CN117616277A - 甲状腺球蛋白的免疫检测及用于其的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新的方法，即使在抗甲状腺球蛋白抗体为阳性的样本中，也能够准确地测定样本中的甲状腺球蛋白量。该方法包括利用还原剂处理从生物体分离的样本的预处理工序，通过免疫检测测定从生物体分离的样本中的甲状腺球蛋白，免疫检测是使用以利用还原剂处理得到的甲状腺球蛋白为对应抗原的单克隆抗体或其抗原结合性片段的免疫检测。

Description

甲状腺球蛋白的免疫检测及用于其的试剂盒
技术领域
本发明涉及甲状腺球蛋白的免疫检测及用于其的试剂盒。
背景技术
甲状腺球蛋白(Tg)是仅由甲状腺滤泡细胞制成的分子量66万的糖蛋白。生物合成的Tg被释放至滤泡腔。在该过程中，通过过氧化物酶的作用，碘分子与Tg分子中的酪氨酸基结合，进行甲状腺激素的合成。滤泡腔的Tg再次被滤泡细胞摄入，在滤泡细胞内分解，引起甲状腺激素的释放。另外，该过程通过甲状腺激素(TSH)的作用而被激活。因此，在正常时，Tg本身在血中的释放仅略微发生，Tg的血中释放表示甲状腺的某种异常。因此，Tg是器官特异性高、对甲状腺疾病极其有用的标记物。特别地，血中Tg被用作甲状腺分化癌的手术评价、以及知晓术后复发、转移的有无的标记物。此外，对于在格雷夫斯病(日语：バセドウ病)中的治疗的效果、缓解的指标、先天性甲状腺功能低下症的病型的确定、鉴别、治疗监测等也是有用的。另外，还暗示了通过与图像诊断的组合来鉴别结节性甲状腺瘤的术前诊断、良性甲状腺疾病和恶性肿瘤的可能性。
但是，在受试者为抗甲状腺球蛋白抗体(TgAb)阳性的情况下，实际上即使是Tg高值，有时也因在测定方面的问题而导致成为低值。例如，甲状腺癌中，患者的20～30％为TgAb阳性，因此在Tg测定时，需要同时测定TgAb。另外，在TgAb阳性的桥本病中，难以准确测定Tg的量，同样地，在观察到TgAb阳性的其它自身免疫性疾病(格雷夫斯病(Basedow))中，也有可能无法准确测定Tg的量。
已知以准确地测定Tg的量为目的，利用表面活性剂或酸性化剂对试样进行预处理的甲状腺球蛋白测定方法(专利文献1)。专利文献1中记载了在预处理液中可以包含还原剂作为任意成分的主旨，但在实施例中没有使用。另外，还已知利用碱性物质对试样进行预处理的甲状腺球蛋白测定方法(专利文献2)。进而，还已知有使用以合成肽为免疫原而制作的抗Tg单克隆抗体的甲状腺球蛋白测定方法(专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2018/047792
专利文献2：WO 2020/0241443
专利文献3：日本特开平7-46966号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种新的方法，该方法即使在抗甲状腺球蛋白抗体为阳性的样本中，也能够准确地测定样本中的甲状腺球蛋白量。
用于解决技术问题的技术方案
本申请发明人等进行了深入研究，结果发现，通过还原处理，能够使甲状腺球蛋白/抗甲状腺球蛋白抗体免疫复合物解离，成功地制作了以解离后的经还原处理的甲状腺球蛋白为对应抗原的单克隆抗体，发现通过使用了该单克隆抗体的免疫检测，在抗甲状腺球蛋白抗体阳性的样本中也能够准确地测定甲状腺球蛋白，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下的方案。
(1)一种通过免疫检测来测定从生物体分离的样本中的甲状腺球蛋白的方法，其包含利用还原剂处理从生物体分离的样本的预处理工序，其中，该免疫检测是使用以利用还原剂处理得到的甲状腺球蛋白为对应抗原的单克隆抗体或其抗原结合性片段的免疫检测。
(2)根据(1)所述的方法，其中，所述单克隆抗体的对应表位包含在序列号1～5中的任一者所示的氨基酸序列中。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，所述免疫检测为夹心法，所述单克隆抗体或其抗原结合性片段用于该夹心法的第一抗体和第二抗体中的至少任一者。
(4)根据(3)所述的方法，其中，所述第一抗体包含选自序列号1的氨基酸序列中包含所述对应表位的抗体和序列号5的氨基酸序列中包含所述对应表位的抗体中的至少1种，所述第二抗体包含选自序列号2的氨基酸序列中包含所述对应表位的抗体、序列号3的氨基酸序列中包含所述对应表位的抗体和序列号4的氨基酸序列中包含所述对应表位的抗体中的至少1种。
(5)根据(4)所述的方法，其中，所述第一抗体为捕捉抗体，第二抗体为标记抗体。
(6)一种用于进行(1)所述方法的免疫检测试剂盒，其包含还原剂以及单克隆抗体或其抗原结合性片段，所述单克隆抗体或其抗原结合性片段以利用还原剂处理得到的甲状腺球蛋白为对应抗原。
发明效果
根据本发明，即使在抗甲状腺球蛋白抗体阳性的样本中，也能够准确地测定甲状腺球蛋白。
附图说明
图1A为表示下述实施例中得到的表位分析的结果的图。
图1B同上
图1C同上
图2为表示下述实施例中得到的利用各种还原剂的预处理的效果的图。
图3为表示下述实施例中得到的Tg-SH测定系与Tg测定系的相关性的图。
图4为表示下述实施例中得到的低浓度区域中的Tg-SH测定系与Tg测定系的相关性的图。
具体实施方式
本说明书中记载的“％”的浓度只要没有特别记载，则为重量/体积(w/v)的浓度表示。另外，在没有特别记载温度的情况下为室温。
