーカとしての使用にとって、安定又は非代償性であるかどうかを推定することはできない。
(要旨)
本発明は、MPOが心不全の診断となる意外かつ予想外の発見に基づく。MPOは、心不全を選別又は診断するためにCRP、N-BNP、BNP、又はウロテンシンなどの第2マーカと組合せて使用され得る。さらに、驚くべきことに、CRP及びMPOの双方が、N-BNPとともにLVSDの検出において増分値を有することがわかり、心不全のスクリーニングを可能にするように、その特異性及び陽性予測を十分に改善することができる。
本発明は、MPOが心不全の診断となる意外かつ予想外の発見に基づく。MPOは、心不全を選別又は診断するためにCRP、N-BNP、BNP、又はウロテンシンなどの第2マーカと組合せて使用され得る。さらに、驚くべきことに、CRP及びMPOの双方が、N-BNPとともにLVSDの検出において増分値を有することがわかり、心不全のスクリーニングを可能にするように、その特異性及び陽性予測を十分に改善することができる。
第一の態様において、哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象の心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断の方法は、該哺乳動物対象からの体液試料中の第1マーカのレベルを測定することを含み、ここで該第1マーカがミエロペルオキシダーゼ(MPO)である。該体液は、血漿であり得る。該第1マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第1マーカのレベルと比較する。心不全の非存在を示す第1マーカのレベルは、心不全のない1以上の哺乳動物対象からの第1マーカのレベル、又は心不全のない哺乳動物対象の第1マーカの以前に測定された参照範囲であり得る。第1マーカのレベルは、該試料を該1マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも1種との間で生じる結合を測定することにより測定することができる。該抗体は、モノクローナル抗体であり得る。
さらに、該方法は、心不全を示す第2マーカのレベルを測定することを含む。第2マーカは、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、又はN-末端プロ-脳ナトリウム利尿ペプチド(N-BNP)などのナトリウム利尿ペプチドであり得る。第2マーカは、C-反応性タンパク質(CRP)又はウロテンシンであり得る。該第2マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第2マーカのレベルと比較することができる。例えば、心不全の非存在を示す第2マーカのレベルを、心不全のない1以上の哺乳動物対象からの第2マーカのレベル、又は心不全のない哺乳動物対象の第2マーカの以前に測定された参照範囲と比較することができる。第2マーカのレベルは、該試料を該2マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも1種との間で生じる結合を測定することにより測定することができる。該抗体は、モノクローナル抗体であり得る。
別の態様において、哺乳動物対象の健康をモニタリングするための方法は、該哺乳動物対象からの体液試料中の第1マーカのレベルを測定することを含み、ここで該第1マーカはミエロペルオキシダーゼ(MPO)である。特定の実施態様において、該第1マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第1マーカのレベルと比較する。他の実施態様において、該第1マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の心不全の悪化を示す第1マーカのレベルと比較する。他の実施態様において、該第1マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の心臓突然死を示す第1マーカのレベルと比較する。また別の実施態様において、該第1マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の治療への応答を示す第1マーカのレベルと比較する。
さらなる態様において、前記方法を実行するためのキットも提供する。
予想外にも、哺乳動物対象からの体液試料中の該第1マーカMPOのレベルは、心不全の診断に用い、かつ対象の症状を診断又は予測することができる。特に、MPOのレベルを、初期の選別として使用し、続いて、心不全をさらに効率的に診断し、心不全の悪化を検出し、心不全の変質を検出して、又は突然死の可能性若しくは対象の治療への応答を予測するために、第2マーカ用の任意検定を用いることができる。MPOは、心疾患の他の徴候のない対象において、心不全の診断となり得る。
予想外にも、哺乳動物対象からの体液試料中の該第1マーカMPOのレベルは、心不全の診断に用い、かつ対象の症状を診断又は予測することができる。特に、MPOのレベルを、初期の選別として使用し、続いて、心不全をさらに効率的に診断し、心不全の悪化を検出し、心不全の変質を検出して、又は突然死の可能性若しくは対象の治療への応答を予測するために、第2マーカ用の任意検定を用いることができる。MPOは、心疾患の他の徴候のない対象において、心不全の診断となり得る。
特定の態様において、MPOは、心不全の緊急でない症状を有する対象、又は明白な急性心臓異常(例えば心筋梗塞又は不安定狭心症)のない対象の心不全を選別するために、CRP、N-BNP、BNP、又はウロテンシンなどの第2マーカと組合せて使用され得る。該対象は、そのような選別のために医師により選択され得る。そのような選別にとって適切な対象は、明白な急性心臓異常がなく、かつ約25、35、45、又は55歳以上の男性又は女性であろう。該試験は、BNP、N-BNP、又はCRPなどの第2マーカと組合せて、MPOのパネルから選択され得る。これらのマーカのレベルは、心不全の非存在を示すマーカのレベルと比較され得る。マーカの増加測定値を有する対象が、心不全の診断のために心エコー図法により選択されるであろう。従って、心不全と診断された対象は、適切な薬理学的薬剤及び生活様式の改善を用いて、該症状に対して治療されるであろう。
1以上の実施態様の詳細は、添付図面及び下記明細書で説明される。他の特徴、目的、及び利点は、本明細書及び図面から、並びに請求項から明らかになるであろう。
1以上の実施態様の詳細は、添付図面及び下記明細書で説明される。他の特徴、目的、及び利点は、本明細書及び図面から、並びに請求項から明らかになるであろう。
(詳細な説明)
MPOは、正常な対象よりも心不全患者において高レベルで検出されている。従って、このマーカの測定は、心不全の存在、及び心不全の重症度の評価に対する診断補助として有用である。また、このマーカの測定は、哺乳動物対象の健康のモニタリングに有用である。MPO、或いはCRP、N-BNP、BNP、又はウロテンシンなどの第2マーカと組合せたMPOは、段階A(HFに関する危険因子)又は段階B(心不全前、例えば高血圧)の個人のHF発症の危険因子として、及び/又は突然心臓死発症の危険因子として、今まで診断未確定の患者の心不全を検出すること、心不全患者の循環血液量増加(代償不全)を検出すること、患者の状態が悪化しているかどうかを決定すること(例えばNYHAクラスの変化)、心不全患者の状態が治療に反応するかどうかを決定することに使用され得る。例えば、他のマーカ及び心拍変動(heart rate variability)の測定とともに使用され得る。
MPOは、正常な対象よりも心不全患者において高レベルで検出されている。従って、このマーカの測定は、心不全の存在、及び心不全の重症度の評価に対する診断補助として有用である。また、このマーカの測定は、哺乳動物対象の健康のモニタリングに有用である。MPO、或いはCRP、N-BNP、BNP、又はウロテンシンなどの第2マーカと組合せたMPOは、段階A(HFに関する危険因子)又は段階B(心不全前、例えば高血圧)の個人のHF発症の危険因子として、及び/又は突然心臓死発症の危険因子として、今まで診断未確定の患者の心不全を検出すること、心不全患者の循環血液量増加(代償不全)を検出すること、患者の状態が悪化しているかどうかを決定すること(例えばNYHAクラスの変化)、心不全患者の状態が治療に反応するかどうかを決定することに使用され得る。例えば、他のマーカ及び心拍変動(heart rate variability)の測定とともに使用され得る。
