KR100875301B1

KR100875301B1 - 대사성 질환의 진단 마커로 유용한 베스핀

Info

Publication number: KR100875301B1
Application number: KR1020080041082A
Authority: KR
Inventors: 윤병수; 마티아스 블뤼허
Original assignee: 주식회사 에디포젠
Priority date: 2008-05-01
Filing date: 2008-05-01
Publication date: 2008-12-23

Abstract

본 발명은 대사성 질환에 특이적인 바이오 마커인 베스핀(Vaspin: visceral adipose tissue-derived serpin)에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 대사성 질환인 비만 또는 심혈관질환의 진단 마커, 및 비만 또는 당뇨병의 운동개선 효과의 새로운 진단 마커인 베스핀에 관한 것이다. 본 발명은 혈중 베스핀의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 비만 또는 심혈관질환의 진단 마커 검출용 조성물, 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 진단 마커 검출용 조성물, 및 이를 이용한 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 혈중 베스핀의 농도 측정을 이용한 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

베스핀, 대사성 질환, 비만, 당뇨병, 심혈관 질환, 인슐린 민감성, 진단 마커

Description

대사성 질환의 진단 마커로 유용한 베스핀{Vaspin, a biomarker for diagnosing metabolic disease}

대사성 질환(Metabolic Disease)은 비만, 당뇨, 고중성지방혈증, 고혈압, 심혈관질환 및 혈액응고 이상과 같은 위험인자가 함께 나타나는 증후군을 의미한다. 2001년에 공표된 미국 NCEP(National Cholesterol Education Program)의 ATP Ⅲ 에 따르면, ① 허리둘레가 남자 40인치(102 cm), 여자 35인치(88 cm) 이상인 복부 비만, ② 중성지방(triglycerides) 150 mg/dL 이상인 고중성지방혈증, ③ HDL 콜레스테롤이 남자 40 mg/dL, 여자 50 mg/dL 이하, ④ 혈압 130/85 mmHg 이상인 고혈압, ⑤ 공복혈당(fasting glucose)이 110 mg/dL 이상 등의 다섯 가지 위험인자 중 한 환자가 세 개 이상을 나타낼 경우 대사성 질환으로 판정하게 된다.

비만 중 특히 복부 비만은 이러한 대사성 질환의 주원인이 되는데, 이것은 내장 기관에 증식되고 있는 지방세포가 더욱 직접적으로 대사에 영향을 주기 때문이다(Bjorntorp P: Metabolic implication of body fat distribution. Diabetes Care14: 1132 1143, 1991, Frayn KN: Visceral fat and insulin resistance-causative or correlatives British J Nutr 83 (Suppl 1): 71 77, 2000 , and Wajchenberg BL: Subcutaneous and visceral adipose tissue: their relation to the metabolic syndrome. Endocr Rev 21: 697 738, 2000).

1997년 세계보건 기구(WHO)로부터 비만은 더 이상 라이프스타일이 아니고 대사성 질환 및 암의 원인이 되는 중요 질병으로 규정된 후, 현재 비만은 전 세계에서 인류 질병의 최대 요인으로 인식되고 있다. 비만은 지방세포 수의 증가 및 세포 부피의 확장으로 정의되는데, 지금까지 지방세포는 음식 섭취 후 잉여에너지를 지방으로 변화시켜 저장한 후 필요시 당 및 지방산으로 변화시켜 에너지 균형을 맞추는 수동적인 세포로 알려져 왔지만, 2000년 이후 여러 임상연구, 분자 생물학, 세포생물학 연구를 통해 지방세포는 우리 몸속의 당대사를 조절하는 호르몬 인슐린의 작용을 억제 혹은 활성화시키는 여러 가지 호르몬을 분비하는 강력한 내분비 세포 로 밝혀지고 있어서, 지방세포(adipocyte)가 분비하는 전체 호르몬, 즉 “에디포카인(adipokine)”에 대한 연구는 현재 비만 및 제2형 당뇨병 연구의 중심을 차지하고 있다.

에디포카인(adipokine)의 복부지방 저장-특이적 분비는 복강내 지방축적의 부작용을 부분적으로 설명할 수 있다. 단백질 또는 mRNA 발현에서 이러한 지방 축적의 차이는 렙틴(leptin)을 포함한 몇몇 에디포카인(Van Harmelen V et al., Leptin secretion from subcutaneous and visceral adipose tissue in women. Diabetes 47: 913 917, 1998, Montague CT et al., Depot-related gene expression in human subcutaneous and omental adipocytes. Diabetes 47: 1384 1391, 1998), 플라스미노겐 활성자 억제자-1 (plasminogen activator inhibitor-1) (Alessi MC et al., Production of plasminogen activator inhibitor 1 by human adipose tissue: possible link between visceral fat accumulation and vascular disease. Diabetes 46: 860 867, 1997), 레티놀 결합 단백질4 (RBP4) 및 인터루킨-6(Fried SK, Bunkin DA, Greenberg AS: Omental and subcutaneous adipose tissue of obese sunjects release interleukin 6: depot difference and regulation by glucocorticoid. J Clin Endicrinol Metab 83: 847 850, 1998)에 대해 보고되었다.

한편, 베스핀(Vaspin: visceral adipose tissue-derived serpin)은 비만과 인슐린 플라즈마 농도가 최고에 도달한 연령의 OLETT(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) 래트의 복부지방 세포에서 분리되었다(Hida K et al.,: Visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor: A unique insulin-sensitizing adipocytokine in obesity. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 10610-10615, 2005). 그러나, 인간 비만 및 그와 관련된 대사성 질환인 제2형 당뇨병 및 심혈관질환에서의 베스핀 혈청 농도의 조절에 관하여는 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 인간 혈청 베스핀의 농도를 측정하기 위한 ELISA를 개발하였으며, 이를 이용하여 인간 혈청 속의 베스핀 농도를 측정함으로써 베스핀이 비만 또는 심혈관질환의 진단마커로서 기능할 수 있음을 확인하였다. 또한 다양한 내당능을 가지는 피실험자들을 대상으로 4 주간의 집중 운동 기간을 거친 후 이들의 혈청 내 베스핀의 농도를 증가한 결과, 정상 내당능(NGT), 손상 내당능(IGT) 및 제2형 당뇨병(T2D)을 가진 사람 모두에서 혈청 내 베스핀의 농도가 현저히 증가하고 또한 이러한 증가는 손상 내당능 및 제2차 당뇨병을 가진 환자의 인슐린 민감성의 증가와도 유의한 상관관계를 가짐을 확인함으로써, 베스핀이 비만 및 당뇨병의 운동효과개선의 진단 마커로 사용할 수 있고, 나아가 베스핀이 비만, 심혈관질환 및 당뇨병 치료제를 스크리닝하는데 사용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 대사성 질환에 특이적인 새로운 바이오 마커를 제공하는 것이다.