＜甲状腺球蛋白的测定方法＞
本发明中测定的甲状腺球蛋白(Tg)为来自任意动物的Tg，优选为来自哺乳动物(例如，人、猴、猩猩等灵长类；小鼠、大鼠、兔等啮齿类；狗、猫等宠物；猪、牛等家畜；马、羊等役畜)的Tg，更优选为来自灵长类的Tg，特别优选为来自人的Tg。
1.预处理工序
本发明的方法是通过使样本与抗体反应的免疫反应来测定样本中存在的Tg的方法，包含在免疫反应(反应工序)之前，通过混合样本和预处理液来进行的预处理工序。通过预处理工序，能够使Tg成为从自身抗体(TgAb)等游离的状态。预处理液包含还原剂。作为还原剂，能够使用2-(二乙基氨基)乙硫醇盐酸盐(2-DEAET)、二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、2-巯基乙醇、巯基乙胺、半胱氨酸等现有的还原剂中的任一种，特别优选能够使用2-DEAET、TCEP、DTT。作为还原剂的浓度，优选能够使Tg/抗Tg抗体免疫复合物解离而不受TgAb的影响的浓度。该浓度根据使用的还原剂而不同，能够通过下述实施例中具体记载的方法进行研究。简单地说，是对于利用各种浓度的还原剂进行了预处理得到的样本，在TgAb存在下以及在TgAb不存在下，除此以外，在相同的条件下进行免疫检测，在TgAb存在下以及在TgAb不存在下免疫检测的测定值不会不同的浓度。如下述实施例中具体记载的那样，该浓度(预处理时的与样本混合后的最终浓度)以2-DEAET计为约150mM以上，以DTT计为约10mM以上，以TCEP计为约5mM以上。还原剂的浓度的上限没有特别限定，只要是不受TgAb的影响的浓度，就没有提高还原剂的浓度的意义，因此通常为上述各浓度的4倍以下，优选为2倍以下。即，2-DEACT的浓度的上限例如为600mM，优选为300mM，DTT的浓度的上限例如为40mM，优选为20mM，TCEP的浓度的上限例如为20mM，优选为10mM。
本发明中使用的样本只要是能够含有Tg的试样就没有特别限定，例如可举出血清、血浆、全血、尿、便、口腔粘膜、咽喉粘膜、肠道粘膜和活检试样(例如甲状腺细针穿刺抽吸细胞诊断(Fine needle aspiration：FNA)试样、肠道试样、肝脏试样)。优选样本为血液样本(全血、血清或血浆)。更优选样本为血清或血浆。
在预处理液中，根据需要，也可以包含尿素、硫脲等其它蛋白质改性剂。改性剂的浓度以处理时浓度计优选为0.1M以上，进一步优选为0.5M以上且小于4M。另外，在预处理液中，为了增强处理效果，可以添加单糖类、二糖类、柠檬酸和柠檬酸盐类中的任一种或将它们组合添加。进而，预处理液中也可以包含EDTA等螯合剂。另外，预处理液中也可以包含表面活性剂。作为表面活性剂，阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂均可使用。作为两性离子型表面活性剂的例子，可举出C10APS(N-癸基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐)、C12APS(N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐)、C14APS(N-十四烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐)、C16APS(N-十六烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐)。作为阴离子型表面活性剂的例子，可举出十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌氨酸(NLS)、十二烷基硫酸锂、十二烷基苯磺酸钠、脱氧胆酸。作为阳离子型表面活性剂的例子，可举出癸基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵(C16TAC)、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、月桂基吡啶鎓氯化物、十四烷基吡啶鎓氯化物、十六烷基吡啶鎓氯化物等。作为非离子型表面活性剂的例子，可举出TritonX 100、TritonX 114等聚氧乙烯异辛基苯基醚类、NP-40等聚氧乙烯壬基苯基醚类、Tween80等聚氧乙烯脱水山梨醇烷基酯类。表面活性剂的含量，例如以预处理液的重量为基准，为1～10％，优选为3～8％。
预处理工序只要是不对免疫检测造成不良影响的温度就没有特别限定，例如可以为0℃～37℃，但由于可以在室温没有问题地实施，因此在室温进行是简便的，故优选。
2.反应工序
本发明的方法的上述预处理工序中得到的样本混合液，继而供于免疫检测的反应工序。在反应工序中，根据需要将样本混合液与缓冲液混合，使混合液中的抗原与针对Tg的抗体或其抗原结合性片段反应。需要说明的是，Tg的免疫检测本身的各种方法是公知的，可以采用能够对Tg进行定量的任一种免疫检测。
作为上述缓冲液，例如可举出以MES缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、碳酸缓冲液为基础的缓冲液，能够特别优选使用以磷酸缓冲液为基础的缓冲液。
