JP4677545B2 - 多量体アディポネクチンの分別測定方法 - Google Patents
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Description
さらに本発明は、人血中由来多量体アディポネクチンが下記の4種であり、その内の1種又は2種を、プロテアーゼ及び/又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定することを特徴とする、生体試料中のアディポネクチンの測定方法を提供するものである。
(1)ULMW−Ad:人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル(2−15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される4種のバンドのうち、最も移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のSDS−PAGEによる分子量が100kDa付近にあるアディポネクチン。
(2)LMW−Ad:人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル(2−15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される4種のバンドのうち、ULMW−Adの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のSDS−PAGEによる分子量が150kDa付近にあり、さらにアルブミンがジスルフィド結合しているアディポネクチン。
(3)MMW−Ad:人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル(2−15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される4種のバンドのうち、LMW−Adの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のSDS−PAGEによる分子量が250kDa付近にあるアディポネクチン。
(4)HMW−Ad:人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル(2−15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される4種のバンドのうち、最も移動度が小さく、さらに、分子内架橋後のSDS−PAGEによる分子量が少なくとも300kDa以上であるアディポネクチン。
実施例及び参考例で用いた試薬及び材料は以下の通りである。
a.抗体結合樹脂用洗浄液:0.5M NaCl を含む 0.1M NaHCO3−NaOH(pH8.3)。
b.抗体結合樹脂用溶出液:0.1M Glycine−HCl(pH2.5)。
c.抗体結合樹脂用中和液:2M Tris−HCl(pH8.0)。
d.ELISA用プレート:96穴マイクロプレート(NUNC社)。
e.ELISA用抗体感作溶液:PBS(pH7.4)。
f.ELISA用緩衝液:1% ウシ血清アルブミン、0.1% Tween 20 を含む PBS(pH7.4)。
g.Vector ABC kit(Mouse):フナコシ社、Cat No.PK−6102。
h.DAB基質キット(ウエスタンブロティング発色基質):フナコシ社、Cat No.SK−4100。
i.抗ヒトアディポネクチン−モノクローナル抗体(hu Acrp30−MoAb):藤沢薬品工業社、BD Transduction Laboratories社、商品コードA12820。
j.ヤギ抗ヒトアディポネクチン−ポリクローナル抗体(Goatαhuman Acrp30 antibody):コスモバイオ社、GT社、Cat No.421065。
k.ヤギ抗マウスIgG HRP標識抗体:コスモバイオ社、capple社。
l.ELISA用洗浄液:0.05% Tween20 を含むPBS
m.ELISA用緩衝液2:1% BSA,0.05% Tween20を含むPBS。
n.ヤギ抗ヒトアルブミン−ポリクローナルHRP標識抗体(HRP−Gt抗HSA抗体):PARIS社。
o.HRP−Avidin:PIERCE社。
マウスアディポネクチンの遺伝子配列(NCBI accession #U37222)のグロブラードメイン配列(104−247残基相当)を6×Hisタグを含むpQE30ベクターのBamHI、HindIIIに挿入し、大腸菌に組み込んだ。リコンビナント マウスグロブラーアディポネクチン(rMgAd)を発現した大腸菌からのrMgAdの精製は、以下の操作により行った。すなわち、大腸菌の可溶画分をNi−NTAアガロース(QIAGEN社)に4℃、16時間添加してrMgAdを結合させた後、イミダゾールにより段階的に溶出させ、アディポネクチンを含む画分を回収し、3日間PBS(pH7.4)で透析を行なった。得られたrMgAdの蛋白質濃度は、Bio−Rad DC protein assay kit を用いて求めた。
参考例1で調製したrMgAdの50μgを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、2匹のウサギに2週間おきに6回免疫して抗血清を作製した。抗血清中の特異抗体(IgG)の精製は、Protein A樹脂を用いて常法により行なった(抗rMgAd抗体)。