ミエロペルオキシダーゼ (EC 1.11.1.7)は、主要な好中球タンパク質である。また、単球中に存在する。好中球において、それは、アズール顆粒に保存され、食作用時に放出される。それは、食細胞の酸化的バーストにより生じるスーパーオキシド及び過酸化水素を使用し、次亜ハロゲン酸及び他の反応性酸化剤を産生する、約150kDaの四量体重グルコシル化ヘム酵素である。ヒトミエロペルオキシダーゼヌクレオチド配列は、3213ヌクレオチド長さであり、815-ヌクレオチド長の3’非コード領域に2つの異なるポリアデニル化シグナルを含む。一次翻訳産物は、745アミノ酸を有し、MPO機能性タンパク質のプロ配列(166アミノ酸)、及び小(122アミノ酸)及び大(467アミノ酸)サブユニットからなる。試料中のMPO量を、全分子として、MPOのフラグメントとして定量化することにより、或いは試料又は試料の誘導体におけるMPO活性を測定することにより、試料中のMPOレベルを測定することができる。
MPOを、そのポリペプチド配列を含む構造により同定することができる。例えば、該構造を、MPOの全ポリペプチド配列を表す一本鎖ポリペプチド配列により記載することができ、又は該構造を、MPOのフラグメントに相当する部分配列により記載することができる。複数の部分配列を組み合わせて、より大きい部分配列、又は全配列を作ることができる。例えば、第一ペプチド配列は、MPOのN-末端ポリペプチド配列を表すことができ、かつ第二配列は、MPOのC-末端ポリペプチド配列を表すことができる。MPOのフラグメントは、MPO特有のアミノ酸配列を有するMPOタンパク質のフラグメントである。該フラグメントは、わずか6アミノ酸であってもよいが、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15以上のアミノ酸であってもよい。ヒトMPOのアミノ酸配列を図3に提供し(NCBIデータベースのアクセッション番号NM_000250、アクセッション番号AH_002972)、かつ本明細書中に使用される「MPO」は、その変異体及び孤立遺伝子多型を含む。
MPOを改質することができる。N-又はC-末端を、例えば、N-末端上で、ホルミル基で改質することができる。該ポリペプチド配列を改質(例えば、グリコシル化、リン酸化)、疎水性基で改質(例えばミストイル化、又はゲラニルゲラニル化)、又は他のペプチド修飾で改質することができる。
一般に、該ペプチドのアミノ酸残基を、保存的置換において、他のアミノ酸残基で置換することができる。保存的置換の例を挙げると、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンなどの1つの非極性(すなわち疎水性)残基を他の非極性残基に置換;アルギニン及びリジン間、グルタミン及びアスパラギン間、又はグリシン及びセリン間の置換など、1つの極性(すなわち親水性)残基を他の極性残基に置換;リジン、アルギニン、又はヒスチジンなどの1つの塩基性残基を他の塩基性残基に置換;又はアスパラギン酸又はグルタミン酸などの1つの酸性残基を他の酸性残基に置換がある。保存的置換において、アミノ酸残基を、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換することができる。化学的類似性の側鎖を有するアミノ酸残基群は、技術的に規定されている。これらの群は、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
また、保存的置換は、非誘導体化残基の代わりに化学的誘導体化残基の使用を含むことができる。化学的誘導体残基を、残基の官能基の反応により化学的に誘導体化することができる。前記化学的誘導体の例を挙げると、例えばアミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又はホルミル基を形成するように遊離アミノ酸基を誘導体化した分子があるが、これらに制限されない。遊離カルボキシル基を、塩、メチル及びエチル、エステル、又は他種のエステル、又はヒドラジドを形成するように誘導体化することができる。遊離ヒドロキシル基を、O-アシル又はO-アルキル誘導体を形成するように誘導体化することができる。また、化学的誘導体に含まれるものは、20種標準アミノ酸の1以上の天然アミノ酸誘導体を含むポリペプチドである。例えば、プロリンに対して4-ヒドロキシプロリンを置換することができ;ヒスチジンに対して5-ヒドロキシルシンを置換することができ;セリンに対してホモセリンを置換することができ;かつリジンに対してオルニチンを置換することができる
該ポリペプチドのアミノ酸残基を、非保存的置換において、他のアミノ酸残基で置換することができる。幾つかの場合において、非保存的置換は、該ポリペプチドの当該特性を変更しない。当該特性は、限定されないが、MPO認識抗体に結合する能力、又は他の生物活性とすることができる。
例えば免疫クロマトグラフ形式において、アッセイを定性的又は定量的に使用することにより、試料中のMPOレベルを測定することができる。定性的アッセイは、MPOの存在又は非存在を区別することができ、又は非存在、低濃度、中間の濃度、又は高濃度又はその組合せなど、試料中のMPOレベルの分類を区別することができる。定量的アッセイは、試料中のMPOの数値計測を提供することができる。該アッセイは、MPOをMPO認識抗体と接触させること、MPOを質量分析により検出すること、MPO遺伝子の発現(例えば、mRNA又はポリペプチド)細胞を含む試料を評価すること、又は測定の組合せを含むことができる。例えば、該アッセイは、試料をMPO認識抗体と接触させること、及び質量分析測定を含むことができる。
例えば免疫クロマトグラフ形式において、アッセイを定性的又は定量的に使用することにより、試料中のMPOレベルを測定することができる。定性的アッセイは、MPOの存在又は非存在を区別することができ、又は非存在、低濃度、中間の濃度、又は高濃度又はその組合せなど、試料中のMPOレベルの分類を区別することができる。定量的アッセイは、試料中のMPOの数値計測を提供することができる。該アッセイは、MPOをMPO認識抗体と接触させること、MPOを質量分析により検出すること、MPO遺伝子の発現(例えば、mRNA又はポリペプチド)細胞を含む試料を評価すること、又は測定の組合せを含むことができる。例えば、該アッセイは、試料をMPO認識抗体と接触させること、及び質量分析測定を含むことができる。
MPOタンパク質、又はそのフラグメントのレベルを測定することに加えて又は代替的に、MPO産生酸化的産物のレベルを測定することにより、MPOレベルを測定することができる。適切なMPO産生酸化的産物の例は、クロロチロシン、ジチロシン、ニトロチロシン、及びメチオニンスルホキシドである。さらに、MPO産生脂質過酸化産物を測定することができる。適切なMPO産生脂質過酸化産物は、下記のものである:ヒドロキシ-エイコサテトラエン酸(HETE);ヒドロキシ-オクタデカジエン酸(HODE);F2イソプラスタン;2-リソPC(2-lysoPC)のグルタル酸及びノナン二酸モノエステル(それぞれG-PC及びND-PC);2-リソPCの9-ヒドロキシ-10-ドデセン二酸及び5-ヒドロキシ-8-オキソ-6-オクテン二酸エステル(それぞれHDdiA-PC及びHOdiA-PC);2-リソPCの9-ヒドロキシ-12-オキソ-10-ドデセン酸及び5-ヒドロキシ-8-オキソ-6-オクテン酸エステル(それぞれHODA-PC及びHOOA-PC);2-リソPCの9-ケト-12-オキソ-10-ドデセン酸及び5-ケト-8-オキソ-6-オクテン酸エステル(それぞれKODA-PC及びKOOA-PC);2-リソPCの9-ケト-12-オキソ-10-ドデセン二酸及び5-ケト-8-オキソ-6-オクテン二酸エステル(それぞれKDdiA-PC及びKOdiA-PC);2-リソPCの5-オキソ吉草酸及び9-オキソノナン酸エステル(それぞれOV-PC及びON-PC);5-コレステン-5α,6α-エポキシ-3β-オール(コレステロールα-エポキシド);5-コレステン-5β,6α-エポキシ-3β-オール(コレステロールβ-エポキシド);5-コレステン-3β,7β-ジオール(7-OH-コレステロール);5-コレステン-3β,25-ジオール(25-OHコレステロール);5-コレステン-3β-オール-7β-ヒドロペルオキシド(7-OOHコレステロール);及びコレスタン-3β,5α,6β-トリオール(トリオール)である。