本发明的方法中使用的抗体是以利用还原剂处理得到的Tg(以下有时称为“Tg-SH”)为对应抗原的单克隆抗体。在此，“以Tg-SH为对应抗原”是指以Tg-SH为免疫原而诱导的、与Tg-SH进行抗原抗体反应的单克隆抗体。以Tg-SH为对应抗原的单克隆抗体能够通过使用Tg-SH作为免疫原的常规方法即杂交瘤法(参照下述实施例)得到。单克隆抗体的同种型没有限定，可以是IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY中的任一种同种型。另外，也能够使用F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等上述单克隆抗体的抗原结合性片段(在以下的说明(直至实施例之前)中，“抗体”这一术语除了在上下文中明确不是这样的情况以外，是指“抗体或其抗原结合性片段”)。另外，在如夹心法那样使用2种抗体的情况下，只要至少任一者为以Tg-SH为对应抗原的单克隆抗体即可，另一者可以为多克隆抗体，但如果两者均为以Tg-SH为对应抗原的单克隆抗体，则测定值的再现性提高，因此优选。
在下述实施例中，通过使用Tg-SH作为免疫原的杂交瘤法，得到5种单克隆抗体。各单克隆抗体的表位分别包含在序列号1～5中。通过使用Tg-SH作为免疫原的杂交瘤法，得到了5种各自不同的单克隆抗体，因此表明以Tg-SH为对应抗原的单克隆抗体能够通过使用Tg-SH作为免疫原的常规方法的杂交瘤法具有再现性而得到。
针对Tg-SH的抗体可以在固相上固相化。在本说明书中，有时将已在固相上固相化的抗体或在固相上固相化的抗体简称为固相化抗体。作为固相，例如可举出能够收纳或搭载液相的固相(例如，板、膜、试管等支承体、以及孔板、微流路、玻璃毛细管、纳米柱、整体柱等容器)、以及能够悬浮或分散于液相中的固相(例如，颗粒等固相载体)。作为固相的材料，例如可举出玻璃、塑料、金属和碳。作为固相的材料，还能够使用非磁性材料或磁性材料，从操作的简便性等观点出发，优选磁性材料。固相优选为固相载体，更优选为磁性固相载体，进一步更优选为磁性颗粒。作为抗体的固相化方法，能够利用以往公知的方法。作为这样的方法，例如可举出物理吸附法、共价键法、利用亲和性物质(例如生物素、链霉亲和素)的方法、以及离子键法。在特定的实施方式中，针对Tg-SH的抗体是在固相上固相化的抗体，优选是在磁性的固相中固相化的抗体，更优选是在磁性颗粒上固相化的抗体。
反应工序可以在将预处理工序的混合液与缓冲液混合后，使其与固相化的抗体接触，另外，也可以在缓冲液中预先加入例如在颗粒上固相化的抗体而制成颗粒液，使上述混合液与颗粒液混合。反应工序可以例如免疫凝聚法、竞争法那样仅通过一次反应工序来实施，也可以如夹心法那样设置二次反应工序。需要说明的是，在设置二次反应工序的情况下，在一次反应工序与二次反应工序之间，可以设置用于去除未反应成分的清洗工序。
针对Tg-SH的抗体可以利用标记物质进行标记。本说明书中，有时将利用标记物质进行标记的抗体简称为标记抗体。作为标记物质，例如可举出酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶(luciferase)、β-半乳糖苷酶)、亲和性物质(例如，链霉亲和素、生物素)、荧光物质或蛋白质(例如，荧光素(fluorescein)、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质)、发光或吸光物质(例如虫荧光素(luciferin)、水母发光蛋白(aequorin)、吖啶鎓(acridinium)、钌)、放射性物质(例如3H、14C、32P、35S、125I)。另外，本发明的方法中，在设置二次反应的情况下，作为二次反应中使用的抗体，可以利用这样的标记物质进行标记。
在特定的实施方式中，本发明的方法，作为二次反应中使用的抗体，包含识别与针对Tg-SH的抗体不同的表位的针对Tg-SH的其它抗体。由针对Tg-SH的抗体识别的表位与由针对Tg-SH的其它抗体识别的表位的组合没有特别限定。这样的其它抗体的使用例如在利用夹心法的情况下优选。需要说明的是，如上所述，一种抗体可以是与Tg-SH发生抗原抗体反应的多克隆抗体。
3.检测工序
在一次抗体或二次抗体中使用标记的情况下，通过适合于使用的标记的方法，例如在使用酶标记的情况下通过添加酶的底物来进行检测。例如，在使用碱性磷酸酶(ALP)作为标记抗体的情况下，可以是使用3-(2′-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3′-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷二钠盐(AMPPD)作为酶底物的化学发光酶免疫检测法(CLEIA)的体系。
本发明的方法是使用针对Tg-SH的抗体的免疫检测。作为这样的免疫检测，例如可举出直接竞争法、间接竞争法和夹心法。另外，作为这样的免疫检测，可举出化学发光酶免疫检测法(CLEIA)、化学发光免疫检测(CLIA)、免疫比浊法(TIA)、酶免疫检测法(EIA)(例如直接竞争ELISA、间接竞争ELISA和夹心ELISA)、放射免疫检测(RIA)、胶乳凝聚反应法、荧光免疫检测(FIA)和免疫色谱法。这些免疫检测本身是公知的，在此无需详细叙述，分别简单进行说明。