구체적으로, 본 발명의 하나의 목적은 혈중 베스핀의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 비만 또는 심혈관질환의 진단 및 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과를 진단하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 베스핀의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 비만 또는 심혈관질환의 진단 및 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 대사성 질환인 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 혈청 베스핀의 농도를 측정하는 것을 포함하는, 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 대사성 질환의 새로운 바이오 마커에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 비만 또는 심혈관질환의 진단 및 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 새로운 진단 마커인 베스핀(Vaspin: Visceral adipose tissue-derived serpin)에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 비만 또는 심혈관질환의 발생 여부를 확인하는 것이며, 보다 광범위하게는, 적절한 치료 물질의 투여 또는 운동 등에 의한 비만 및 당뇨병의 치료 효과까지 진단하는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 구체적인 실험에 의하면, 베스핀의 혈청 농도는 마른 사람 또는 운동 선수들의 경우 낮은 반면, 체중지수(Body Mass Index: BMI)에 비례하여 증가하였다. 따라서, 베스핀은 비만의 진단 마커로 유용함을 알 수 있다.

또한 본 발명에 따른 구체적인 실험에 의하면, 베스핀의 혈청 농도는 죽상 동맥경화에 기인한 내경동맥(Arteria carotis interna) 협착 환자의 경우에 무증상 환자에 비하여 현저하게 낮았고, 체내 염증 지표이자 심혈관계 질환의 지표인 고감도 C-반응성 단백질(high sensitivity C-reactive protein, hsCRP)의 수준과 반대양상을 나타냈다. 따라서, 베스핀은 동맥경화성 심혈관질환의 진단 마커로 유용함을 알 수 있다.

또한 본 발명에 따른 구체적인 실험에 의하면, 정상 내당능(NGT), 손상 내당능(IGT) 및 제2형 당뇨병(T2D)을 가진 사람들 모두에서 4 주간의 집중 운동 프로그램을 완성한 후의 혈청 베스핀의 농도는 현저히 증가함을 알 수 있었다. 즉, 본 발명에 따르면, 지방세포에 의해 분비되는 아디포카인의 일종인 베스핀은 비만의 진단 마커로 작용할 수 있을 뿐만 아니라, 운동이나 약물 등에 의한 비만 또는 당뇨병 치료 효과를 확인할 수 있는 마커로도 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "대사성 질환"이란 비만, 당뇨, 고중성지방혈증, 고혈압, 심혈관질환 및 혈액응고 이상과 같은 위험인자가 함께 나타나는 증후군을 의미하며, 비만은 대사성 질환의 유발에 있어 가장 중요한 핵심 요소이다. 즉, 대개 비만이 원인이 되어 동맥경화가 빨리 진행되어 동맥경화성 심혈관질환을 동반하게 되고, 또한 비만으로 인해 인슐린 저항성이 증가하여 당뇨를 유발하게 된다.

본 발명에서 용어 “비만(obesity)"은 지방세포 수의 증가 및 세포 부피의 확장으로 정의되는 질병으로서, 바람직하게는 당뇨, 고중성지방혈증, 고혈압, 심혈관질환, 혈액응고 이상신장질환, 안질환 및 족부감염 등 대사성 질환의 주원인이 되는 복부비만을 의미한다. 일반적인 비만의 경우 외형적인 기준에 의해서도 쉽게 판단 가능한 반면, 복부비만의 경우 외형적인 기준만으로는 쉽게 판단할 수 없는 경우가 많다. 본 발명은 혈중 베스핀 농도에 따라 이러한 복부비만 여부를 쉽게 판단할 수 있다.

본 발명에서 용어 "심혈관질환"은 일반적 동맥경화증, 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과, 뇌졸중 및 말초혈관질환 등의 혈관질환을 포함하는 질환으로서, 광범위하게는 허혈성 심혈관질환을 의미한다. 이러한 심혈관 질환은 죽상동맥경화에 의하여 동맥의 협착됨(혈관의 좁아짐)에 따라 혈액을 통한 영양분과 산소의 공급이 부족하게 되어 발생한다. 본 발명은 혈중 베스핀 농도에 따라 이러한 심혈관질환의 발생 여부를 쉽게 판단할 수 있다.

본 발명에서 용어 “당뇨병(diabetes)”이란 인슐린이 부족하거나 인슐린에 대한 감수성이 떨어져 탄수화물대사에 이상이 생기는 질환으로서, 췌장에서의 인슐린 분비량이 적어 발생하는 제1형 당뇨병(인슐린 의존성 당뇨병: Insuline-dependent diabetes mellitus: IDDS)과 인슐린에 대한 조직의 거부반응에서 비롯되는 제2형 당뇨병(인슐린 비의존성 당뇨병: Non-insulin-dependent mellitus: NIDDM)으로 나눌 수 있다. 전체 당뇨병 중 90% 이상이 제2형 당뇨병이다. 제2형 당뇨병은 유전 및 비만, 그 중에서도 특히 복부비만(허리둘레:엉덩이둘레의 비율이 85:100 이상인 상태)과 관련이 높은 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서 당뇨병이란 바람직하게는 제2형 당뇨병을 의미한다. 본 발명에 따르면 당뇨병 환자가 운동을 할 경우 운동개선효과와 혈중 베스핀의 농도가 유의한 상관관계를 보였으므로, 혈중 베스핀 농도를 측정함으로써 당뇨병 환자의 운동개선효과를 쉽게 판단할 수 있다.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도가(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명에 따른 비만 또는 심혈관질환의 진단 마커, 및 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 진단 마커인 베스핀은 비만, 동맥경화, 인슐린 민감성 및 내당성 등 넓은 범위를 포함하는 다수의 피검자로부터 높은 신뢰성을 가지고 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병 등 대사성 질환의 예후 인자로 사용될 수 있음이 입증되었 다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 혈중 베스틴의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 비만 또는 심혈관질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 혈중 베스틴의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 진단용 조성물에 관한 것이다.

종래 당뇨병의 예후 진단의 가장 일반적인 방법은 혈중 글루코스의 양, 즉, 혈당치를 측정하는 방법이었다. 본 발명의 경우, 이러한 종전의 혈당치 측정 방법과 함께 또는 혈당치 측정과 무관하게, 피검자의 혈액으로부터 베스핀의 농도를 측정함으로써 비만 또는 심혈관질환의 진단 또는 예후를 측정할 수 있으며, 나아가 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과를 진단할 수 있다. 이와 같이 혈중 베스핀의 농도를 측정하는 제제로는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에서, “항체”란 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 인간 베스핀에 특이적인 단클론항체 및 다클론항체를 제조하였으며, 이들 항체를 이용한 샌드위치-ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 방법에 의해 혈중 베스핀 농도를 측정하였다.