MPOは、血漿、又は組織液、尿、唾液、血清、リンパ、胃液、胆汁、汗、涙液、及び脳及び髄液などの哺乳動物体から得られ得る他の体液中で検出され得る。体液は、処理済(例えば血清)又は未処理であってもよい。該哺乳動物対象は、ヒトであってもよい。
MPOは、血漿、又は組織液、尿、唾液、血清、リンパ、胃液、胆汁、汗、涙液、及び脳及び髄液などの哺乳動物体から得られ得る他の体液中で検出され得る。体液は、処理済(例えば血清)又は未処理であってもよい。該哺乳動物対象は、ヒトであってもよい。
それらのMPOの測定レベルを、心不全の非存在を示すMPOレベルと比較することができる。このレベルは、心不全のない1以上の哺乳動物対象からのMPOのレベル、又は前記哺乳動物対象内のMPOに対して以前に測定された参照範囲を有するMPOのレベルであり得る。この方法において、診断又は予後診断のために、該レベルを、心不全のない対象の個体群研究から測定された参照レベルと比較することができる。前記対象は、年齢及び/又は性別に対して一致させることができる。一実施態様において、心不全の非存在を示すMPOのレベルは、約80 pmol/L(又は27 ng/ml)以下、例えば、25 ng/ml未満、23 ng/ml未満、又は20 ng/ml未満であり得る。心不全を示すMPOのレベルは、約88 pmol/L(又は30 ng/ml)以上、例えば、32 ng/ml超過、35 ng/ml超過、又は38 ng/ml超過であり得る。当業者は、正確な値が、アッセイ形式により変更され得ることを理解するであろう。心不全を有する哺乳動物対象に投与される治療効果をモニターするために、測定MPOレベルを、該対象の基礎レベルと比較することができる。該基礎レベルを、該治療の開始前に決定することができる。この基礎レベルからの偏差は、心不全状態の改善又は悪化があるかどうかを示し、従って、治療が効果的かどうかを示す。MPOレベルの増加は、心不全の悪化を示し、かつ逆もまた同様である。哺乳動物対象の心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断に使用されるか、哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度の測定に使用されるか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象の識別に使用されるか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果のモニタリングに使用される各MPOレベルが、互いに異なり得ることは、当業者により理解されるであろう。これらのレベルは、本明細書中に記載されている方法と類似の方法において容易に決定され得る。
また、哺乳動物対象の心不全を示す第2マーカを測定することができる。該第2マーカは、C-反応性タンパク質(CRP−スイスプロット(SwissProt) P02741)、酵素調節タンパク質(ORP150−NCBIデータベースアクセッション番号AAC50947、アクセッション番号NP_006380)、ウロテンシン(UTN−GenBank登録番号NM_021995及びNM_006786)、血漿サーファクタントプロテインB(GenBank登録番号J02761)、Nourin-1(特許出願シリアル番号10/945,442に記載されている。該文献は、その全体において本明細書中に引用により取り込まれている。)、或いは、天然型心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP−Brennerらの論文, Physiol. Rev., 1990, 70: 665を参照)、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)及びC-型ナトリウム利尿(CNP−Stingoらの論文, Am. J. Physiol. 1992, 263: H1318を参照)、及びそれらの変異体又は対立遺伝子多型を含むナトリウム利尿ペプチドとすることができる。CRPのアミノ酸配列を図5に示す。適切なナトリウム利尿ペプチドは、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、又はN-末端プロ-脳ナトリウム利尿ペプチド(N-BNP)である。心不全において、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)(Weiらの論文, Circulation 1993;88: 1004-9;McDonaghらの論文, Lancet 1998;351: 9-13)、及びその前駆体N-末端タンパク質(N-BNP)(Huntらの論文, Clin Endocrinol 1997;47: 287-96;Hughesらの論文, Clinical Science 1999;96: 373-380)の血漿レベル増加とともに、脳ナトリウム利尿ペプチド系の上方制御が証明されている。タンパク質の全体(図4参照)(Sudohらの論文, Biochem Biophys Res Commun 1989;159: 1427-34)は、シグナルペプチド配列(アミノ酸1-26)、及びプロBNP(アミノ酸27-134)からなり、それらからN-BNP(アミノ酸27-102)、及びBNP (アミノ酸103-134)が誘導される。左心室心筋細胞からのプロBNP(2つの循環形態、BNP(活性ペプチド)及びN-BNP (不活性ペプチド)に対する無処置前駆体)の放出、及びBNPの増強産生は、心筋拡張、心筋伸張、及び心筋負傷により誘発される。他の適切なナトリウム利尿ペプチドは、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)(Hall, Eur J Heart Fail, 2001, 3:395-397)である。ウロテンシンは、プロホルモン前駆体、成熟ウロテンシンに処理されるプロウロテンシン(GenBank登録番号O95399)、及びN-末端ペプチドから誘導される。本明細書中に使用される用語「ウロテンシン」は、プロウロテンシン、成熟ウロテンシン、そのN-末端誘導ペプチド、そのシグナルペプチド、及びC-末端ペプチド(Glu-Thr-Pro-Asp-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val(配列番号:6)(Cys5とCys10との間のジスルフィド結合))、並びに、それらのフラグメントをさらに含む。また、用語ウロテンシンは、ウロテンシン関連ペプチド(URP)(Ala-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val(配列番号:7)(Cys2とCys7との間のジスルフィド結合))、並びに、ウロテンシン関連ペプチドのプロフォーム(proform)(GenBank登録番号NM_198152)を意味する。De Pasqualeらの論文, Circulation, 2004, 110:1091-1096において、心不全マーカとして血漿サーファクタントプロテインBを記載する。
上記第2マーカのフラグメントを測定することができる。この場合において、該フラグメントは、問題となっている該第2マーカ特有のアミノ酸配列を有するであろう。該フラグメントは、わずか6アミノ酸であってもよいが、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15以上のアミノ酸であってもよい。ORP150に対して、該フラグメントは、配列LAVMSVDLGSESM(配列番号:8)を含むか、又はそれから構成され得る。BNPに対して、該フラグメントは、配列PQTAPSRALLLLL(配列番号:9)から構成されるか、又はそれを含み得る。
第1マーカMPOに類似の方法において、測定された第2マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第2マーカのレベルと比較することができる。このレベルは、心不全のない1以上の哺乳動物対象からの第2マーカのレベル、又は心不全のない哺乳動物対象の第2マーカの以前に測定された参照範囲を有し得る。例えば、心不全のリスク増加を示すBNP又はN-BNPのレベルは、25 fmol/ml以上、例えば28 fmol/ml超過であり得る。心不全のリスク増加を示すCRPのレベルは、40 ng/ml以上、例えば42 ng/ml超過であり得る。さらに、当業者は、正確な値がアッセイ形式により変更され得ることを理解するであろう。