直接竞争法是将针对要测定的靶抗原(本发明中为Tg-SH)的抗体在固相上固相化(关于固相和固相化，如上所述)，进行用于防止非特异吸附的封闭处理(利用血清白蛋白等蛋白质溶液处理固相)后，使该抗体、包含上述靶抗原的受试试样(本发明中，如上所述进行了预处理工序的样本)、和一定量的标记的抗原(标记如上所述)反应，清洗后，对在固相上结合的标记进行定量的方法。受试试样中的抗原和标记抗原与抗体竞争性结合，因此受试试样中的抗原量越多，则在固相上结合的标记的量越少。制作各种已知浓度的抗原标准液，分别测定在固相上固定化的标记量(根据标记的性质，吸光度、发光强度、荧光强度等，以下相同)，制成以抗原浓度为横轴、以标记量为纵轴的标准曲线。针对未知的受试试样，测定标记量，将测定的标记量应用于标准曲线，由此能够测定未知的受试试样中的抗原量。直接竞争法本身在本领域中是公知的，例如记载于US20150166678A1。
在间接竞争法中，将靶抗原(本发明中为Tg-SH)在固相上固相化(关于固相和固相化，如上所述)。接着，固相的封闭处理后，将包含靶抗原的受试试样(本发明中，如上所述进行了预处理工序的样本)与一定量的抗靶抗原抗体混合，使其与上述固相化抗原反应。清洗后，对在固相上结合的上述抗靶抗原抗体进行定量。其能够通过使针对上述抗靶抗原抗体标记的二次抗体(标记如上所述)反应，清洗后，测定标记量，从而进行。制作各种已知浓度的抗原标准液，在固相上分别固定化，测定标记量，制成标准曲线。针对未知的受试试样，测定标记量，将测定的标记量应用于标准曲线，由此能够测定未知的受试试样中的抗原量。需要说明的是，也可以不使用标记二次抗体，而使用标记的一次抗体。间接竞争法本身在本领域中是公知的，例如记载于上述的US20150166678A1。
夹心法中，例如，正向夹心法是在固相上将抗靶抗原抗体固相化(关于固相和固相化，如上所述)，任意地通过封闭进行处理后，使其与包含靶抗原的受试试样(本发明中，如上所述进行了预处理工序的试样)反应，清洗后，使针对靶抗原标记的二次抗体(标记如上所述)反应，清洗后，对在固相上结合的标记进行定量的方法。夹心法中，例如，反向夹心法是使针对靶抗原标记的抗体(标记)与受试试样先反应，使通过标记抗体与靶抗原的结合而产生的抗原抗体复合物与固相化抗体反应，清洗后，对在固相上结合的标记进行定量的方法。另外，也存在使固相化抗体、受试试样和标记抗体同时反应的夹心法。在夹心法中，作为固相化抗体，也可以使用与受试试样反应后在固相中固相化的抗体。在使用在固相中固定化的抗体的情况下，例如，可以在使固相化抗体、受试试样和标记抗体反应后，在固相中将固相化抗体固定化，也可以在使固相化抗体与受试试样反应后，在固相中将固相化抗体固定化，然后与标记抗体反应。制作各种已知浓度的抗原标准液，分别测定在固相中固定化的标记量，制成标准曲线。针对未知的受试试样，测定标记量，将测定的标记量应用于标准曲线，由此能够测定未知的受试试样中的抗原量。夹心法本身在本领域中是公知的，例如记载于US20150309016A1。
例如，在夹心法中，使用第一抗体和第二抗体，关于第一抗体和第二抗体中的至少任一者，优选使用在序列号1～5的任一者所示的氨基酸序列中包含表位的抗体。更优选地，第一抗体为选自在序列号1的氨基酸序列中包含表位的抗体和在序列号5的氨基酸序列中包含表位的抗体中的至少一种，优选为两种，第二抗体为选自在序列号2的氨基酸序列中包含表位的抗体、在序列号3中包含表位的抗体和在序列号4中包含表位的抗体中的至少一种，优选为至少两种，更优选为三种。
优选地，使用第一抗体作为捕获抗体(固相化抗体)，使用第二抗体作为标记抗体。另一方面，也可以使用第二抗体作为捕获抗体，使用第一抗体作为标记抗体。
在上述各种免疫检测中，化学发光酶免疫检测法(CLEIA)、化学发光免疫检测法(CLIA)、酶免疫检测法(EIA)、放射免疫检测法(RIA)、荧光免疫检测法(FIA)是基于进行上述直接竞争法、间接竞争法、夹心法等时使用的标记的种类进行分类的免疫检测。化学发光酶免疫检测法(CLEIA)是使用酶(例如，上述碱性磷酸酶)作为标记，使用产生化学发光性化合物的底物(例如，上述AMPPD)作为底物的免疫检测。酶免疫检测法(EIA)是使用酶(例如上述过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶等)作为标记的免疫检测。作为各酶的底物，使用能够通过吸光度测定等定量的化合物。例如，在过氧化物酶的情况下，使用1,2-苯二胺(OPD)、3,3'5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等，在碱性磷酸酶的情况下，使用对硝基苯基磷酸酯(pNPP)等，在β-半乳糖苷酶的情况下，使用MG：4-甲基伞形酮半乳糖苷、NG：硝基苯基半乳糖苷等，在荧光素酶的情况下，使用虫荧光素等。放射免疫检测(RIA)是使用放射性物质作为标记的方法，作为放射性物质，如上所述，可举出3H、14C、32P、35S、125I等放射性元素。荧光免疫检测(FIA)是使用荧光物质或荧光蛋白质作为标记的方法，作为荧光物质或荧光蛋白质，如上所述可举出荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质等。这些使用标记的免疫检测本身在本领域中是公知的，例如记载于US8039223B、US20150309016A1中。