상기한 바와 같이 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병 등 대사성 질환의 마커 단 백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 인간 베스핀의 일부 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 벡터에 클로닝한 후 토끼에 면역화하여 다클론항체를 제조하였다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 인간 베스핀에 특이적인 단클론항체를 제조하기 위하여, 인간 베스핀의 성숙 폴리펩타이드로 생각되는 부분을 코딩하는 유전자를 벡터에 클로닝한 후 Balb/c 마우스를 면역화하여 단클론항체를 제조하였다. 상기 방법으로 얻어진 단클론항체를 분비하는 하이브리도마를 2008년 1월 20일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures,대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 수탁번호 KCTC 11270BP로 기탁하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따라 제조된 인간 베스핀에 대한 단클론항체는 마우스 또는 래트의 혈청에서 얻은 혈청 베스핀은 측정할 수 없었으며, 다른 서 핀(serpine) 단백질들에 대한 교차 반응 실험에서도, 본 발명에 따른 인간 베스핀에 대한 단클론항체는 이들 단백질과는 반응하지 않음으로써 높은 특이성을 확인할 수 있었다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또 하나의 양태에서는, 본 발명은 혈중 베스틴의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 비만 또는 심혈관질환의 진단, 및 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 진단용 키트에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

구체적인 일 양태로서, 상기 진단 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항 체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 대사성 질환인 비만 또는 심혈관질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 베스핀에 특이적인 항체를 비만 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계, 및 상기 항원-항체 복합체의 형성량을 정상 대조구 시료의 형성량과 비교하는 단계를 포함하는, 비만 또는 심혈관질환의 진단 마커 베스핀을 검출하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 베스핀에 특이적인 항체를 비만 또는 당뇨병 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계, 및 상기 항원-항체 복합체의 형성량을 정상 대조구 시료의 형성량과 비교하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 진단 마커 베스핀을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “생물학적 시료”란 마커 단백질인 베스핀의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 혈액이다. 생물학적 시료에서 단백질을 분리 하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏(Western blot), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩(protein chip) 등의 방법이 있으며, 본 발명은 이들로 제한되지 않는다. 이들 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 이러한 복합체 량을 비교함으로써 비만 또는 심혈관질환의 발병 여부 및/또는 이들 질환의 치료 효과를 판단할 수 있다.

본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 베스핀 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)₈ , [Os(bpy) 3 ] ²⁺ , [RU(bpy) ₃ ] ²⁺, [MO(CN) ₈ ] ^4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³1I , ¹⁸⁶Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 수준의 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반 응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서도 ELISA를 이용하여 혈중 베스핀의 농도를 측정하였으며, 그 결과, 마른 사람에 비해 비만인 사람에게서 혈중 베스핀의 농도가 높게 나타났으며, 베스핀의 농도와 체중지수(BMI) 사이에는 유의한 상관 관계가 있음을 확인하였다(도 2). 이로써, 본 발명에 따른 혈중 베스핀의 농도를 측정하는 것을 포함하는 진단 방법은 비만의 진단 및 예후 측정이 가능함을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 정상 내당능(NGT), 손상 내당능(IGT) 및 제2형 당뇨병(T2D)을 가지는 환자들에 대해 4 주간의 집중 운동 프로그램을 완수하도록 수행한 후 이들의 혈중 베스핀 수준을 측정한 결과, 세 그룹 모두에서의 혈중 베스핀 농도가 현저한 수준으로 증가함을 알 수 있었다(도 3). 이로써, 본 발명에 따른 혈중 베스핀의 농도를 측정하는 것을 포함하는 진단 방법은 운동이나 약물 등에 의한 비만 또는 당뇨병의 개선 효과를 확인할 수 있는 마커로도 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

단백질 수준을 측정하는 또 하나의 바람직한 방법은, 마커 단백질에 대한 하 나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 비만 또는 심혈관질환의 발병 또는 진행 여부를 확인하거나 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과를 확인할 수 있다.

단백질 수준을 측정하는 또 하나의 바람직한 방법은, 마커 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 비만 또는 심혈관질환의 발병 또는 진행 여부를 확인하거나 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과를 확인할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 대사성 질환인 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 혈청 베스핀의 농도를 측정하는 것을 포함하는, 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 정상 내당능(NGT), 손상 내당능(IGT) 및 제2형 당뇨병을 가지는 피검자들이 4 주간 집중적인 운동 프로그램을 수행한 후 이들의 혈중 베스핀 농도를 측정한 결과, 이들 모두의 혈액 내 베스핀의 농도가 현저히 증가하였으며, 이는 또한 손상 내당능 및 제2형 당뇨병을 가지는 환자의 인슐린 민감성을 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 실험 결과는, 베스핀이 운동에 반응하여 BMI를 감소시키고 인슐린 저항성의 개선을 조절하는 것과 상당한 관련이 있음을 시사한다. 마찬가지로, 운동에 반응한 혈중 베스핀 농도의 변화 뿐만 아니라 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병 등 대사성 질환의 치료제로 작용할 수 있는 후보 물질의 투여에 따른 혈중 베스핀 농도의 변화를 측정함으로써, 유효한 대사성 질환 치료제를 스크리닝할 수 있다.

구체적으로, 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 베스핀의 농도의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 예컨대, 베스핀의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 증가시키는 물질은 비만, 심혈관질환 또는 당뇨병의 치료제로서 선택할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 비만 또는 심혈관질환의 진단 및 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과를 진단할 수 있는 새로운 진단 마커를 제공함으로써, 현대인에 있어 중요한 질병 중 하나인 비만 또는 심혈관질환의 조기 발견 및 예후 측정에 유용할 뿐만 아니라, 비만, 심혈관질환 및 당뇨병 등 대사성 질환의 치료제의 스크리닝에도 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 및 방법( Materials and Methods )

실시예 1. 단면연구( Cross - sectional study )

비만, 인슐린 민감성, 및 내당능의 넓은 범위를 나타내기 위해 독일 라이프찌히(University of Leipzig, Germany) 대학 의학과에서 인슐린 저항성 연구의 관점에서 모집한 약 700 명의 피실험자 중에서 선택된 백인 남성 89명(n=89)과 백인 여성 98명(n=98)을 선택하였다. 이들의 나이는 17~79세, 체중지수(BMI)는 19.6에서 61.5 kg/m²의 범위를 갖는다.