本明細書中にさらに詳細に説明するように、本発明者らは、MPO、CRP、及びN-BNPの組合せ使用が、改良型特異性、及びこれらのマーカの幾つかの単独使用に対する陽性予測値を提供することを証明している。この結果は、超音波心臓検査計が、心不全を確認するように実行される必要性を減らし、結果、有意なコスト削減をもたらす。
マーカレベルは、濃度、質量、モル、体積、又は存在しているマーカの量を示す任意の他の測度の単位で提供され得る。
マーカレベルは、濃度、質量、モル、体積、又は存在しているマーカの量を示す任意の他の測度の単位で提供され得る。
第1及び第2マーカの各レベルは、免疫アッセイを用いて、すなわち、試料を該マーカと特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも1種との間で生じる結合を測定することにより測定され得る。前記アッセイは、競合的又は非競合的免疫アッセイとすることができる。前記アッセイ、均一及び不均一の双方は、技術的に周知のものであり、検出されるべき分析物は、ラテックス又は金粒子、蛍光成分、酵素、電気化学的活性種などの検出可能種でラベル化されている抗体のような、特異的結合相手と結合を生じる。あるいは、該分析物を、任意の上記検出可能種でラベル化し、かつ制限量の特異抗体と競合させてもよい。次に、存在する分析物の存在又は量を、該ラベルの存在又は濃度の検出により測定する。前記アッセイを、実験室分析機器を用いて、或いはEP291194に記載されているような側方流動免疫アッセイ(lateral flow immunoassay)などのケアテスティングデバイス(care testing device)又はホームテスティングデバイス(home testing device)の点で、従来の方法で行ってもよい。
一実施態様において、免疫アッセイは、試験されるべき対象からの試料を、マーカが存在する場合に免疫特異的結合が生じ得るような条件下で適切な抗体と接触させること、及び該抗体による任意の免疫特異的結合の量を検出又は測定することにより行われる。該抗体を、少なくとも10分間、30分間、1時間、3時間、5時間、7時間、10時間、15時間、又は1日間、試料と接触させることができる。制限されないが、ウエスタンブロット、放射線免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドウィッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ(agglutination assays)、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫アッセイ、及びタンパク質A免疫アッセイ(protein A immunoassays)などの技術を使用する競合的及び非競合的アッセイ系を含む、任意の適切な免疫アッセイを使用することができる。
例えば、2段階サンドイッチアッセイの手段により、マーカを体液試料中に検出することができる。第一段階において、捕獲試薬(例えば抗マーカ抗体)を使用して、該マーカを捕獲する。該捕獲試薬を、固相上に選択的に固定化することができる。第二段階において、直接的又は間接的ラベル化検出試薬を使用して、捕獲されたマーカを検出する。一実施態様において、該検出試薬は抗体である。他の実施態様において、該検出試薬は、レクチンである。
一実施態様において、側方流動免疫アッセイ機器を、該「サンドイッチ」形式に使用することができる。ここで。試料中の十分なマーカの存在は、側方流動アッセイの捕獲帯(capture zone)で、「サンドイッチ」相互作用の形成を生じるであろう。本明細書中に使用される該捕獲帯は、MPO及び本明細書中に記載した他のマーカの捕獲に適した抗体分子、抗原、核酸、レクチン、及び酵素などの捕獲試薬を含むことができる。また、該機器は、分析物の存在により測定される捕獲の範囲の捕獲帯における捕獲に適した1以上の発光ラベルを組み込むことができる。適切なラベルは、ポリスチレンミクロスフェアに固定化した蛍光標識を含む。ミクロスフェアを、免疫グロブリンでコートし、該捕獲帯における捕獲を可能にすることができる。
使用することができる他のアッセイは、流入機器(flow-through device)を含むが、これに制限されない。
使用することができる他のアッセイは、流入機器(flow-through device)を含むが、これに制限されない。
流入アッセイにおいて、1つの試薬(通常、抗体)を、膜表面上の規定領域に固定化する。次に、この膜を、容器として作用する吸収層上に重ね、該機器に渡って試料体積を注入する。固定化後に、該膜上の残りのタンパク質結合部位を遮断し、非特異的相互作用を最小化する。該アッセイを使用する場合、該抗体に特異的であるマーカを含む体液試料を、該膜に加え、該マトリクスを通して濾過し、該マーカを固定化抗体に結合させる。任意の第二段階において(第一反応物質が抗体である実施態様において)、タグ化二次抗体(酵素接合体、着色ラテックス粒子に結合した抗体、又は着色コロイドに組み込んだ抗体)を加える又は遊離させることができ、捕獲マーカと反応させて、該サンドイッチを完成する。あるいは、該二次抗体を該試料と混合し、かつ一段階で加えることができる。マーカが存在する場合、着色スポットが、該膜の表面上で現像される。
本明細書中に使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を意味する。該免疫グロブリン分子は、任意クラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、及びIgA)、又は免疫グロブリン分子のサブクラスのものである。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二種特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、及びF(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(anti-Id)抗体、及び上記のいずれかの抗原決定基結合フラグメントを含むが、これらに制限されない。抗体、又は一般的に任意分子は、抗体が抗原に優先的に結合する場合、抗原(又は他の分子)に「特異的に結合」し、かつ例えば、他の分子と、約30%未満、好ましくは20%、10%、又は1%未満の交差反応性を有する。抗体の部分は、Fv及びFv’部分を含む。
本明細書中に記載したMPO及び他のマーカを検出する抗体は、商業的に入手可能である。例えば、抗MPO及び抗BNP抗体は、Abcam Ltd, 21 Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0TP, UKから入手可能であり、抗CRP抗体は、Alpha Diagnostic International社, 5415 Lost Lane, San Antonio, TX 78238 USA、及びResearch Diagnostic社, Pleasant Hill Road, Flanders NJ 07836, USAから入手可能であり、かつ抗ORP150抗体は、Immuno-Biological Laboratories Co. Ltd, 1091-1 Naka, Fujioka-shi, Gunma, 375-0005, Japanから入手可能である。BNP及びANPに結合する抗体を、商業的に入手できる。BNPに結合する市販の抗体の例は、ウサギ抗ヒトBNPポリクローナル抗体(Biodesign International)、ウサギ抗BNPアミノ酸1-20ポリクローナル抗体(Biodesign International)、抗ヒトBNPモノクローナル抗体(Immundiagnostik)、及びウサギ抗ヒトBNPアミノ酸1-10ポリクローナル抗体(Immundiagnostik)がある。ANPに結合する市販の抗体の例は、マウス抗ヒトANPモノクローナル抗体(Biodesign International)、ウサギ抗ヒトANPモノクローナル抗体(Biodesign International)、マウス抗ヒトANPモノクローナル抗体(Chemicon)、ウサギ抗ヒトANPアミノ酸95-103抗体(Immundiagnostik)、ウサギ抗ヒトANPアミノ酸99-126抗体(Immundiagnostik)ヒツジ抗ヒトANPアミノ酸99-126抗体(Immundiagnostik)、マウス抗ヒトANPアミノ酸99-126モノクローナル抗体(Immundiagnostik)、及びウサギ抗ヒトa-ANPポリクローナル抗体(United States Biological)がある。