免疫比浊法(TIA)是利用通过要测定的靶抗原(本发明中为Tg-SH)与针对该抗原的抗体的抗原抗体反应而生成的抗原抗体复合体所导致的浊度增大现象的免疫检测。在抗靶抗原抗体溶液中，添加各种已知浓度的抗原，分别测定浊度，制成标准曲线。针对未知的受试试样，同样测定浊度，将测定的浊度应用于标准曲线，由此能够测定未知的受试试样中的抗原量。免疫比浊法本身是公知的，例如记载于US20140186238A1。胶乳凝聚法与免疫比浊法类似，是替代免疫比浊法中的抗体溶液，使用在表面上将抗靶抗原抗体固定化的胶乳颗粒的悬浮液的方法。免疫比浊法和胶乳凝聚法本身是本领域公知的，例如记载于US7820398B。
免疫色谱法是在滤纸、纤维素膜、玻璃纤维、无纺布等利用多孔性材料形成的基体(也称为基质、条带)上进行上述夹心法、竞争法的方法。例如，在利用夹心法的免疫色谱法的情况下，在上述基体上设置将抗靶抗原抗体固定化的检测区，将包含靶抗原的受试试样(在本发明中，如上所述进行了预处理工序的样本)添加到基体中，从上游侧使展开液流动，使靶抗原移动到检测区，在检测区中固定化。将经固定化的靶抗原用标记的二次抗体进行夹心，检测在检测区中固定化的标记，从而检测受试试样中的靶抗原。通过在比检测区更靠上游侧预先形成包含标记二次抗体的标记区，靶抗原与标记二次抗体的结合体在检测区中固定化。在标记为酶的情况下，还在比检测区更靠上游侧设置包含酶的底物的底物区。在竞争法的情况下，例如能够在检测区将靶抗原固定化，使受试试样中的靶抗原与在检测区中固定化的靶抗原竞争。通过在与检测区相比更靠上游侧预先设置标记抗体区，使受试试样中的靶抗原与标记抗体反应，在检测区中固定化未反应的标记抗体，对标记进行检测或定量，从而能够对受试试样中的靶抗原进行检测或定量。免疫色谱法本身是该领域中是知的，例如记载于US6210898B中被记载。
＜Tg-SH的测定试剂盒＞
本发明的Tg-SH的测定试剂盒是能够实现上述Tg-SH的测定方法的测定试剂。本发明的测定试剂至少包含还原剂以及以Tg-SH为对应抗原的单克隆抗体。
本发明的试剂盒可以在相互隔离的形态或组合物的形态中包含各构成成分。具体而言，各构成成分可以在分别收纳于不同的容器(例如，管、板)的形态提供，也可以部分构成成分以组合物的形态(例如，同一溶液中)提供。或者，本发明的试剂盒也可以以设备的形态提供。具体而言，可以以构成成分的全部收纳于设备中的形态提供。或者，也可以以构成成分的一部分收纳于设备中的形态提供，其余的成分未收纳于设备中的形态(例如，收纳于不同的容器的形态)提供。在该情况下，未收纳于设备中的构成成分，在靶物质的测定时，可以通过注入到设备中而使用。
在优选的实施方式中，本发明的试剂盒可以具有与要采用的免疫检测的种类相应的构成。例如，在采用夹心法的情况下，本发明的试剂盒作为必需的构成成分，可以包含i)预处理液、ii)针对Tg-SH的抗体、iii)缓冲液、以及作为任意的构成成分的iv)针对Tg-SH的其它抗体、v)标记物质、vi)稀释液、以及根据需要vii)与标记物质反应的基质。ii)和iii)的构成成分可以包含在同一溶液中。iv)的构成成分可以被v)标记物质标记化。优选地，针对Tg-SH的抗体可以在磁性颗粒上固相化。
以下，基于实施例具体地说明本发明。不过，本发明并不限定于下述实施例。
实施例
1.抗Tg-SH单克隆抗体的获得
(A)免疫抗原的制备
使用包含150mM NaCl的磷酸缓冲液(pH7.2)将自然人甲状腺球蛋白(NaturalHuman Thyroglobulin protein)(abcam公司，ab96518)制备成10mg/mL。以最终浓度成为10mM的方式，在其中添加还原剂TCEP(三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine))，在37℃反应30分钟。使用脱盐柱，在包含1mM EDTA和150mM NaCl的磷酸缓冲液(pH6.0)中进行缓冲液交换，由此制备还原处理甲状腺球蛋白(Tg-SH)。
(B)免疫和细胞融合
使用包含150mM NaCl的10mM磷酸缓冲生理盐水(pH7.3)(PBS)将通过上述方法制备的抗原蛋白质Tg-SH以最终浓度成为1.0mg/ml的方式进行稀释，与等量的弗氏佐剂(Freund's adjuvant)混合，对4～6周龄的BALB/c小鼠皮下给药50～100μg。每2周进行同样的追加免疫，进而将溶解于PBS的抗原蛋白质100μg作为最终免疫进行腹腔内给药，在最终免疫后第三天从该小鼠无菌地摘除脾脏，通过常规方法的杂交瘤法制作杂交瘤，回收其培养上清，用于后述的筛选。
(C)抗Tg-SH抗体产生杂交瘤的筛选
通过使用上述抗原蛋白质Tg-SH的ELISA法查找产生目标抗体的杂交瘤。将利用包含1mM TCEP和6M尿素的TBS以成为1μg/mL的方式进行稀释的Tg-SH抗原添加到Nunc公司的多模块板(multi-module plate)中，每孔50μL，在4-8℃静置一夜。除去抗原稀释液后，每孔加入100μL的封闭液(0.1％酪蛋白、1mM EDTA、PBS)，在室温静置1小时，制备抗原固相板。
在抗原固相板的各孔中加入利用反应液(0.1％酪蛋白、1mM EDTA、PBS)稀释的杂交瘤的培养上清50μL，在室温静置1小时。利用包含0.05％Tween20(商品名)的PBS清洗孔后，加入50μL的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG Fc特异性抗体，在室温静置1小时。利用包含0.05％Tween20(商品名)的PBS清洗孔后，在各孔中添加TMB溶液50μL，诱导显色。然后，将2M H2SO4添加到各孔中，使反应停止，在450nm波长处测定吸光度，得到具有期望的反应特异性的产生抗体杂交瘤。