피실험자는 결과적으로 ADA(American Dabetes Association)-Criteria에 따른 75g의 경구 내당능 테스트(oral glucose tolerance test: OGTT)를 기초로 하여 정상 내당능(NGT), 손상 내당능(IGT), 및 제2형 당뇨병(T2D)의 그룹으로 나누었다. NGT 피실험자는 공복혈당(fasting plasma glucose) <6.0mmol/ℓ 및 120분 혈당치 <7.8mmol/ℓ로 결정되었고, IGT 피실험자는 공복혈당 <6.0mmol/ℓ 및 120분 혈당 >7.8mmol/ℓ 및 <11.1mmol/ℓ로 정의되었다. T2D 피실험자는 공복혈당 >7.0mmol/ℓ 및/또는 120분 OGTT 당 >11.1mmol/ℓ로 정해졌다.

IGT(n=20) 피실험자는 중재 연구(Interventional study)에 포함된 반면, 단면연구에는 NGT와 T2D를 갖는 개체만이 포함되었다. 모든 피실험자들은 다음 포함 기준을 충족하였다: 1) 백혈구 계수 >7000 Gpt/ℓ, C-반응성 단백질(CrP)> 5.0mg/dℓ 또는 감염의 의학적 신호에 의하여 결정되는 급성 또는 만성 염증 질병이 없을 것, 2) 글루탐산 디카복실라아제 (GAD)에 대한 탐지가능한 항체가 없을 것, 3) 수축기 혈압(SBP)이 <140 mmHg 및 이완기 혈압(DBP)이 <85 mmHg인 것과 같이 고혈압 병력이 없을 것, 4) 심장혈관 또는 말초 동맥 질환의 임상적 증거가 없을 것, 5) 갑상선 장애 없을 것, 6) 알코올 또는 약 남용자가 아닐 것, 및 7) 임신하지 않았을 것.

본 발명은 라이프찌히 대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며, 모든 피 실험자들은 본 연구를 진행하기 전에 동의서를 작성하였다.

실시예 2. 중재 연구( Interventional Study )

NGT(n=20, 남성 9명, 여성 11명), IGT(n=20, 남성 9명, 여성 11명), 및 T2D(n=20, 남성 11명, 여성9명)인 60명 피실험자는 주당 3일씩 지휘된 운동 트레이닝을 60분씩 수행하였다. 간단히 설명하면, 각각의 운동 시간은 자전거 또는 달리기 20분, 수영 20분, 및 준비운동/마무리운동을 20분씩 포함한다. 모든 피실험자는 의지고갈 단계까지 단계적 자전거-에르고미터(ergometer) 테스트를 완료하고 자동 열린 흐름가스 분석 시스템으로 운동 4주 후와 기준선에서 최대 산소 흡입량을 측정하였다. 최대 산소 흡입/분에 도달했을 때를 최대산소흡입량(VO₂max)이라고 정의하였고, 그 후 피실험자들은 자전거-에르고미터 테스트 동안 개개의 최대 심박수의 70-80 %로 정의되는 각각의 준 최대 심박수에서 훈련하였다. 기준값과 운동 4주 후(마지막 운동시간 48시간 후), 공복 상태에서 혈액 샘플을 얻고 인체측정변수 측정을 실시하였다.

실시예 3. 내용물의 분석, 측정 및 경구 내당능 검사

모든 기준 혈액 샘플은 하룻밤이 지난 후인 오전 8시에서 10시 사이에 모아졌다. 혈장 인슐린은 IMMULITE 자동 분석기(Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA)를 위한 효소 면역계량검정(enzyme immunometric assay)으로 측정하였다.

체중지수(BMI)는 체중을 신장의 제곱으로 나눠서 계산하였다. 허리 및 엉덩이 둘레를 측정하고 엉덩이에 대한 허리의 비율(WHR)을 계산하였다.

체지방 백분율은 이중 엑스선 흡수 계측법(dual X-ray absorptiometry: DEXA)에 의해 측정하였다.

OGTT 실시 3 일 전에, 환자들은 식사 방법으로 고 탄수화물 식사를 하였다. OGTT는 75g 표준화 당 용액(Glucodex Solution 75g; Merieux, Montreal, Canada) 섭취 후 하룻 밤이 지난 후에 실시하였다. 혈장 당 농도의 측정을 위해 정맥 혈액 샘플을 0, 60, 120 분에 채취하였다.

인슐린 민감성은 정상혈당클램프법(euglycemic-hyperinsulinemic clamp method)(DeFronzo RA et al., Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol 237: 214 223, 1979, and Bluher M et al., Relation between glycaemic control, hyperinsulinaemia and plasma concentrations of soluble adhesion molecules in patients with impaired glucose tolerance or type II diabetes. Diabetologia 45: 210 216, 2002)으로 측정하였다.

실시예 4. 베스핀 ELISA 개발과 베스핀 혈청 농도의 측정

인체 복부지방 cDNA 라이브러리로부터 중합효소 연쇄반응(polymerase chanin reaction: PCR)에 의해 인간 베스핀을 코딩하는 유전자를 증폭하였다. HEK(인간 태아 신장: Human Embryonic Kidney) 293 세포에서 발현된 베스핀을 재조합 인간 베스핀을 생산하기 위해 사용하였지만, 인간 베스핀-특이적인 단클론항체(MAb) 및 다클론항체(PAb)는 표준 Escherichia coli(E. coli) 발현된 베스핀을 면역원으로 사용하였다.

HEK 293 세포와 E. coli에서 재조합 베스핀 단백질을 만들기 위해, 인간 베스핀의 아미노산 서열(NP_776249) 중 Leu²¹ 부터 Lys⁴¹⁴까지의 성숙 폴리펩타이드로 생각되는 부분을 포함하는 유전자 부분을 증폭하고 적당한 제한효소로 소화시킨 뒤, pAGNF(에디포젠, 한국) 및 pET21a(노바젠, 메디슨, WI) 벡터 둘 다에 각각 클로닝하였다. pAGNF 및 pET21a 의 개열지도는 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.

pAGNF는 in-house 진핵 세포 벡터로서, 이의 발현은 CMV 초기 프로모터에 의하여 유도되고 분비는 PAI-I 리더 펩타이드에 의해 용이해진다. FLAG tag은 성숙 인간 베스핀 펩타이드에 포함되어 있다. FLAG-tagged 및 His-tagged된 단백질을 각각 anti-FLAG- 및 Ni-sepharose 컬럼을 통해 정제하였다. 엔도톡신은 디톡시젤(Detoxigel) (Pierce, Rockford, IL)을 사용한 두 개의 연속적인 컬럼 크로마토그래피를 통해 제거하였다.