また、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。
また、哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断用キットを提供する。該キットは、該哺乳動物対象からの体液試料を取得するための説明書、及び該試料中のミエロペルオキシダーゼ(MPO)のレベルを測定するための1以上の試薬を含む。
1以上の試薬は、上記のような、第1マーカに特異的に結合する抗体を含むことができる。該キットは、哺乳動物対象の心不全を示す第2マーカのレベルを測定するための1以上の試薬を含むことができる。
また、哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断用キットを提供する。該キットは、該哺乳動物対象からの体液試料を取得するための説明書、及び該試料中のミエロペルオキシダーゼ(MPO)のレベルを測定するための1以上の試薬を含む。
1以上の試薬は、上記のような、第1マーカに特異的に結合する抗体を含むことができる。該キットは、哺乳動物対象の心不全を示す第2マーカのレベルを測定するための1以上の試薬を含むことができる。
該哺乳動物対象からの体液試料を取得するための説明書は、任意であってもよい。さらに、キットは、1以上の下記のものを任意に含むことができる:(1)哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断用キットを使用するための説明書;(2)該キット内に存在する任意の抗体に対するラベル化された結合相手;(3)前記抗体が固定化された固相(試薬ストリップなど);及び(4)診断使用、予測使用、又は治療的使用、或いはこれらの任意組合せのための規制認可を示すラベル又は折り込み紙である。該抗体又は各抗体に対する非ラベル化結合相手を提供する場合、該抗体又は各抗体自身を、検出可能なマーカ、例えば化学発光成分、酵素成分、蛍光成分、又は放射性活性成分でラベル化することができる。
さらなる態様において、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)を、哺乳動物対象の心不全のマーカとして使用する。該ミエロペルオキシダーゼ(MPO)のレベルを測定するための試薬は、哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断用診断薬の製造において、試料中に使用され得る。
さらなる態様において、心筋梗塞、又は不安定狭心症などの明白性のない急性心臓状態を有する対象は、これらの医師により、心臓状態のスクリーニングに選択される。血液試料を、アプロチニンを含む予め冷却したNa-EDTAチューブ内に回収し、検定まで、血漿を−70℃で保存する。血漿を、BNP、N-BNP、CRP、及びMPOマーカレベルに対して検定する。マーカのレベルを、該試料と特定の抗体に特異的に結合する抗体との接触、及び該抗体と該試料中の少なくとも1種との間で生じる結合の測定により測定する。該マーカレベルを使用して、該対象が心不全を発症している又は将来発症するかどうかを決定する。マーカのレベルは、心不全の非存在を示すマーカのレベルと比較される。マーカの増加測定値を有する対象は、心エコー図による心不全のさらなる診断を選択される。心エコー図により心不全と診断された対象は、適切な医薬、及び生活様式改善により、該状態が治療される。
本発明の各態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えた他の態様の各々に関する。本明細書中の先行技術文献は、法的に認められる全範囲に取り込まれている。
本発明は、下記の非制限的例においてさらに記載される。
本発明の各態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えた他の態様の各々に関する。本明細書中の先行技術文献は、法的に認められる全範囲に取り込まれている。
本発明は、下記の非制限的例においてさらに記載される。
(方法)
(患者採用)
Leicestershire(人口約100万人)の21の一般診療から、ランダムに選択した男性(45〜80歳)及び女性(55〜80際)を、スクリーニングのために募集した(1999年9月〜2002年5月)。心不全又はLVSDの前歴を有する対象は全て除外した。対象は、インフォームドコンセントを与え、かつ研究は、Leicestershire研究倫理委員会(Leicestershire Research Ethics Committee)により承認された。
(患者採用)
Leicestershire(人口約100万人)の21の一般診療から、ランダムに選択した男性(45〜80歳)及び女性(55〜80際)を、スクリーニングのために募集した(1999年9月〜2002年5月)。心不全又はLVSDの前歴を有する対象は全て除外した。対象は、インフォームドコンセントを与え、かつ研究は、Leicestershire研究倫理委員会(Leicestershire Research Ethics Committee)により承認された。
(心エコー図)
患者は、心エコー図、及び血液サンプリングのために、Leicester Royal Infirmaryに出席した。Sonos 5500分析機器(Philips Medical Systems)を用いて、1人のオペレーターにより経胸郭心エコー図法を行った。スキャニングプロトコルの全詳細は、(Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782)に記載されている。米国学会の心エコー図モデル(Schillerらの論文, J Am Soc Echocardiogr 1989;2: 358-67)に基づき、16セグメントウォールモーション指数(segment wall motion index(LVWMI))を、ペプチド測定に左右されずに3人の調査員により計算した。≧1.8(40%のLV駆出分画に相当)のLVWMIスコアを有する対象はLVSDと考えられる(Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782)。下記の大きな異常を有するECGは顕著であった:−心房細動、LV肥大、左脚ブロック、Q波である。
患者は、心エコー図、及び血液サンプリングのために、Leicester Royal Infirmaryに出席した。Sonos 5500分析機器(Philips Medical Systems)を用いて、1人のオペレーターにより経胸郭心エコー図法を行った。スキャニングプロトコルの全詳細は、(Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782)に記載されている。米国学会の心エコー図モデル(Schillerらの論文, J Am Soc Echocardiogr 1989;2: 358-67)に基づき、16セグメントウォールモーション指数(segment wall motion index(LVWMI))を、ペプチド測定に左右されずに3人の調査員により計算した。≧1.8(40%のLV駆出分画に相当)のLVWMIスコアを有する対象はLVSDと考えられる(Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782)。下記の大きな異常を有するECGは顕著であった:−心房細動、LV肥大、左脚ブロック、Q波である。
(研究室の方法)