(D)杂交瘤的克隆
对于得到的杂交瘤，通过极限稀释法进行单一克隆化，建立产生抗体杂交瘤。将得到的杂交瘤命名为9E12、A1010、A1024、A2029、A2068。
(E)抗Tg-SH单克隆抗体的制备
将建立的产生抗体杂交瘤在无血清培养基(Hybridoma-SFM、GIBCO)中驯化培养。在T75烧瓶扩大培养至50mL，在细胞密度为约5×105cells/ml时，移植至利用500mL的无血清培养基充满的培养袋(Nipro公司)。培养2-4周，回收培养上清。将培养液应用于填充有Protein G Sepharose(GE Healthcare公司)的柱，利用pH3的缓冲液洗脱结合的抗体。利用2M Tris(pH8)将洗脱液迅速中和，利用脱盐柱与PBS进行缓冲液交换。能够从培养液500mL中获得5-20mg的抗Tg-SH单克隆抗体。
2.使用甲状腺球蛋白部分长度抗原的抗Tg-SH抗体的反应区域的鉴定使用在大肠杆菌中表达的6种Tg部分长度抗原(TGN，20-377a.a；TG2F，359-726a.a.；TG4F，1074-1469a.a；TG5F，1470-1891a.a.；TG6F，1892-2187；TGC，2336-2768a.a.表1中示出各自的氨基酸序列)确定各抗体的反应部位。利用包含1mM TCEP和6M尿素的TBS以成为1μg/mL的方式稀释包含用作免疫原的Tg-SH的各抗原，在Nunc公司的多模块板中每孔添加50μL，在4-8℃静置一夜。除去抗原稀释液后，每孔添加100μL的封闭液(0.1％酪蛋白、1mM EDTA、PBS)，在室温静置1小时，制备抗原固相板。
在抗原固相板的各孔中添加利用反应液(0.1％酪蛋白、1mM EDTA、PBS)稀释的抗Tg-SH抗体50μL，在室温静置1小时。利用包含0.05％Tween20(商品名)的PBS清洗孔后，加入50μL的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG Fc特异性抗体，在室温静置1小时。利用包含0.05％Tween20(商品名)的PBS清洗孔后，在各孔中添加TMB溶液50μL，诱导显色。然后，将2M H2SO4添加到各孔中，使反应停止，在450nm波长处测定吸光度。结果显示9E12识别TGN，A1010识别TGC，A1024、A2029和A2068识别TG5F(表2)。
[表1]
表1.甲状腺球蛋白部分长度抗原的氨基酸序列
需要说明的是，将表1中的各部分序列分别示于序列表的序列号6～11。
[表2]
固相抗原 序列 9E12 A1010 A1024 A2029 A2068
Tg-SH 全长 1.717 1.275 2.309 2.105 1.961
Tg-N 20-377 2.721 0.071 0.107 0.050 0.049
Tg-2F 359-726 0.038 0.142 0.604 0.218 0.197
Tg-4F 1074-1469 0.034 0.032 0.051 0.030 0.029
Tg-5F 1470-1891 0.152 0.129 2.617 2.659 2.427
Tg-6F 1892-2187 0.061 0.024 0.146 0.039 0.054
Tg-C 2336-2768 0.022 2.261 0.078 0.023 0.027
3.抗Tg-SH抗体的表位解析
为了解析得到的抗Tg-SH抗体的表位，使大肠杆菌表达上述的部分长度甲状腺球蛋白抗原TGN、TG5F、TGC的缺失突变体，根据通过使用该大肠杆菌破碎液的斑点印迹(Dotblot)法进行解析而得到的图1A～C所示的结果，9E12抗体显示表位存在于34-50a.a.的CELQRETAFLKQADYVP序列(序列号1)内，A1024显示表位存在于1579-1592a.a.的VIFDANAPVAVRSK(序列号2)内，A2029显示表位存在于1593-1608a.a.的VPDSEFPVMQCLTDCT(序列号3)内，A2068显示表位存在于1793-1809a.a.的LGDQEFIKSLTPLEGTQ序列(序列号4)内，A1010显示表位存在于2683-2698a.a.的TPWPDFVPRAGGENYK序列(序列号5)内。需要说明的是，图1A～C所示的数值(例如，TGN20-377的20-377)是指甲状腺球蛋白的全长蛋白质(序列号12)的氨基酸位置。需要说明的是，Anti-TrpE确认到在本解析中使用的硝化纤维素膜上固定有目标蛋白质。
4.抗Tg-SH单克隆抗体的反应性评价
对于取得的Tg-SH单克隆抗体，比较与非还原Tg和还原型Tg(Tg-SH)的反应性。将使用PBS以成为1μg/mL的方式稀释自然人甲状腺球蛋白(Natural Human Thyroglobulinprotein)(abcam公司，ab96518)得到的液体作为非还原Tg，将使用包含5mM TCEP的PBS稀释得到的液体作为Tg-SH，在Nunc公司的多模块板中每孔添加这些抗原50μL，在4-8℃静置一夜。除去抗原稀释液后，每孔加入100μL的封闭液(0.1％酪蛋白、1mM EDTA、PBS)，在室温静置1小时，制备抗原固相板。在抗原固相板的各孔中添加利用反应液(0.1％酪蛋白、1mMEDTA、PBS)稀释得到的抗Tg抗体和抗Tg-SH抗体50μL，在室温静置1小时。利用包含0.05％Tween20(商品名)的PBS清洗孔后，添加50μL的碱性磷酸酶(ALP)标记的抗小鼠IgG Fc特异性抗体，在室温静置1小时。利用包含0.05％Tween20(商品名)的PBS清洗孔后，在各孔中添加包含AMPPD的底物液50μL(LUMIPULSE(注册商标)底物液、富士瑞必欧公司制造)，利用酶标仪测定基于酶反应的化学发光。