参考例2で作製した抗rMgAd抗体500mgをCNBr−activated Sepharose 4B(Amersham Bioscience社)50mLに結合させ抗rMgAd抗体結合Sepharose 4B樹脂を作製した。ヒト血清2.5Lを抗rMgAd抗体結合Sepharose 4B樹脂に添加し、抗体結合樹脂用洗浄液で十分量洗浄した後、抗体結合樹脂用溶出液でヒト血清アディポネクチン画分(mAd)を溶出し、溶出画分に抗体結合樹脂用中和液を1/10量添加して中和した。さらに、中和した溶出画分を、Protein A樹脂に添加し、Protein A樹脂への非吸着画分を精製mAdとして回収し、「ヒトアディポネクチンELISAキット」(大塚製薬社)によりアディポネクチン含量を測定した。
参考例3で得た精製mAd 20μgを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、2匹のマウスに2週間おきに3又は4回免疫を行った後、さらに細胞融合3日前に再投与した。免疫したマウスより脾臓細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、P3U1ミエローマ細胞と細胞融合を行った。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞の選択は、ELISA法によりmAdとの反応性の高いウエルを選択し、ついで限界希釈法にて選択する常法により行なった。抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体は、選択した融合細胞をプリスタン処理したマウス腹空内に投与し腹水として回収した。腹水からの特異抗体(IgG)の精製は、Protein A樹脂を用いて常法により行なった。上記により認識番号;64401〜64411で識別される11の抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞とモノクローナル抗体が得られた。
参考例3で得た精製mAdを、20mMリン酸緩衝液(pH7.0)にて透析して脱塩した後、これをGelatin−Cellulofine(生化学工業社)カラムに吸着させ、0、100、200、300及び500mMのNaClをそれぞれ含む20mMリン酸緩衝液(pH7.0)にて、段階的に溶出させた。得られた各NaCl濃度の溶出画分中には、分子量の異なるアディポネクチンが混在していた。得られた各溶出画分を濃縮し、それぞれの溶出画分についてSephacryl S−300(分画分子量;10〜1500kDa、平均粒子径47μm、Amersham Bioscience社)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーをさらに実施した。溶離液には、150mMのNaClを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.0)を使用した。Sephacryl S−300カラムの分子量較正はGel filtration calibration Kit(Amersham Bioscience社)を用いて行った。各クロマトグラフィーにおけるアディポネクチンの検出は、「ヒトアディポネクチンELISAキット」(大塚製薬社)により行った。
1)SDS−PAGEによる解析
実施例1で得られた多量体アディポネクチン分別精製品を、非還元条件でSDS−PAGE(2−15%)にて分離し、CBB蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図3に示した。
前記1)で検出された90kDa付近の未同定染色バンドのゲルを切り出し、エレクトロエリューターModel422(バイオラッド社)を用いて蛋白を抽出した。抽出された蛋白を2−メルカプトエタノールを含む処理液により煮沸、還元処理し、再度SDS−PAGE(2−15%)にて分離後、PVDF膜へ転写し、CBB蛋白染色を行なったところ、60kDa付近と30kDa付近に2本の染色バンドが確認された。
参考例3の方法に準じて、再度調製された精製mAdを、20mM リン酸緩衝液(pH7.0)にて透析して脱塩した後、これをGelatin−Cellulofine(生化学工業社)カラムに吸着させ、0、100、200及び500mMのNaClをそれぞれ含む20mM リン酸緩衝液(pH7.0)にて、段階的に溶出させた。得られた100mM NaCl溶出画分には、ULMW−Ad、LMW−Ad及びMMW−Adが混在し、200mM NaCl溶出画分には、MMW−Ad及びHMW−Adが混在したが、500mM NaCl画分は、HMW−Adのみであったことから、500mM NaCl溶出画分を、HMW−Ad分別精製品とした。次に、上記参考例3の方法に準じて、Goatαhuman ALB antibody結合Sepharose4B樹脂を作製後、100mM NaCl溶出画分を添加し、非吸着画分及び吸着画分を得た。非吸着画分には、ULMW−Ad及びMMW−Adが混在していたが、吸着画分にはLMW−Adのみであったことから、これをLMW−Ad分別精製品とした。さらに、非吸着画分を濃縮し、Sephacryl S−300(分画分子量;10〜1500kDa、平均粒子径47μm、Amersham Bioscience社)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、ULMW−Ad及びMMW−Adを分離した。得られたそれぞれの画分を、ULMW−Ad分別精製標品及びMMW−Ad分別精製品とした。