다클론항체(PAb) 및 단클론항체(MAb)는 재조합 His-tagged 인간 베스핀을 사용하여 일반적인 방법에 따라 각각 토끼와 Balb/c 마우스의 면역화에 의하여 생산되었다. 상응하는 항체 단편은 면역된 동물의 혈청과 복수로부터 얻어졌다. 항체 제조에 관한 보다 자세항 사항은 실시예 5에 기재하였다.

FLAG-tagged 베스핀을 ELISA 표준을 위해 사용하였다. 인간 베스핀의 성숙 펩타이드(NP_776249, 아미노산 Leu21~Lys414)를 코딩하는 DNA 서열은 N-말단에 FLAG(DYKDDDDK)로 태그되었다. 이 재조합 단백질은 다양하게 희석되어 표준 단백질을 제조하는데 사용되었다.

샌드위치 ELISA 형태는 한 쌍의 MAb와 PAb를 사용하여 디자인되었다. 1:5로 희석된 인간 혈청 100 ㎕을 인간 베스핀 특이 MAb 5 ㎍/㎖로 코팅되어 있는 각 웰에 가하여 37 ℃에서 한 시간 동안 배양한 후, 0.05 % Tween-20이 들어있는 인산염 완충 식염수(phosphate buffered salin: PBST)로 3번 세척하였다. 각 웰에 5 mg/ml 의 인간 베스핀 다클론 항체를 100㎕씩 가하고, 37 ℃ 에서 한 시간 동안 2차 항체 반응을 수행한 후 PBST로 세 번 세척하였다. PBS로 1:1000 희석한 스트렙타비딘(streptavidin)이 부착된 호스라디시 페록시다제(HRP:horseradish peroxidase)(Zymed, South San Francisco, CA) 및 기질로서 2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조 티아졸린)-6-술폰산(ABTS, 2,2'-azino-bis(2-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))(Pierce, Rockford, IL)를 사용한 비색반응(colorimetric reaction)을 20분간 실시하고, 450 nm에서 광학밀도를 측정하였다. 이의 민감도는 12 pg/㎖이다.

Intra-assay의 변화계수(%) 측면에서의 ELISA 시스템의 정밀도는 1~3.8% 사이인 반면(표 1), inter-assay는 3~9%이다(표 2). 피크 회복(spike recovery)(표 3)과 직선성(linearity)(표 4)은 각각 90-107% 와 100-109%의 범위 내에 있다. 특이성(specificity)은 인간 에디포넥틴, RBP 4(Retinol Binding Protein 4), visfatin, PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1), TNF-α(tumor necrosis factor-α), RELM-β(resistin-like molecule-β), 지방산 부착 단백질 4 (FABP 4), 안지오포이에틴-유사 단백질 6(angiopoietin-like protein 6), 글루타치온 페록시다제 3(glutathione peroxidase 3) 및 마우스 레시스틴(resistin)을 이용하여 결정하였다(표 5).

베스핀 ELISA 민감도

시료	평균 (ng/㎖)	표준편차 (ng/㎖)	변동계수(%)
1	0.594	0.008	1.310
2	0.642	0.025	3.846
3	0.634	0.021	3.272
4	0.710	0.026	3.630
5	3.352	0.058	1.743

베스핀 ELISA 민감도

시료	평균 (ng/㎖)	표준편차 (ng/㎖)	변동계수(%)
1	0.674	0.040	5.929
2	0.736	0.024	3.267
3	0.656	0.024	3.693
4	0.097	0.009	9.064
5	3.636	0.302	8.316

베스핀 ELISA 회복

시료 번호	평균 회복율(%)	범위(%)
1	97.70	94-101
2	100.07	97-103
3	100.82	98-104
4	99.06	90-107

베스핀 ELISA 직선성

시료 번호	혈청 희석	기대값(ng/㎖)	측정값(ng/㎖)	기대율(%)
1	1	0.547	0.547	100
	1/2	0.274	0.283	103
	1/4	0.137	0.149	109
2	1	0.429	0.429	100
	1/2	0.215	0.232	108
	1/4	0.107	0.117	109
3	1	0.601	0.601	100
	1/2	0.301	0.307	102
	1/4	0.150	0.152	101

기대율(% of expected)=기대값/관찰값 x 100%

베스핀 ELISA 특이성

시료	최대 농도 (ng/㎖)	교차 반응성(%)
인간 베스핀	1	100
인간 RBP4	10	없음
인간 에디포넥틴	10	없음
인간 비스파틴	10	없음
인간 렙틴	10	없음
인간 RELMβ	10	없음
인간 AGF	10	없음
인간 FABP4	10	없음
인간 TNF-α	10	없음
인간 IL23p19	10	없음
인간 GPX3	10	없음
인간 IL-33	10	없음
인간 ST2	10	없음
인간 프로그레뉼린	10	없음
인간 PAⅠ-1	10	없음
마우스 에디포넥틴	10	없음
마우스 레시스틴	10	없음

실시예 5. 항체의 제조

1) 항원면역

애쥬번트(Sigma, USA)가 섞인 에멀젼을 제조하였다. 상기 에멀젼을 생후 7 주령 암컷 Balb/c mouse (Charles River Diagnostics, Japan) 3 마리에 복강 주사하였다. 1 마리당 20 ㎍의 항원을 주사하되 총 부피는 400 ㎕로 하였다. 2주 뒤에 Incomplete Freund's Adjuvant (Sigma, USA) 와 항원을 혼합한 에멀전을 상기 mouse의 복강에 주입한 후, 2주일 후 PBS 에 녹인 항원을 (20 ㎍/mouse) 복강 내에 주사하여 항체 생성을 유도하였다. 항체 생성을 효소면역법 및 웨스턴 블랏팅를 실시하여 항체를 확인한 후, 세포 융합에 들어가기 3일 전에 쥐의 꼬리 정맥에 PBS에 녹인 항원으로 추가접종 하였다.

2) 항체 생성 세포의 확인 및 선별

상기 방법에 따라 면역화된 쥐의 안와 정맥 총 (eye ball)으로부터 혈액을 취득하여 1.5 ㎖ 원심분리 튜브에 담아 13,000 rpm,10분 원심분리로 혈청을 분리하여 항체의 생성 여부를 실험하기까지 -20℃에서 보관하였다. 재공된 단백질로 효소면역법 및 웨스턴 블랏 분석에 의해 항체의 생성을 확인한 후 항체 생성 쥐의 비장 세포에 대한 융합(fusion)에 착수하였다.