将结果示于表3。常规的抗Tg抗体A和B与非还原Tg的反应性相比，与Tg-SH的反应性为10％以下，但获得的抗Tg-SH抗体与非还原Tg相比，对Tg-SH显示出高反应性。
[表3]
表3各抗体与非还原Tg和Tg-SH的反应性比较
5.高灵敏度自动分析测定系的构建
以下，进行(A)抗体结合铁氧体颗粒的制备和(B)碱性磷酸酶(ALP)标记抗体的制备，构建高灵敏度自动分析测定系。
(A)抗体结合磁性颗粒的制备
在磁性颗粒中添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)，在室温反应30分钟。将铁氧体颗粒清洗后，添加抗Tg-SH抗体或抗Tg抗体，在室温利用直立圆筒混合机(end-over mixer)搅拌60分钟。为了使反应停止，添加1M Tris(pH7.0)，在室温利用直立圆筒混合机搅拌30分钟。使该颗粒分散于保存缓冲液(50mM Tris、2.0％BSA、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％NaN3、pH7.2)中，制备抗体结合磁性颗粒。
(B)碱性磷酸酶(ALP)标记抗体的制备
将脱盐处理后的单克隆抗体进行胃蛋白酶消化，使用偶联缓冲液(0.1M磷酸缓冲液、1mM EDTA、pH6.0)进行凝胶过滤纯化，得到去除了Fc区域的抗体。接着，添加2-巯基乙胺(终浓度10mM)，在37℃静置3小时，进行硫醇化。进一步使用偶联缓冲液进行脱盐处理，得到Fab′抗体。另一方面，将脱盐处理的碱性磷酸酶和N-(4-马来酰亚胺丁酰氧基)-琥珀酰亚胺(GMBS)在0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)中混合，在30℃静置1小时进行马来酰亚胺化。使用偶联缓冲液进行脱盐处理后，将Fab′与马来酰亚胺化碱磷酸酶以摩尔比1∶1的比例混合，在25℃静置30分钟进行偶联。在偶联液中添加2-巯基乙胺(终浓度2mM)，在室温静置30分钟，使反应停止。进一步添加碘乙酰胺(终浓度10mM)，在室温静置30分钟，将游离的硫醇基封端。浓缩，进行凝胶过滤纯化，得到ALP标记抗体。
(C)抗体的组合
作为非还原Tg测定系(以下称为Tg测定系)，组合抗Tg抗体A结合铁氧体颗粒和ALP标记抗Tg抗体B，Tg-SH测定系通过将作为捕获抗体的9E12和A1010的共结合铁氧体颗粒与作为ALP标记体(标记抗体)的A1024、A2029和A2068混合组合，构建各自的测定系。
6.还原预处理的效果确认试验
(A)还原预处理液的制备
将预处理液的基本组成设为2M精氨酸盐酸盐、50mM Tris、pH7.5，制备以还原剂2-DEAET(2-二乙基氨基乙硫醇盐酸盐)为0-500mM，DTT(二硫苏糖醇)为0-50mM，TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)为0-50mM的浓度范围添加得到的还原预处理剂。
(B)TgAb阳性模型样本的制备
利用马血清将自然人甲状腺球蛋白(Natural Human Thyroglobulin protein)(abcam公司、ab96518)稀释，通过以成为500IU/mL的方式添加LUMIPULSE Presto TgAb(富士瑞必欧公司)的TgAb校准品(3000IU/mL)，由此制备TgAb阳性模型样品[TgAb(+)]。另一方面，通过相同方法添加TgAb校准品(0IU/mL)作为TgAb阴性模型样本[TgAb(-)]。
(C)测定方法
将样本30μL和预处理液90μL混合，在室温静置30分钟，制备预处理样本。其中将50μL与包含抗Tg-SH抗体或抗Tg抗体结合磁性颗粒的磁性颗粒液(50mM Tris-HCl、150mMNaCl、20mM EDTA3Na、5％Gelatin from cold water fish skin、1M精氨酸盐酸盐、100mM碘乙酰胺、pH7.5)50μL混合，在37℃反应8分钟。对磁性颗粒进行集磁·清洗，除去未与磁性颗粒结合的成分，通过添加50μL用标记物稀释液(50mM MES、100mM NaCl、0.3mM ZnCl2、3mMMgCl2、2％BSA、5μg/mL Inactive ALP、0.1％ProClin 300、pH6.8)以成为0.2μg/mL的方式稀释的ALP标记抗Tg-SH抗体或抗Tg抗体，在37℃反应8分钟。对磁性颗粒进行集磁·清洗，除去未与磁性颗粒结合的成分，添加包含AMPPD的底物液(LUMIPULSE(注册商标)底物液、富士瑞必欧公司制造)200μL，对酶反应产生的发光量进行计数。本实施例的样本预处理以后的工序全部使用自动分析仪器LUMIPULSE L2400(注册商标、富士瑞必欧公司制造)进行。
(A)结果
将利用各种还原剂的预处理的结果示于图2。在Tg测定系中，在未添加还原剂时，TgAb(+)样本低于TgAb(-)样本的信号，因此显示由于TgAb,Tg测定受到的妨碍。随着还原剂浓度的增加，该影响变小，但信号也大幅降低，因此在TgAb(+)与TgAb(-)的值一致(TgAb完全游离)的还原剂浓度下的测定是困难的。另一方面，Tg-SH测定系通过还原剂的添加而反应性大幅上升，因此显示能够以TgAb完全游离的还原剂浓度测定。以预处理时浓度计，2-DEAET为150mM，DTT为10mM，TCEP为5mM以上的浓度，能够不受到TgAb的妨碍而测定Tg。