実施例1の分別精製で得られた情報を基に、さらに分別精製条件を改良した結果、この方法では、LMW−Ad、MMW−Ad及びHMW−Adの3種以外に、もう1種(ULMW−Adとした)新たに分離された。
1)SDS−PAGEによる解析
実施例3で得られた各多量体アディポネクチン分別精製品を、非還元条件でSDS−PAGE(2−15%)にて分離し、CBB蛋白染色を行なった。染色した泳動像を図7に示した。
実施例3で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、100mMリン酸緩衝液(pH8.0)にて、5〜10μg/mL程度に希釈し、別に架橋剤であるBis(sulfosuccinimidyl)suberate(商品名BS3:PIERCE社製)を20mg/mLとなるように精製水で希釈した液と、等量混合後、室温にて30分間放置した。さらに、100mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を混合液に等量添加し、室温で15分間放置した。これらの各処理液を非還元条件でSDS−PAGE(2−15%)にて分離し、セミドライブロッティングによりPVDF膜に転写後、免疫染色を行なった。手順は、転写膜を5% スキムミルク及び0.1% NaN3を含むPBSでブロッキング後、0.1% Tween 20を含むPBSで洗浄し、抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体(hu Acrp30−MoAb)1μg/mLを室温で1時間反応させた。0.1% Tween 20を含むPBSで十分に洗浄した後、Vector ABC kit (Mouse) 及びDAB基質キットを用いて発色させた。
健常者8名の血清0.2μL分を、PAGE(2−15%)にて分離し、セミドライブロッティングによりPVDF膜に転写後、免疫染色を行なった。手順は、転写膜を5%スキムミルク及び0.1%NaN3を含むPBS液(pH7.4)でブロッキング後、0.1%Tween20を含むPBS液(pH7.4)で洗浄し、抗アディポネクチン−モノクローナル抗体(hu Acrp30−MoAb;藤沢薬品工業社、BD Transduction Laboratories社)1μg/mLを室温で1時間反応させた。0.1%Tween20を含むPBS液(pH7.4)で十分に洗浄した後、Vector ABC kit (Mouse) 及びDAB基質キット(フナコシ社)を用いて発色させた。
又、ULMW−Adについては、存在量が少ない為か不明であるが、ほとんど染色バンドが認められなかった(図4)。
ELISA用プレートにヤギ抗ヒトアディポネクチンポリクローナル抗体(Goatαhuman Acrp30 antibody)をELISA用抗体感作溶液で1μg/mLに希釈した後、感作した。ELISA用緩衝液でブロッキング後、実施例1で調製したLMW−AdをELISA用緩衝液で1、0.1、0.01μg/mL(Ad含量として)の濃度に希釈し室温で1時間反応させた。ELISA用緩衝液でプレートを洗浄後、ELISA用緩衝液で1/2000倍希釈した抗ヒトアルブミン−モノクローナル抗体(特開2001−337092)液を室温で1時間反応させた後、ELISA用緩衝液でプレートを洗浄、ELISA用緩衝液で1/1000倍希釈したヤギ抗マウス(Goatαmouse) IgG HRP標識抗体液を室温で1時間反応させた。ELISA用緩衝液でプレートを洗浄後、TMB(テトラメチルベンチジン)と過酸化水素の基質を用いたHRPの酵素反応により発色させ、2N硫酸を添加して反応を停止させた後、450nmの吸収を測定した。測定結果を図5に示す。
(1)希釈直線性
ELISA用プレートに、ELISA用抗体感作溶液で5μg/mLに希釈した抗アディポネクチンモノクローナル抗体(64402)を、感作した。次に、20%ヤギ血清を含むELISA用緩衝液でブロッキング後、実施例3で調製したLMW−Ad精製品をELISA用緩衝液で0〜20ng/mL(Ad含量として)の濃度範囲に希釈し、に希釈し室温で1時間反応させた。ELISA用洗浄液でプレートを洗浄後、ELISA用緩衝液で1000倍希釈したHRP標識ヤギ抗ヒトアルブミン(HRP−Gt抗HSA)抗体液を室温で1時間反応させた後、ELISA用洗浄液でプレートを洗浄し、OPD発色液(2mg/mL オルトフェニレンジアミン塩酸塩、0.02% 過酸化水素を含む、250mMクエン酸緩衝液、pH5.0)により発色させ、停止液(1.5N 硫酸、1mM EDTA−2Na)を添加して反応を停止させた後、492nmの吸収を測定した。測定結果を図9に示す。
人血清を、ELISA用緩衝液2で100〜800倍希釈したものに、実施例3で調製したLMW−Ad精製品を0〜50ng/mLの濃度範囲で添加し、前記(1)と同様のELISA系にて測定後、添加量と実測値からの回収率を求めた。その結果を表1に示す。
50mMリン酸緩衝液(pH8.0)に、参考例3で得た精製mAd及び各種市販プロテアーゼを添加し、37℃で60分間加温した。その処理液をPAGE(2−15%)にて分離し、プロテアーゼ非添加試料を対照として、各画分への作用を、CBB蛋白染色像にて比較した(表2)。
50mM リン酸緩衝液(pH8.0)に、実施例3で解析された精製mAd及び各種市販プロテアーゼを1mg/mLとなるように添加し、37℃で30分間加温した。その処理液をPAGE(2−15%)にて分離し、プロテアーゼ非添加試料を対照として、各画分へのプロテアーゼの作用を、CBB蛋白染色像にて比較した(表3)。