3) 융합 세포 제조

항체 생성이 확인된 후 쥐를 희생시켜 항체생산 세포 (splenocyte)를 분리하고, 이와 골수종 세포 (myeloma cell) P3X63Ag8.653를 (ATCC CRL-1580, USA) Kohler and Milstein의 변형된 방법에 따라 융합하였다. 즉, 쥐의 P3X63Ag8.653 세포를 배양 접시에 10% 우 태아 혈청 (Biowhittaker, USA)이 포함된 RPMI1640 배지를 이용하여 최적 성장기에 이르도록 유지시켰다. 세포 융합을 위하여 P3X63Ag8.653 세포를 무 혈청 RPMI 1640 배지 (Biowhittaker, USA)로 2번을 세척한 후 1 x 10⁷ 세포 되게 농도를 맞추었다. 쥐를 경추이탈 (cervical dislocation)에 의해 희생시켜 비장을 취득하고 이것을 메쉬 (Sigma, USA)용기에 넣고 세포를 하나씩 분리시켰다. 비장세포 부유액을 만든 후 원심 세척한 다음 비장세포액을 Tris-NH₄CI 용액 (Tris 20.6g/L, NH₄CL 8.3 g/L)에 노출시켜 적혈구를 용해시킨 후, 완전히 분리된 항체 생산 세포를 5분간 400 g 에서 원심분리한 후 무 혈청 배지로 2번 세척하고 10 ㎖의 배지에 현탁시켰다. 림프세포를 혈구계수판 (haemocytometer) 으로 계수하여 1x10⁸ 의 림프구를 1 x 10⁷ P3X63Ag8.653 세포 (10:1) 와 무 혈청 배지에 섞어 5분간 400 g로 원심분리 하였다. 37℃에서 전 처리된 50% (M/V)Polyerhylene glycol 1500 (Sigma, USA)을 이용하여 1 ㎖ 용액을 1분에 걸쳐 서서히 떨어뜨리면서 섞었다. 위에서 생성된 융합 혼합액을 무혈청 RPMI 1640 배지로 희석하고 3분 동안 400 g에서 원심분리한 후 20% 우태아 혈청과 HAT (100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, 16 μM thymidine)가 포함된 RPMI 1640 선택배지 35 ㎖에 세포를 현탁 시켰다. 100 ㎕의 현탁액을 하루 전에 feeder cells (쥐의 복강 에서 RPMI 1640 배지로 분리한 macrophage)를 코팅한 96 웰 플레이트에 분주하여 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기 하였으며, 5일 후부터는 2-3일 간격으로 HAT 선택배지를 번갈아 주면서 14 일간 배양하였다. 14일 이후부터는 20 % 우 태아 혈청과 HT (HAT 선택배지에서 0.4 μM aminopterin을 제거한 배지)가 포함된 RPMI 1640 배지로 교환하면서 계대 배양을 진행하였다.

4) 각 항체를 생산하는 융합세포의 선별 및 분리

상기 3)의 방법에서 융합이 된 배양 상층 액을 취득하여 제공된 항원에 대한 특이 항체 생성여부를 조사하기 위하여 효소면역 측정법으로 검색하였으며, 융합 세포의 배양액을 음성대조군에 비해 4배 이상의 역가를 나타내는 웰의 세포만 선택하여 24 웰 배양 플레이트 및 25 cm² 배양 플라스크로 옮겨 증식시켰다. 이 과 정 중에서 3회 이상의 검색 실험을 실시하여 동일한 항체 역가를 유지하는 웰의 세포는 클로닝을 시작하였으며, 또한 제공된 기관에 항원 항체 반응을 검증 한 후 일부는 -130 ℃ 에 저장하였다. 또한 항체를 생산하는 융합세포는 3회 에 걸친 클로닝을 통해 지속적으로 높은 항체 역가를 유지하면서 세포의 증식이 활발한 융합세포만을 선택하여 무한대 희석법 (limiting dilution method)을 이용하였으며 (Mckearn et al ., 1980), 클로닝하려는 융합세포의 수를 산정하여 웰 당 0.8개의 (0.8 cell/well) 세포수를 산정하여 클론 당 120 웰에 (1clone/120well) 분주하였다. 14일 후 단일 클론으로 성장한 융합 세포가 충분히 자라면 배양 상청액으로부터 다시 항체 생성 여부를 확인 후 양성 클론만을 마우스 복강에 주입하여 마우스 복수액을(Ascites) 얻었다.

5) 면역 글로블린 분리 및 개별형 결정

복수액 (Ascites)으로부터 항체를 얻는 방법은 융합세포를 Balb/c nu/nu (Charles River Diagnostics, Japan)마우스의 복강 내에 세포를 주사하기 약 7일 전에 pristane 0.5 ㎖ (Sigma, USA)를 복강 내 주사하여 복강종양의 발생 빈도를 높인 후, 약 5×10⁵개의 융합세포를 Balb/c nu/nu 마우스 복강 에 주사하여 복수형성을 유도시키고 10-14일후 형성된 복수로부터 항체를 분리하였다. 단클론항체의 개별형은 효소면역측정법을 이용하는 Isotyping kit (Zymed Labomouseories Inc. USA)를 사용하여 결정하였다.

상기 방법으로 얻어진 단클론항체를 분비하는 하이브리도마를 2008년 1월 20일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 수탁번호 KCTC 11270BP로 기탁하였다.

실시예 6. 통계적 분석

달리 언급하지 않는 한, 데이터는 평균값 ±SEM 이다. 통계적 분석 전에, 비-정규적으로 분포된 계수들은 정규 분포에 가깝도록 대수적으로 변환되었다. 다음의 통계적 테스트가 사용되었다: Paired Student's t test, Chi quadrate test, 및 PEARSOP's simple correlation. 선형관계는 최소 자승 회귀분석에 의해 평가된다. 통계적 분석은 SPSS version 12.0(Chicago, IL)을 이용하여 실시한다. P value가 <0.05 일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.

Results (결과)

1. 새로운 베스핀 ELISA 의 개발 및 검증

상기 실시예에 따른 ELISA 시스템은 인간 베스핀-특이 단일클론 항체에 의해 가능하도록 제작되었다. 본 발명자들은 이 assay를 사용하여 마우스 또는 래트의 혈청에서 얻은 혈청 베스핀을 측정할 수 없었다(데이터 보이지 않음). 또한, 많은 종래 또는 새로운 에디포카인을 사용한 결과 교차 반응이 없음도 관찰하였다(표 5). 스핀이 서핀(Serpine)의 일원이기 때문에, 본 연구자들은 PAI-1에의 교차반응에 대해 관심을 가졌으나, 그 결과는 음성으로 판명되었다.