7.使用人样本的还原预处理的效果确认试验
(A)还原预处理液的制备
以防止由还原处理引起的样本中蛋白质的凝聚、样本粘度的上升，提高操作性，测定灵敏度的提高为目的，对预处理液组成进行了研究，结果为2.4M尿素、6.4％C16APS(N-十六烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸酯)、0.16M NaCl、50mM Tris、20mM TCEP、pH7.5的条件。比较对照用的Tg测定系使用从该组成中除去TCEP的物质作为预处理液。
(B)TgAb阳性模型样本的制备
通过在使用LUMIPULSE Presto TgAb(富士瑞必欧公司)的TgAb测定TgAb量的甲状腺相关疾病血清或健康人血清中添加样本稀释液(富士瑞必欧公司)或Tg高值样本来制备模型样本。另外，制备使用LUMIPULSE样本稀释液(富士瑞必欧公司)稀释自然人甲状腺球蛋白(Natural Human Thyroglobulin protein)(nhTg、abcam公司、ab96518)而得到的系列、以及以成为750IU/mL的方式添加LUMIPULSE Presto TgAb(富士瑞必欧公司)的TgAb校准品得到的nhTg稀释系列，由此制备表4所示的#1-26的样本。
(C)测定方法
将样本30μL和预处理液90μL混合，在室温静置30分钟，制备预处理样本。将其中50μL与包含抗Tg-SH抗体或抗Tg抗体结合磁性颗粒的磁性颗粒液(100mM Tris-HCl、200mMNaCl、20mM EDTA3Na、0.1％ProClin 300、2％BSA、pH7.5)50μL混合，反应8分钟。对磁性颗粒进行集磁·清洗，除去未与磁性颗粒结合的成分，添加利用标记物稀释液(50mM MES、0.1mMZnCl2、1mM MgCl2、3％BSA、5μg/mL Inactive ALP、0.10％NaN3、pH6.8)以成为0.2μg/mL的方式稀释得到的ALP标记抗Tg-SH抗体或抗Tg抗体50μL，反应8分钟。对磁性颗粒进行集磁·清洗，除去未与磁性颗粒结合的成分，添加包含AMPPD的底物液(LUMIPULSE(注册商标)底物液、富士瑞必欧公司制造)200μL。对酶反应产生的发光量进行计数，使用标准曲线，由上述计数算出样本中的Tg值。校准曲线是与样本同样地测定相当于0、10、50、200、1000ng/mL的Tg量的自然人甲状腺球蛋白(Natural Human Thyroglobulin protein)(nhTg、abcam公司、ab96518)标准液，基于对各标准液得到的发光量而制成。本实施例的样本预处理以后的工序全部使用自动分析仪器LUMIPULSE L2400(注册商标、富士瑞必欧公司制造)进行。
(A)结果
将Tg-SH测定和Tg测定的结果示于表4。图3是Tg-SH测定和Tg测定的相关性的图，图4是将图3的低浓度区域放大的图。与Tg测定系相比，Tg-SH测定系大多为2倍以上的Tg定量值。特别地，在样本#7和#13中，在Tg-SH测定系中能够检测出在Tg测定系中无法检测出的Tg。以上表明，本发明的Tg-SH测定能够避免TgAb引起的测定的妨碍，改善Tg测定诊断中的假低值。
[表4]
表4Tg-SH测定与Tg测定的比较
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Claims (6)

1.一种通过免疫检测来测定从生物体分离的样本中的甲状腺球蛋白的方法，其特征在于，包含利用还原剂处理从生物体分离的样本的预处理工序，
所述免疫检测是使用以利用还原剂处理得到的甲状腺球蛋白为对应抗原的单克隆抗体或其抗原结合性片段的免疫检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单克隆抗体的对应表位包含在序列号1～5中的任一者所示的氨基酸序列中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫检测为夹心法，所述单克隆抗体或其抗原结合性片段用于该夹心法的第一抗体和第二抗体中的至少任一者。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一抗体包含选自序列号1的氨基酸序列中包含所述对应表位的抗体和序列号5的氨基酸序列中包含所述对应表位的抗体中的至少1种，
所述第二抗体包含选自序列号2的氨基酸序列中包含所述对应表位的抗体、序列号3的氨基酸序列中包含所述对应表位的抗体和序列号4的氨基酸序列中包含所述对应表位的抗体中的至少1种。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一抗体为捕捉抗体，第二抗体为标记抗体。
6.一种用于进行权利要求1所述方法的免疫检测试剂盒，其特征在于，包含还原剂以及单克隆抗体或其抗原结合性片段，所述单克隆抗体或其抗原结合性片段以利用还原剂处理得到的甲状腺球蛋白为对应抗原。
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