静脈血液20mlを、アプロチニンを含む予め冷却したNa-EDTAチューブ内に回収し、検定まで、血漿を−70℃で保存した。血漿を、N-BNP、CRP、及びMPOに対して、非競合的免疫発光測定アッセイ(non-competitive immunoluminometric assays)を用いて検定した。N-BNPアッセイは、以前に記載されている(Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782;Omlandらの論文, Circulation 2002;106: 2913-8)。CRPは、モノクローナルCRP抗体(100ng/100μL)(Unipath PLC, Bedford) を固定化したELISAプレート、及びウサギポリクローナル抗体(50ng/100μL)(Merck BioSciences, Nottingham, UK)を用いて測定した。MPOアッセイには、モノクローナルMPO抗体(100ng/100μL)(Research Diagnosis社, Flanders, New Jersey, USA) を固定化したELISAプレート、及びウサギポリクローナル抗体(50ng/100μL)(Merck BioSciences, Nottingham, UK)を使用した。検出には、二次試薬(Sigma, Poole, UKからのビオチン化抗ウサギIgG、1:250,000希釈)、及びメチルアクリジニウムエステルラベル化ストレプトアビジン(Omlandらの論文, Circulation 2002;106: 2913-8)を使用した。全ての免疫発光測定アッセイを、0.05%過酸化水素及び250 mmol/l NaOHを含む100 mmol/l HNO3の逐次的注入を用いて、Dynex MLX照度計で読み込んだ。CRP及びMPOアッセイは、それぞれ、検出下限値20及び0.25 ng/mlで、アッセイ間及びアッセイ内変動係数が10%未満であった。
静脈血液20mlを、アプロチニンを含む予め冷却したNa-EDTAチューブ内に回収し、検定まで、血漿を−70℃で保存した。血漿を、N-BNP、CRP、及びMPOに対して、非競合的免疫発光測定アッセイ(non-competitive immunoluminometric assays)を用いて検定した。N-BNPアッセイは、以前に記載されている(Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782;Omlandらの論文, Circulation 2002;106: 2913-8)。CRPは、モノクローナルCRP抗体(100ng/100μL)(Unipath PLC, Bedford) を固定化したELISAプレート、及びウサギポリクローナル抗体(50ng/100μL)(Merck BioSciences, Nottingham, UK)を用いて測定した。MPOアッセイには、モノクローナルMPO抗体(100ng/100μL)(Research Diagnosis社, Flanders, New Jersey, USA) を固定化したELISAプレート、及びウサギポリクローナル抗体(50ng/100μL)(Merck BioSciences, Nottingham, UK)を使用した。検出には、二次試薬(Sigma, Poole, UKからのビオチン化抗ウサギIgG、1:250,000希釈)、及びメチルアクリジニウムエステルラベル化ストレプトアビジン(Omlandらの論文, Circulation 2002;106: 2913-8)を使用した。全ての免疫発光測定アッセイを、0.05%過酸化水素及び250 mmol/l NaOHを含む100 mmol/l HNO3の逐次的注入を用いて、Dynex MLX照度計で読み込んだ。CRP及びMPOアッセイは、それぞれ、検出下限値20及び0.25 ng/mlで、アッセイ間及びアッセイ内変動係数が10%未満であった。
(統計分析)
統計分析をSPSSバージョン12.0(SPSS Inc, IL)を用いて行った。中央値[範囲]を記録し、かつマン-ホイットニー又はχ2検定を用いて行った。スピアマン相関係数(rs)、及び受信者操作特性(ROC)曲線(AUC)の領域、及びこれらの95%信頼区間を概算した。一般線形モデル、及びロジスティック回帰分析を、該モデルを含んだ定数とともに状態変数を用いてSPSSで行った。回帰において、エントリー又は除外の確率を、それぞれ、P<0.05、及びP<0.10とした(前向き又は後向き尤度比(forward or backward likelihood ratio)回帰分析を用いる場合)。
統計分析をSPSSバージョン12.0(SPSS Inc, IL)を用いて行った。中央値[範囲]を記録し、かつマン-ホイットニー又はχ2検定を用いて行った。スピアマン相関係数(rs)、及び受信者操作特性(ROC)曲線(AUC)の領域、及びこれらの95%信頼区間を概算した。一般線形モデル、及びロジスティック回帰分析を、該モデルを含んだ定数とともに状態変数を用いてSPSSで行った。回帰において、エントリー又は除外の確率を、それぞれ、P<0.05、及びP<0.10とした(前向き又は後向き尤度比(forward or backward likelihood ratio)回帰分析を用いる場合)。
(結果)
アプローチした2392対象のうち、1360をスクリーニングした。分析可能な心エコー図スキャン及び血液試料を有する参加者の数は、1331であった(表1)。上記定義(LVWMI≧1.8、又はLVEF≦40%)で、以前にLVSD診断未確定であった28対象(全個体群の2.1%)は、正常対象と比べて、血漿N-BNPが上昇していた(表1、図1)。また、血漿CRP及びMPOレベルは、LVSDにおいて有意に上昇した(表1、図1)。血漿N-BNPとCRP(rs =0.071, P<0.0005)及びMPO(rs =0.139, P<0.0005)との相関は、血漿CRPとMPO(rs =0.168, P<0.0005)との相関と比べて、比較的小さかった。LVWMIスコアは、血漿N-BNP、CRP、及びMPO(それぞれrs =0.145, 0.168, 0.113, 全てに対してP<0.0005)に相関があった。血漿CRPは、喫煙者において上昇していた(中央値[範囲]が、非喫煙者88.8[20-3012.2] ng/mlに比べて、161.5[20-3935.8] ng/ml)が、血漿MPOは、喫煙による影響はなかった。
アプローチした2392対象のうち、1360をスクリーニングした。分析可能な心エコー図スキャン及び血液試料を有する参加者の数は、1331であった(表1)。上記定義(LVWMI≧1.8、又はLVEF≦40%)で、以前にLVSD診断未確定であった28対象(全個体群の2.1%)は、正常対象と比べて、血漿N-BNPが上昇していた(表1、図1)。また、血漿CRP及びMPOレベルは、LVSDにおいて有意に上昇した(表1、図1)。血漿N-BNPとCRP(rs =0.071, P<0.0005)及びMPO(rs =0.139, P<0.0005)との相関は、血漿CRPとMPO(rs =0.168, P<0.0005)との相関と比べて、比較的小さかった。LVWMIスコアは、血漿N-BNP、CRP、及びMPO(それぞれrs =0.145, 0.168, 0.113, 全てに対してP<0.0005)に相関があった。血漿CRPは、喫煙者において上昇していた(中央値[範囲]が、非喫煙者88.8[20-3012.2] ng/mlに比べて、161.5[20-3935.8] ng/ml)が、血漿MPOは、喫煙による影響はなかった。
さらなる分析のために、血漿N-BNP、MPO、及びCRPをlog変換した。単変量解析において、血漿MPOは、虚血性心疾患(IHD)暦の有する対象、大きなECG異常を有する対象、及び高齢対象においても上昇した(表2)。同様に、血漿CRPは、これらのグループ、また高血圧対象、女性、及び肥満度(中央値26.22 kg/m2超過)の対象において上昇した(表2)。しかし、一般線形モデル(SPSS)を用いた多変量解析において、CRP及びMPOレベル、双方に独立に影響を与える唯一の因子は、LVSDの存在であった(表2)。特に注目することは、MPOレベルにおいてLVSD(心不全)の存在のそれとは独立に、IHD暦の影響がないことである。
LVSD診断に対して、3つのマーカ全てにおいて、受信者動作特性曲線(ROC AUC)の領域が対角線(P<0.0005)から有意に異なっていた(図2、表3)。個々のマーカは、高感受性及びNPVを有していたが、低特異性及びPPVであった(CRP又はN-BNP、どちらかよりもより良く振舞うMPOで)。1 LVSDケースを診断するために心エコー図により検査しなければならない対象の数は、29.7(N-BNP)及び35.5(CRP)と比べて、MPOでは13.5であった。
3ペプチド全てを使用するLVSD診断のために、2成分ロジスティック回帰分析を使用して、Nagelkerke r2が0.448(P<0.0005)のモデルを、独立に寄与する3ペプチド全てを用いて構築した(表4、ロジスティックモデル1)。予測確率(又はC統計値)は、ROC曲線としてプロットした場合、0.949の領域をもたらし、改善された特異性及びPPVを有していた(表3)。スキャンの必要がある対象の数は、MPOのみの使用と比べて半分であった。