参考例3で得られた、抗体結合樹脂非吸着画分(以下、「Ad除去血漿」という)に、実施例3で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、最終濃度で10μg/mL程度となるように添加したものを検討用試料とした。又、50mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0)に、プロテイナーゼKを5〜10u/mLとなるように溶解したものを前処理用酵素液とした。各検討用試料10μLに前処理用酵素液90μLを加え、37℃で10〜30分間反応させた後、100mM クエン酸緩衝液(pH3.0、2% SDS含有)を400μL加え、酵素反応(前処理)を停止させた。この反応液20μLに、ELISA用緩衝液2を1.0mL添加して希釈し、前処理済み試料とした。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用ELISA系にて、残存するアディポネクチン含量を算出した。
実施例10と同様に、Ad除去血漿に、実施例3で得られた各アディポネクチン多量体分別精製品を、最終濃度で10μg/mL程度となるように添加したものを検討用試料とした。又、50 mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0)に、プロテアーゼA「アマノ」を0.6〜1.0mg/mLとなるように溶解したものを前処理用酵素液とした。各検討用試料10μLに前処理用酵素液90μLを加え、37℃で10〜30分間反応させた後、100mM クエン酸緩衝液(pH3.0、2% SDS含有)を400μL加え、酵素反応(前処理)を停止させた。この反応液20μLに、ELISA用緩衝液2を1.0mL添加して希釈し、前処理済み試料とした。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用ELISA系にて、残存するアディポネクチン含量を算出した。
生体試料に、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤及びプロテアーゼの内の少なくともひとつを加え、アディポネクチンに作用させ、多量体アディポネクチンを一定の形態に変換させて免疫学的に測定する本発明者らの開発した方法(特願2003−354715を優先権主張してなされた国際出願)から、酸と界面活性剤で前処理する方法を使用した。すなわち、人血漿又は人血清10μLに、100mM クエン酸緩衝液(pH3.0、2%SDS含有)を490μL加え十分に攪拌し、当該混液20μLに、ELISA用緩衝液2を1.0mL添加して希釈し、前処理済み試料として。この前処理済み試料を用いて、後述するアディポネクチン測定用ELISA系にて、アディポネクチン総量を算出した。
ELISA用プレートにPBSで5μg/mLに希釈した抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体(64405)を感作した。次に、ELISA用緩衝液2でブロッキング後、実施例10又は11で調製された各前処理済み試料を添加し、室温で1時間反応させた。ELISA用洗浄液でプレートを洗浄後、ELISA用緩衝液2で2000倍希釈したBiotin標識抗ヒトアディポネクチンモノクローナル抗体(64404)を室温で1時間反応させた後、さらに、ELISA用緩衝液2で2000倍希釈したHRP−Avidinを添加し、室温で30分間反応させた。ELISA用洗浄液でプレートを洗浄し、OPD発色液(2mg/mLオルトフェニレンジアミン塩酸塩、0.02%過酸化水素を含む、250mMクエン酸緩衝液、pH5.0)により発色させ、停止液(1.5N硫酸、1mM EDTA−2Na)を添加して反応を停止させた後、492nmの吸収を測定した。前処理用酵素液90μLと100mM クエン酸緩衝液(pH3.0、2% SDS含有)400μLの混液に検討用試料10μLを加えたものを標準試料として同様にELISA測定を行い、得られた発色値を100%として、実施例10及び11の各検討試料の発色値を%換算した。換算された%発色値を各条件毎に平均し、実施例10の試料について図10、実施例11の試料について図11に示した。
インスリン治療を行っていない2型糖尿病患者298名中、冠動脈造影検査(CAG)により器質的病変を認めた90名を冠動脈疾患(CAD)群、残りの208名を非冠動脈疾患(NCAD)群に分け、前記実施例で挙げた方法を用いて、患者血漿中の総アディポネクチン(T.Ad)含量測定及び各多量体アディポネクチンの分別測定を実施した。即ち、T.Ad含量は実施例12及び13の方法、HMW−Ad含量は実施例10及び13の方法、MMW−Ad含量は実施例11及び13の方法でMMW−Ad及びHMW−Ad合計量を算出し、さらにHMW−Ad含量を差し引くことで求めた。ULMW−Ad及びLMW−Adの合計量は、T.Ad含量からMMW−Ad及びHMW−Ad合計量を差し引くことによって求めた。求められたそれぞれの値で、CAD群及びNCAD群間の有意差検定を、t検定を用いて行った。