본 발명에 따른 ELISA 시스템은 12 pg/㎖의 높은 민감성으로 인하여, 본 발명자들은 우리가 검사한 모든 혈청들로부터의 일정 범위의 혈청 베스핀 수준을 관찰할 수 있었다. Inter- 및 Intra- 분석의 좁은 변동계수(Coefficient of Variation) 범위(1-9%), 충분한 정도의 회복 및 직선성(100-109%)은 이 시스템의 신뢰도를 강화시켰다(표 1 내지 표 5).

2. 횡단면적 연구에서의 베스핀 혈청 농도

횡단면적 연구에서 187 개체의 인체 측정 및 물질대사의 특징은 하기 표 6에 요약되어 있다. 베스핀의 혈청 농도는 0.1-6.74 ng/㎖의 범위를 갖는다.

	남성		여성
	NGT	T2D	NGT	T2D
n	36	53	18	80
나이(세)	39 ±19^a,b	62±7	56 ±16^a	62 ±8.4
BMI (kg/㎠)	24.2 ±5.0^a,b	35 ±6.1	28.0 ±7.3^a	34.2 ±6.3
체지방(%)	22.2 ±6.0^a,b	31.4 ±5.2^b	30.1 ±8.2^a	40.3 ±6.1
HbA1c(%)	5.7 ±1.1^a	6.6 ±1.0	5.6 ±1.6^a	6.5 ±1.0
공복혈당치(mmol/l)	5.6 ±1.1^a	7.4 ±2.1	5.6 ±1.2^a	7.2 ±2.0
FFA(mmol/l)	0.36 ±0.11^a	0.55 ±0.25	0.38±0.20^a	0.53 ±0.23
총콜레스테롤(mmol/l)	4.4 ±0.8^a,b	5.0 ±1.0^b	5.2 ±1.2^a	5.9 ±1.0
HDL 콜레스테롤(mmol/l)	1.3 ±0.3^b	1.1 ±0.2^b	1.6 ±0.5	1.4 ±0.3
LDL 콜레스테롤(mmol/l)	2.7 ±0.7^a,b	3.4 ±1.0^b	3.0 ±0.6^a	3.8 ±0.9

정상 내당능 피실험자들에서 순환 베스핀은 남성에 비해서 여성에서 상당히 높게 나타난 반면 T2D를 갖는 피실험자에서는 성별에 따른 차이가 발견되지 않았다. 또한, 베스핀 수준은 T2D와 비교하여 NGT인 여성에게서 1.5배 높았다. 그러나, 이러한 차이는 통계적으로 유의하지는 않다(p=0.085). 남성에서 순환 베스핀은 NGT와 T2D사이에 차이가 없었다(도 1).

나아가 본 발명자들은 베스핀 농도에 미치는 오랜 기간의 운동 효과의 모델로서 유능한 운동선수(n=30)의 하위집단을 조사하였다. 유능한 운동선수의 정의는 지역 스포츠클럽에서 1주에 연속적으로 6일을 트랙이나 필드에서 적어도 3시간 운동을 수행하는 하위그룹으로 설명할 수 있다. 유능한 운동선수는 마른 NGT 대조군(0.77 ± 0.42 ng/㎖)에 비해 상당히 낮은 혈청 베스핀 농도(0.28 ± 0.07)를 갖는다. 이러한 결과는 NGT 대조군(24.2 ± 1.6 kg/m² ) 에 비하여 유능한 운동선수(22.5 ± 0.7)가 상당히 낮은 BMI를 갖기 때문이다. 더 나아가, 총 지방량의 차이가 다른 베스핀 혈장 농도의 차이를 설명하는지를 더 밝히기 위해, 본 발명자들은 <20%(n=10) 또는 >20% 체지방(n=10)의 26 kg/m²의 BMI인 정상 내당능 남성의 하위그룹 분석을 실시하였다. <20% 체지방을 갖고 있는 개체들은 >20% 체지방(0.36 ± 0.1 ng/㎖)을 갖는 BMI가 같은 피실험자에 비해 상당히 낮은 베스핀 혈청 농도(0.19 ± 0.05 ng/㎖)를 가졌다. 베스핀 혈청 농도는 과체중 및/또는 비만인 남성과 여성에 비하여 마른 사람에게서 상당히 낮게 나타났다(도 2). 게다가, 정상 내당능 피실험자의 순환 베스핀은 정상혈당클램프(r=0.25, p=0.035)의 안정 상태 동안의 당 주입률 및 BMI(r=0.27, p=0.03)와 상호관계가 있었다. 흥미롭게도, T2D 환자에서 순환 베스핀, BMI, 및 인슐린 민감성 간의 상호관계는 확인되지 않았다. 베스핀과 BMI 간의 상호관계의 결여는 식이요법/운동 또는 메트폴민(metformin)에 의한 당뇨병 치료와 관계가 없는 것으로 관찰되었다. T2D 피실험자가 아닌 남성 NGT에서, 베스핀 혈청 농도는 수축기 혈압(r=-0.5, p=0.02) 및 총 콜레스테롤(r=-0.61, p=0.003)과 유의한 상호관계를 가졌다. 베스핀 혈장 농도, 수축기 또는 이완기 혈압과 콜레스테롤을 포함한 지질 계수간의 상호관계는 없었다.

3. 4주간의 집중 운동 훈련에 반응한 베스핀 혈청 농도

60명의 백인 남성과 여성은 4주간의 운동 프로그램을 완성하고 앞서 설명한 것처럼 NGT(n=20), IGT(n=20) 내당능 또는 T2D(n=20)의 피실험자들로 나눈 후 연구되었다. 운동의 영향은 모든 그룹에서 VO₂max의 유의한 증가에 의해 확인되었다. 4주의 체육훈련은 모든 내당능 그룹에서 BMI, WHR 및 % 체지방량이 유의하게 감소되는 결과를 보였으며, 인슐린 민감성은 IGT 와 T2D 그룹에서 유의하게 증가하였다.

베스핀 혈청 농도는 4주간의 운동 프로그램에 호응하여 NGT, IGT 및 T2D 피실험자들(도 3)의 하위 그룹에서 두 배 정도 현저히 증가하였다. 베스핀 혈청 농도의 증가와 운동 프로그램 후 증가된 VO₂max (r=0.6, p=0.004) 간에는 유의한 상호관계가 존재한다. 다변량 선형회귀분석(multivariate linear regression analysis)은 감소된 BMI, 향상된 인슐린 민감성, 및 증가된 운동 수준(VO₂max) 이 운동 후 증가된 베스핀 혈청 농도의 예측자라는 것을 보였다(표 7). 그러나, 유능한 운동선수에서 긴 기간의 집중적인 체육 프로그램은 상당히 낮은 베스핀 혈청 농도와 관련되었다.