3ペプチド全て、及び臨床的特性(年齢、性別、IHD暦、高血圧、又は糖尿病)を、2成分ロジスティック回帰分析に組み入れ、LVSDに関連したこれらの容易に利用可能な因子及び変量が、診断アルゴリズムをさらに改善し得るかどうかを試験した。該3ペプチドに加えて、唯一の有意な独立予測因子は、Nagelkerke r2が0.52(P<0.0005)の男性、及びIHD暦であった(表4、ロジスティックモデル2)。改善した特異性及びPPV(表3)は、これらの単純な算入を正しいとするであろう。約4対象のみが、LVSDの1ケースを検出するためにスキャンを必要とする。
血漿MPOは、単独と考えると、特異性及びPPVに対して最もよい値を有していた。33.9 ng/mlでの血漿MPOレベルのカットオフレベルで、28 LVSD 患者のうち27患者は、388の他の正常対象(n=365)とともに回収されるであろう。MPOレベル33.9 ng/ml超過の対象において、CRP、N-BNP、及びこれらの2ペプチドを用いたロジスティックモデルの有用性を試験した。図2は、CRP及びN-BNPのROC曲線を示し、かつ表5は、ROC AUC、特異性、これらのペプチドのPPV、及び心エコー図を必要とするケースの数を示す。N-BNP、CRP、IHD暦を用いたロジスティックモデルは、それぞれオッズ比10.06[P<0.0005]、5.41[P<0.0005]、3.93 [P<0.01]、及び4.17[P<0.007]で、Nagelkerke r2が0.43(P<0.0005)と計算された。N-BNP及びCRPは、必要とされるスキャンの数を個々に減少させたが、N-BNP、CRP、IHD暦、及び性別を用いた該ロジスティックモデル(Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782)は、最も大きな減少を達成した(表5)。
血漿N-BNP、MPO、及びCRPを単独、並びに上記ロジスティックモデル1、及び2との組合せにおいて関与するスクリーニング計画の費用を表6に示した。費用は、心エコー図スキャン及び血漿N-BNPのコストをそれぞれUS$420及び32と仮定した、Heidenreichらの論文による最近の費用対効果分析に基づく(Heidenreichらの論文, J Am Coll Carジオール 2004;43 : 1019-26)。本発明者らは、MPO及びCRP試験コストがN-BNPと類似することを想定している。この見解は、ロジスティックモデル2(戦略F)が、検出される1ケースあたり最も低コストでLVSDを検出できることを示唆している。血漿MPO(>33.9 ng/ml)を初期選別に使用した場合、N-BNP又はCRPを用いた次の試験は、LVSD検出において幾らかのコスト削減を達成するが、最も大きな削減は、性別及びIHD暦を用いたロジスティックモデル(Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782)において、これらのマーカ双方を用いることである。
(議論)
LVSDのスクリーニングにおいての関心は、B-型ナトリウム利尿ペプチド試験の導入により促進されていることである(McDonaghらの論文, Lancet 1998;351:9-13;Hobbsらの論文, BMJ 2002;324: 1498-1500;Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782;Vasanらの論文, JAMA 2002;288: 1252-1259)が、その効果は、幾つかの研究において、比較的低特異性のために疑問がある(Vasanらの論文, JAMA 2002;288: 1252-1259)。費用対効果分析において、Heidenreichらの論文 (Heidenreichらの論文, J Am Coll Carジオール 2004;43 : 1019-26)は、1% LVSDの全個体群罹患率で、B-型ナトリウム利尿ペプチドを用いた選別のための費用対効果が、その制限された特異性でさえ存在することを示唆する。全てのLVSD既知患者を除外した本研究は、スクリーニングを正しいとし得るレベルで、全個体群罹患率2.1%を検出した。N-BNP特異性を改善し得る任意のスクリーニング戦略は、さらにコストを低下し得る。
LVSDのスクリーニングにおいての関心は、B-型ナトリウム利尿ペプチド試験の導入により促進されていることである(McDonaghらの論文, Lancet 1998;351:9-13;Hobbsらの論文, BMJ 2002;324: 1498-1500;Ng LLらの論文, Eur J Heart Failure 2003;5: 775-782;Vasanらの論文, JAMA 2002;288: 1252-1259)が、その効果は、幾つかの研究において、比較的低特異性のために疑問がある(Vasanらの論文, JAMA 2002;288: 1252-1259)。費用対効果分析において、Heidenreichらの論文 (Heidenreichらの論文, J Am Coll Carジオール 2004;43 : 1019-26)は、1% LVSDの全個体群罹患率で、B-型ナトリウム利尿ペプチドを用いた選別のための費用対効果が、その制限された特異性でさえ存在することを示唆する。全てのLVSD既知患者を除外した本研究は、スクリーニングを正しいとし得るレベルで、全個体群罹患率2.1%を検出した。N-BNP特異性を改善し得る任意のスクリーニング戦略は、さらにコストを低下し得る。
心血管系疾患に関連したマーカ(MPO及びCRP)を使用することにより、LVSDスクリーニングにおいてN-BNPと比較してMPOの特異性増加を示した。CRPは、N-BNPと同様に振舞うことはなかった。大部分健康なこの個体群において、血漿MPO及びCRPの唯一の独立予測因子は、LVSDの存在であった。ロジスティックモデルは、3マーカ全ての独立的な診断役割を確認し、これは、IHDの存在及び男性などの因子により改善され得る。この最終的なロジスティックモデルを使用することにより、有意な節約を達成することができる(全個体群に心エコー図スキャンを実施することに対して三分の一、又は初期スクリーニング試験として血漿N-BNP単独を、陽性試験を有する対象の心エコー図とともに実施することに対して半分に下げる)。しかし、最も有意な節約は、初期スクリーニング試験として血漿MPOを使用すること、続いてN-BNP及びCRPを、これらのマーカ、IHD暦、及び性別とともにロジスティックモデルにおいて使用することから生じる。後者の2つの因子は、容易に利用可能であり、LVSD診断の特異性を改善する。
(結論)
本群集団において、CRP及びMPOなどの炎症性マーカの分析は、以前に診断未確定であったLVSDの検出において、血漿N-BNPの特異性を改善した。スクリーニング計画のコストは、初期スクリーニング試験として血漿MPOを使用し、次に性別及びIHD暦を用いたロジスティックモデルにおいてCRP及びN-BNPを使用することにより最小化することができる。前記戦略は、2〜3倍の血漿N-BNPを用いる、証明された費用対効果スクリーニング戦略のコストを低下させる。
本群集団において、CRP及びMPOなどの炎症性マーカの分析は、以前に診断未確定であったLVSDの検出において、血漿N-BNPの特異性を改善した。スクリーニング計画のコストは、初期スクリーニング試験として血漿MPOを使用し、次に性別及びIHD暦を用いたロジスティックモデルにおいてCRP及びN-BNPを使用することにより最小化することができる。前記戦略は、2〜3倍の血漿N-BNPを用いる、証明された費用対効果スクリーニング戦略のコストを低下させる。
(図面の説明)
本発明は、下記における添付図面を参照してさらに記載されるであろう。
図1a〜cは、それぞれ、正常及びLVSD対象における血漿MPO、CRP、及びN-BNPのボックスプロットである。
図2aは、LVSD診断におけるN-BNP、CRP、及びMPOの受信者動作特性(ROC)曲線である。ロジスティックモデル1(N-BNP, CRP, MPO)、及び2(N-BNP, CRP, MPO, IHD病歴, 性別)をプロットした。図2bは、血漿MPO>33.9 ng/mlの対象に関する、LVSD診断におけるN-BNP及びCRPのROC曲線である。また、N-BNP, CRP, IHD病歴, 性別を用いるロジスティックモデルをプロットした。
図3は、ヒトMPO(配列番号:1)のアミノ酸配列を示す。
図4は、プロBNP(配列番号:2〜4, それぞれ出現順)のアミノ酸配列を示す。
図5は、CRP(配列番号:5)のアミノ酸配列を示す。