実施例14で挙げた298名について、総アディポネクチン量(T.Ad)及びT.Ad量に占めるHMW−Ad量の割合、すなわちHMW−Ad/T.Ad×100%(HMW−R)を基に、次に示す基準で、4群に分類した。まず、T.Adの平均値及びHMW−Rの平均値をそれぞれ算出した結果、それぞれ9.8μg/mL及び32%であった。次にT.Ad値及びHMW−R値がともに平均値未満の患者をA群、T.Ad値が平均値未満で、HMW−R値が平均値以上である患者をB群、T.Ad値が平均値以上で、HMW−R値が平均値未満である患者をC群及びT.Ad値及びHMW−Ad値がともに平均値以上である患者をD群に分類した。さらに、各群内において、米国のAdult Treatment Panel III(ATPIII)によって提唱されているメタボリックシンドロームの診断基準(JAMA,285:2486,2001)に照らし合わせ、5項目のリスクファクターの内、2項目以上基準値を超える患者と2項目未満の患者の2グループに分けた(本来、ATPIIIの診断基準では、3項目以上基準値を超える場合をメタボリックシンドロームとしているが、今回はより厳しい条件とした)。その結果を、表5に示す。
Claims (7)
- 測定対象の多量体アディポネクチンを、プロテアーゼ及び/又は抗体を使用して、他のアディポネクチンと分別して免疫学的に測定するヒト血中由来の多量体アディポネクチンの分別測定方法であって;
測定対象の多量体アディポネクチンが下記(1)〜(4)の4種であり、
(1)ULMW−Ad:人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル(2−15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される4種のバンドのうち、最も移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のSDS−PAGEによる分子量が100kDa付近にあるアディポネクチン;
(2)LMW−Ad:人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル(2−15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される4種のバンドのうち、ULMW−Adの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のSDS−PAGEによる分子量が150kDa付近にあり、さらにアルブミンがジスルフィド結合しているアディポネクチン;
(3)MMW−Ad:人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル(2−15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される4種のバンドのうち、LMW−Adの次に移動度が大きく、さらに、分子内架橋後のSDS−PAGEによる分子量が250kDa付近にあるアディポネクチン;
(4)HMW−Ad:人血清又は人血漿から精製したアディポネクチンを、非変性条件下、ポリアクリルアミドゲル(2−15%)で電気泳動した際に、主要な染色バンドとして検出される4種のバンドのうち、最も移動度が小さく、さらに、分子内架橋後のSDS−PAGEによる分子量が少なくとも300kDa以上であるアディポネクチン;
分別して測定する方法が下記の(A)〜(D)の4種である測定方法。
(A)分別して測定する対象がHMW−Adの場合には、ヒト血液に、プロテイナーゼK、プロテアーゼP(商標)及びプロテアーゼN(商標)から選ばれるHMW−Ad以外の3種のアディポネクチンを消化するプロテアーゼを作用させ、残存するHMW−Adを抗アディポネクチン抗体を用いて免疫学的に測定する方法;
(B)分別して測定する対象がMMW−Adの場合には、ヒト血液に、プロテアーゼA(商標)、スミチーム(登録商標)FP及びスミチーム(登録商標)LP50Dから選ばれるULMW−Ad及びLMW−Adを消化するプロテアーゼを作用させ、残存するHMW−Ad及びMMW−Adの合計量を抗アディポネクチン抗体を用いて免疫学的に測定し、該合計量から前記(A)方法により得られたHMW−Ad量を差し引くことでMMW−Ad量を算出する方法;
(C)分別して測定する対象がLMW−Adの場合には、ヒト血液に対して抗アディポネクチン抗体及び抗アルブミン抗体を組合わせた免疫学的測定を行う方法;
(D)分別して測定する対象がULMW−Adの場合には、ヒト血液にプロテアーゼA(商標)、スミチーム(登録商標)FP及びスミチーム(登録商標)LP50Dから選ばれるULMW−Ad及びLMW−Adを消化するプロテアーゼを作用させ、残存するHMW−Ad及びMMW−Adの合計量を抗アディポネクチン抗体を用いて免疫学的に測定し、別に抗アディポネクチン抗体を用いる免疫学的測定により得られたアディポネクチン総量から、該HMW−Ad及びMMW−Adの合計量及び前記(C)方法により得られたLMW−Ad量を差し引くことでULMW−Ad量を算出する方法。 - 分別して測定する方法が下記の(A)、(B)及び(D)の3種である請求項1記載の測定方法。
(A)分別して測定する対象がHMW−Adの場合には、ヒト血液に、プロテイナーゼK、プロテアーゼP(商標)及びプロテアーゼN(商標)から選ばれるHMW−Ad以外の3種のアディポネクチンを消化するプロテアーゼを作用させ、残存するHMW−Adを抗アディポネクチン抗体を用いて免疫学的に測定する方法;
(B)分別して測定する対象がMMW−Adの場合には、ヒト血液に、プロテアーゼA(商標)、スミチーム(登録商標)FP及びスミチーム(登録商標)LP50Dから選ばれるULMW−Ad及びLMW−Adを消化するプロテアーゼを作用させ、残存するHMW−Ad及びMMW−Adの合計量を抗アディポネクチン抗体を用いて免疫学的に測定し、該合計量から前記(A)方法により得られたHMW−Ad量を差し引くことでMMW−Ad量を算出する方法;