	베타 계수(β-coefficient)	유의확률 (p-value)
모델 1
나이	-0.08	0.4
성별	0.09	0.2
△BMI	0.56	<0.001
모델2
나이	-0.05	0.5
성별	0.07	0.3
△BMI	0.38	<0.001
△GIR	-0.29	0.003
모델3
나이	-0.05	0.5
성별	0.07	0.3
△BMI	0.32	<0.001
△VO₂ max	0.3	0.001

4. 내경동맥 협착 환자에서의 베스핀의 혈청 농도

본 발명에서는 경동맥 내막절제술(carotid endarterectomy, CEA)을 받은 내경동맥 협착(Arteria carotis interna stenosis) 환자 107 명을 대상으로 상기와 같은 ELISA 시스템을 이용하여 혈청 베스핀의 농도를 측정하였다.

그 결과, 수술 전 6개월 안에 뇌경색(stroke), 일과성 뇌허혈증(transient ischemic attack, TIA) 및 일과성 흑내장(amourosis fugax)을 포함하는 허혈성 질환의 발생을 경험한 유증상 환자들은 무증상 환자들과 비교했을 때 현저하게 낮은 베스핀 수준을 나타냈고, 특히 수술 전 30일 안에 허혈성 질환의 발생을 경험한 유증상 환자들이 베스핀의 수준이 가장 낮았다 (도 6).

또한, 체내 염증 지표이자 심혈관계 질환의 지표인 고감도 C-반응성 단백질(high－sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)과 베스핀의 상관관계를 조사한 결과, CRP 수준이 증가된 내경동맥 협착 환자에서 혈중 베스핀의 수준이 낮게 나타남으로써, 베스핀은 CRP의 수준과 반대양상을 나타냈다 (도 7).

이러한 결과들을 통해, 베스핀은 동맥경화성 심혈관질환의 진단 마커로 유용함을 알 수 있다.

도 1은 정상 내당능(NGT) 개체와 제2형 당뇨병(T2D) 환자에서의 베스핀 혈청 농도를 비교한 그래프로서, 정상 내당능(NGT)의 경우 남성(n=36)에 비해 여성(n=18)의 순환 베스핀 농도가 훨씬 높음을 알 수 있으나, 제2형 당뇨병의 경우 남성(n=53)과 여성(n=80) 사이의 순환 베스핀 농도 차가 크지는 않았다.

도2는 정상 내당능(NGT) 개체와 제2형 당뇨병(T2D) 환자에서의 베스핀 혈청 농도를 체중지수(BMI)에 따라 마름(BMI<25kg/m², 남성, n=16; 여성, n=19), 과체중(BMI<25 29.9kg/m², 남성, n=46; 여성, n=32) 및 비만(BMI>30kg/m², 남성, n=29; 여성, n=45)으로 나누어 각각의 베스핀 혈청 농도를 비교하여 나타낸 그래프이다. 마른 사람 보다 과체중 및 비만 그룹의 순환 베스핀 농도가 높음을 알 수 있다.

도 3은 일반 내당능(NGT), 손상 내당능(IGT) 또는 제2형 당뇨병(T2D)을 갖는 개체들에서의 혈청 베스핀 농도에 대한 4 주간의 집중 운동 프로그램의 영향을 나타낸 그래프로서, NGT(n=20), IGT(n=20) 및 T2D(n=20)의 모든 그룹에서 운동 후 순환 베스핀의 농도가 현저하게 증가하였음을 알 수 있다. DATA는 평균값 +/- SEM이다. 기준값과 4주간의 집중 운동훈련간의 *p<0.05.

도 4는 본 발명에 따른 벡터 pAGNF 의 개열지도를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 벡터 pET21a 의 개열지도를 나타낸 것이다.

도 6의 (A)는 뇌경색(stroke), 일과성 뇌허혈증(transient ischemic attack, TIA) 및 일과성 흑내장(amourosis fugax)을 포함하는 허혈성 질환의 발생을 경험한 유증상 환자들(sympt)과 그렇지 않은 무증상(asympt) 환자들에 있어서 혈중 베스핀의 농도를 나타낸 것이고, (B)는 경동맥 내막절제수술 전 0-30일, 수술 전 31-90일, 및 수술 전 91-180일 안에 각각 허혈성 질환의 발생을 경험한 유증상 환자들의 혈중 베스핀 농도를 나타낸 것이다.

도 7은 내경동맥 협착 환자에서 체내 염증 지표이자 심혈관계 질환의 지표인 고감도 C-반응성 단백질(high sensitivity C-reactive protein, hsCRP)과 베스핀의 상관관계를 조사한 결과로서, 베스핀은 CRP의 수준과 반대양상을 나타내고 있다.

Claims

혈중 베스핀의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 대사성 질환인 심혈관질환을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물.
혈중 베스핀의 농도를 측정하는 제제를 포함하는, 대사성 질환인 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과를 진단하기 위한 마커 검출용 조성물.
제1항 또는 제2항에서, 상기 베스핀의 농도를 측정하는 제제는 베스핀에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 항체는 베스핀에 특이적인 단클론항체 또는 다클론항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에서, 상기 단클론항체는 수탁번호 KCTC 11270BP의 하이브리도마에 의해 제조되는 것인 조성물.
혈중 베스핀의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는, 대사성 질환인 심혈관질환 진단용 키트.
혈중 베스핀의 농도를 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는, 대사성 질환인 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 진단용 키트.
제6항 또는 제7항에서, 상기 베스핀의 농도를 측정하는 제제는 베스핀에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 키트.
제8항에 있어서, 상기 항체는 베스핀에 특이적인 단클론항체 또는 다클론항체인 것을 특징으로 하는 키트.
제9항에서, 상기 단클론항체는 수탁번호 KCTC 11270BP의 하이브리도마에 의해 제조되는 것인 키트.
제6항 또는 제7항에서, 상기 키트는 ELISA 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
제11항에 있어서, 상기 키트는 샌드위치-ELISA 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
대사성 질환인 심혈관질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 베스핀에 특이적인 항체를 심혈관질환 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계, 및 상기 항원-항체 복합체의 형성량을 정상 대조구 시료의 형성량과 비교하는 단계를 포함하는, 대사성 질환인 심혈관질환의 진단 마커 베스핀의 검출 방법.
대사성 질환인 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 베스핀에 특이적인 항체를 비만 또는 당뇨병 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계, 및 상기 항원-항체 복합체의 형성 량을 정상 대조구 시료의 형성량과 비교하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨병의 운동개선효과의 진단 마커 베스핀의 검출 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
대사성 질환인 심혈관질환을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질을 인간을 제외한 동물에 투여한 후 혈청 베스핀의 농도를 측정하는 것을 포함하는, 심혈관질환 치료제의 스크리닝 방법.