本発明は、下記における添付図面を参照してさらに記載されるであろう。
Claims (45)
- 哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断の方法であって:前記哺乳動物対象からの体液試料中の第1マーカのレベルを測定することを含み、ここで前記第1マーカがミエロペルオキシダーゼ(MPO)である、前記方法。
- 前記体液が血漿である、請求項1記載の方法。
- 前記第1マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第1マーカのレベルと比較する、請求項1記載の方法。
- 心不全の非存在を示す第1マーカのレベルが、心不全のない1以上の哺乳動物対象からの該第1マーカのレベルである、又は心不全のない哺乳動物対象の該第1マーカの以前に測定された参照範囲である、請求項3記載の方法。
- 前記第1マーカのレベルが、前記試料を前記第1マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも1種との間で生じる結合を測定することにより測定される、請求項1記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項5記載の方法。
- 心不全を示す第2マーカのレベルを測定することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記第2マーカが、ナトリウム利尿ペプチドである、請求項7記載の方法。
- 前記ナトリウム利尿ペプチドが、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、又はN−末端プロ脳ナトリウム利尿ペプチド(N-BNP)である、請求項8記載の方法。
- 前記第2マーカが、C-反応性タンパク質(CRP)である、請求項7記載の方法。
- 前記第2マーカがウロテンシンである、請求項7記載の方法。
- 前記第2マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第2マーカのレベルと比較する、請求項7記載の方法。
- 心不全の非存在を示す第2マーカのレベルが、心不全のない1以上の哺乳動物対象からの該第2マーカのレベルである、又は心不全のない哺乳動物対象の第2マーカの以前に測定された参照範囲である、請求項12記載の方法。
- 前記第2マーカのレベルが、前記試料を前記第2マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも1種との間で生じる結合を測定することにより測定される、請求項7記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項14記載の方法。
- 請求項1記載の方法を実行するためのキット。
- 哺乳動物対象の心不全の段階又は重症度を測定するか、心不全発症の危険のある哺乳動物対象を識別するか、又は心不全哺乳動物対象に投与される治療効果をモニタリングするための、哺乳動物対象における心不全のスクリーニング、診断、又は予後診断用のキットであって:
前記哺乳動物対象からの体液試料を取得するための説明書;及び
該試料中のミエロペルオキシダーゼ(MPO)のレベルを測定するための1以上の試薬を含む、前記キット。 - 前記体液が血漿である、請求項17記載のキット。
- 前記1以上の試薬が、前記第1マーカに特異的に結合する抗体を含む、請求項17記載のキット。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項19記載のキット。
- 心不全を示す第2マーカのレベルを測定するための1以上の試薬をさらに含む、請求項17記載のキット。
- 前記第2マーカがナトリウム利尿ペプチドである、請求項21記載のキット。
- 前記ナトリウム利尿ペプチドが、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、又はN-末端プロ-脳ナトリウム利尿ペプチド(N-BNP)である、請求項22記載のキット。
- 前記第2マーカが、C-反応性タンパク質(CRP)である、請求項21記載のキット。
- 前記第2マーカを測定するための1以上の試薬が、該2マーカに特異的に結合する抗体を含む、請求項21記載のキット。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項25記載のキット。
- 前記第2マーカがウロテンシンである、請求項21記載のキット。
- 哺乳動物対象からの体液試料中の第1マーカのレベルを測定することを含む、哺乳動物対象の健康をモニタリングする方法であって、前記第1マーカがミエロペルオキシダーゼ(MPO)である、前記方法。
- 前記体液が血漿である、請求項28記載の方法。
- 前記第1マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第1マーカのレベルと比較する、請求項28記載の方法。
- 前記第1マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の心不全の悪化を示す第1マーカのレベルと比較する、請求項28記載の方法。
- 前記第1マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の心臓突然死を示す第1マーカのレベルと比較する、請求項28記載の方法。
- 前記第1マーカのレベルを、心不全であると以前に測定された哺乳動物対象の治療への応答を示す第1マーカのレベルと比較する、請求項28記載の方法。
- 心不全の非存在を示す第1マーカのレベルが、心不全のない1以上の哺乳動物対象からの該第1マーカのレベルである、又は心不全のない哺乳動物対象の該第1マーカの以前に測定された参照範囲である、請求項30記載の方法。
- 前記第1マーカのレベルが、前記試料を該1マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも1種との間で生じる結合を測定することにより測定される、請求項28記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項35記載の方法。
- 心不全を示す第2マーカのレベルを測定することをさらに含む、請求項28記載の方法。
- 前記第2マーカが、ナトリウム利尿ペプチドである、請求項37記載の方法。
- 前記ナトリウム利尿ペプチドが、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、又はN-末端プロ-脳ナトリウム利尿ペプチド(N-BNP)である、請求項38記載の方法。
- 前記第2マーカが、C-反応性タンパク質(CRP)である、請求項37記載の方法。
- 前記第2マーカが、ウロテンシンである、請求項37記載の方法。
- 前記第2マーカのレベルを、心不全の非存在を示す第2マーカのレベルと比較する、請求項37記載の方法。
- 心不全の非存在を示す第2マーカのレベルが、心不全のない1以上の哺乳動物対象からの該第2マーカのレベルである、又は心不全のない哺乳動物対象の該第2マーカの以前に測定された参照範囲である、請求項42記載の方法。
- 前記第2マーカのレベルが、前記試料を前記2マーカに特異的に結合する抗体と接触させること、及び該抗体と該試料中の少なくとも1種との間で生じる結合を測定することにより測定される、請求項37記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項44記載の方法。
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JP2010537216A (ja) * | 2007-08-30 | 2010-12-02 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 心疾患に関連する又は関連しないgdf−15の上昇の区別のための手段及び方法 |
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US20060183174A1 (en) | 2006-08-17 |
EP1853923A2 (en) | 2007-11-14 |
WO2006117688A2 (en) | 2006-11-09 |
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