(D)分別して測定する対象がULMW−Adの場合には、ヒト血液にプロテアーゼA(商標)、スミチーム(登録商標)FP及びスミチーム(登録商標)LP50Dから選ばれるULMW−Ad及びLMW−Adを消化するプロテアーゼを作用させ、残存するHMW−Ad及びMMW−Adの合計量を抗アディポネクチン抗体を用いて免疫学的に測定し、別に抗アディポネクチン抗体を用いる免疫学的測定により得られたアディポネクチン総量から、該HMW−Ad及びMMW−Adの合計量、及びヒト血液に対して抗アディポネクチン抗体及び抗アルブミン抗体を組合わせた免疫学的測定により得られたLMW−Ad量を差し引くことでULMW−Ad量を算出する方法。 - 分別して測定する方法が下記の(A)である請求項1記載の測定方法。
(A)分別して測定する対象がHMW−Adの場合であって、ヒト血液に、プロテイナーゼK、プロテアーゼP(商標)及びプロテアーゼN(商標)から選ばれるHMW−Ad以外の3種のアディポネクチンを消化するプロテアーゼを作用させ、残存するHMW−Adを抗アディポネクチン抗体を用いて免疫学的に測定する方法。 - HMW−Ad以外の3種のアディポネクチンを消化するプロテアーゼが、プロテイナーゼKである請求項3記載の測定方法。
- 2型糖尿病患者における動脈硬化性疾患、及びメタボリックシンドロームから選ばれる疾病又は病態の評価のために、ヒト血中由来の多量体アディポネクチン量を請求項1〜4のいずれか1項記載の方法により測定し、得られたULMW−Ad、LMW−Ad、MMW−Ad及びHMW−Adのうちの1種以上の量の変動を測定する方法。
- ULMW−Ad、LMW−Ad、MMW−Ad、HMW−Ad及びアディポネクチン総量のうちの少なくとも2つの量の比を求めるものである、請求項5に記載の測定方法。
- 請求項5記載の疾病又は病態において公知の他の指標とULMW−Ad、LMW−Ad、MMW−Ad及びHMW−Adのうちの1種以上の量、あるいはULMW−Ad、LMW−Ad、MMW−Ad、HMW−Ad及びアディポネクチン総量のうちの少なくとも2つの量の比を関連付けるものである、請求項5に記載の測定方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111892907A (zh) * | 2020-07-15 | 2020-11-06 | 广东省医疗器械研究所 | 一种白蛋白胶粘剂及其制备方法 |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10303974A1 (de) | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Abbott Gmbh & Co. Kg | Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
DE602004022968D1 (de) * | 2003-11-07 | 2009-10-15 | Merck & Co Inc | Ie behandlung mti insulinsensibilisatoren |
CA2614340A1 (en) * | 2005-07-21 | 2007-06-07 | Biovendor Laboratory Medicine, Inc. | Method for determining the concentration of the adipocytic form of the fatty acid binding protein (a-fabp, fabp4, p2) |
DK1954718T3 (en) | 2005-11-30 | 2014-12-15 | Abbvie Inc | Anti-A-globulomer antibodies antigenbindingsgrupper thereof, corresponding hybridomas, nucleic acids, vectors, host cells, methods for producing said antibodies, |
EP1976877B2 (en) | 2005-11-30 | 2016-10-05 | AbbVie Inc. | Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof |
US8455626B2 (en) | 2006-11-30 | 2013-06-04 | Abbott Laboratories | Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies |
EP2486928A1 (en) * | 2007-02-27 | 2012-08-15 | Abbott GmbH & Co. KG | Method for the treatment of amyloidoses |
EP2215268B1 (en) | 2007-11-30 | 2018-08-29 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Adiponectin receptor fragments and methods of use |
DK2857525T3 (da) * | 2008-02-29 | 2019-07-22 | Univ Oxford Innovation Ltd | Fremgangsmåde til bestemmelse af en passende dosis statin |
US20100330600A1 (en) * | 2008-02-29 | 2010-12-30 | Sekisui Medical Co., Ltd. | High-molecular-weight adiponectin measurement method |
WO2009141352A2 (en) | 2008-05-20 | 2009-11-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Risk analysis in patients with and without metabolic syndrome |
US9817001B2 (en) | 2008-05-27 | 2017-11-14 | Boston Heart Diagnostics Corporation | Methods for determining LDL cholesterol treatment |
CA2736722A1 (en) * | 2008-09-11 | 2010-03-18 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Natriuretic peptides and adiponectin in subjects with a metabolic syndrome |
US8470541B1 (en) | 2008-09-27 | 2013-06-25 | Boston Heart Diagnostics Corporation | Methods for separation and immuno-detection of biomolecules, and apparatus related thereto |
EP2353015A1 (en) * | 2008-11-10 | 2011-08-10 | F. Hoffmann-La Roche AG | Relevance of intestinal adipocyte function in type 1 diabetes |
EP2211182A1 (en) | 2009-01-16 | 2010-07-28 | Roche Diagnostics GmbH | Method for the assessment of severity of liver cirrhosis |
ES2693165T3 (es) | 2009-04-23 | 2018-12-07 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Formas monoméricas y diméricas de fragmentos de receptores de adiponectina y métodos de uso |
EP2431391B1 (en) | 2009-05-07 | 2015-12-02 | LSI Medience Corporation | Monoclonal antibody for analyzing high-molecular weight adiponectin and utilization of same |
CA2796339C (en) | 2010-04-15 | 2020-03-31 | Abbott Laboratories | Amyloid-beta binding proteins |
WO2011135692A1 (ja) * | 2010-04-28 | 2011-11-03 | 株式会社エヌビィー健康研究所 | バーチャルウエスタンブロッティングシステム |
ES2524082T3 (es) | 2010-06-15 | 2014-12-04 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Predicción y reconocimiento de la lesión renal aguda después de la cirugía |
US9062101B2 (en) | 2010-08-14 | 2015-06-23 | AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG | Amyloid-beta binding proteins |
EP2392927A1 (en) | 2011-03-11 | 2011-12-07 | F. Hoffmann-La Roche AG | Diagnosis of metabolic disorders in HIV infected patients |
EP2385372A1 (en) | 2011-06-21 | 2011-11-09 | Roche Diagnostics GmbH | Kidney disease in normal and abnormal pregnancy |
EP2568291A1 (en) | 2011-09-07 | 2013-03-13 | Roche Diagnostics GmbH | L-FABP based diagnosis of kidney injury after an acute event or after a surgical intervention |
WO2013056087A2 (en) | 2011-10-13 | 2013-04-18 | Boston Heart Diagnostics | Compositions and methods for treating and preventing coronary heart disease |
WO2014034168A1 (ja) * | 2012-08-30 | 2014-03-06 | Hashida Seiichi | 早期腎障害の評価マーカーとその測定方法 |
US20140120559A1 (en) | 2012-10-26 | 2014-05-01 | Boston Heart Diagnostics Corporation | Diabetes panel |
US9828624B2 (en) | 2013-07-24 | 2017-11-28 | Boston Heart Diagnostics Corporation | Driving patient compliance with therapy |
JP6512590B2 (ja) * | 2014-08-25 | 2019-05-15 | メカノジェニック株式会社 | メタボリックシンドローム発症の危険性の予測方法 |
US9739790B2 (en) | 2014-11-17 | 2017-08-22 | Boston Heart Diagnostic Corporation | Cardiovascular disease risk assessment |
BR112018000296A2 (pt) * | 2015-07-07 | 2018-09-04 | Seqirus UK Limited | ensaios de potência de influenza |
EP3929584A1 (en) | 2016-09-06 | 2021-12-29 | Fujirebio Inc. | Method for measuring thyroglobulin |
EP3514539A4 (en) | 2016-09-13 | 2020-04-01 | Fujirebio Inc. | TEST PROCEDURE AND TEST REAGENT FOR HEART TROPONIN |
US20220196637A1 (en) | 2019-05-24 | 2022-06-23 | Fujirebio Inc. | Method and reagent for measuring thyroglobulin |
CN114514427A (zh) | 2019-09-27 | 2022-05-17 | 富士瑞必欧株式会社 | 乙型肝炎病毒核心相关抗原的免疫测定和用于其的试剂盒 |
CN111239421A (zh) * | 2020-02-19 | 2020-06-05 | 安徽大千生物工程有限公司 | 一种定量检测脂联素adpn的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备与应用方法 |
US20230160912A1 (en) | 2020-03-31 | 2023-05-25 | Fujirebio Inc. | Method for immunoassay of amyloid beta in blood, and kit for same |
CN117616277A (zh) | 2021-08-06 | 2024-02-27 | 株式会社先端生命科学研究所 | 甲状腺球蛋白的免疫检测及用于其的试剂盒 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003016906A1 (fr) * | 2001-08-17 | 2003-02-27 | Rebio Gen, Inc. | Procede de diagnostic ou de controle d'une erreur du metabolisme du saccharose |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4444879A (en) * | 1981-01-29 | 1984-04-24 | Science Research Center, Inc. | Immunoassay with article having support film and immunological counterpart of analyte |
JP4424775B2 (ja) | 1999-04-21 | 2010-03-03 | 大塚製薬株式会社 | 抗原蛋白質の検出方法 |
CN1281981A (zh) * | 1999-07-26 | 2001-01-31 | 武汉埃克玛生物技术有限公司 | 血清低密度脂蛋白测定试剂 |
CN1111201C (zh) * | 1999-11-04 | 2003-06-11 | 孙续国 | 低密度脂蛋白受体检测试剂及方法 |
JP4458622B2 (ja) | 2000-05-26 | 2010-04-28 | 積水メディカル株式会社 | 免疫学的測定方法及び測定用試薬 |
JP4547696B2 (ja) | 2001-06-07 | 2010-09-22 | 第一三共株式会社 | 肝硬変予防・治療剤 |
-
2004
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WO2003016906A1 (fr) * | 2001-08-17 | 2003-02-27 | Rebio Gen, Inc. | Procede de diagnostic ou de controle d'une erreur du metabolisme du saccharose |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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