WO2023013725A1 - サイログロブリンのイムノアッセイ及びそのためのキット - Google Patents

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WO2023013725A1
WO2023013725A1 PCT/JP2022/029921 JP2022029921W WO2023013725A1 WO 2023013725 A1 WO2023013725 A1 WO 2023013725A1 JP 2022029921 W JP2022029921 W JP 2022029921W WO 2023013725 A1 WO2023013725 A1 WO 2023013725A1
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antibody
antigen
immunoassay
thyroglobulin
labeled
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PCT/JP2022/029921
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修 新井
慎太郎 八木
克己 青柳
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株式会社先端生命科学研究所
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Publication date
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
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    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
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    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Definitions

  • the present invention relates to a thyroglobulin immunoassay and a kit therefor.
  • Thyroglobulin is a glycoprotein with a molecular weight of 660,000 that is produced only by thyroid follicular cells. Biosynthesized Tg is released into the follicular cavity. During this process, an iodine molecule binds to the tyrosine group in the Tg molecule by the action of peroxidase to synthesize thyroid hormone. The Tg in the follicular cavity is re-incorporated into the follicular cells and degraded within the follicular cells, resulting in the release of thyroid hormone. This process is also activated by the action of thyroid stimulating hormone (TSH).
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • Tg itself is released into the blood only slightly, and the release of Tg into the blood indicates some abnormality of the thyroid gland. Therefore, Tg has high organ specificity and is a very useful marker for thyroid diseases.
  • blood Tg is used as a marker for surgical evaluation of differentiated thyroid cancer and for determining the presence or absence of postoperative recurrence and metastasis.
  • it is useful for effects of treatment in Basedow's disease, an index of remission, determination and differentiation of disease type of congenital hypothyroidism, treatment monitoring, and the like.
  • preoperative diagnosis of nodular goiter and differentiation between benign thyroid disease and malignant tumor has been suggested in combination with diagnostic imaging.
  • TgAb anti-thyroglobulin antibody
  • Patent Document 1 A thyroglobulin measurement method is known in which a sample is pretreated with a surfactant or an acidifying agent for the purpose of accurately measuring the amount of Tg (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 describes that the pretreatment liquid may contain a reducing agent as an optional component, it is not used in the examples.
  • Patent Document 2 a thyroglobulin measuring method in which a sample is pretreated with an alkaline substance.
  • Patent Document 3 a method for measuring thyroglobulin using an anti-Tg monoclonal antibody prepared using a synthetic peptide as an immunogen is also known (Patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a novel method that can accurately measure the amount of thyroglobulin in a specimen that is positive for anti-thyroglobulin antibodies.
  • a thyroglobulin/anti-thyroglobulin antibody immune complex can be dissociated by a reduction treatment, and a monoclonal antibody whose corresponding antigen is the reduced thyroglobulin after dissociation.
  • the inventors have found that immunoassays using this monoclonal antibody can accurately measure thyroglobulin even in anti-thyroglobulin antibody-positive specimens, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • a method for measuring thyroglobulin in a specimen isolated from a living body by an immunoassay comprising a pretreatment step of treating the specimen isolated from the living body with a reducing agent, wherein the immunoassay is treated with a reducing agent.
  • a method which is an immunoassay using a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof whose corresponding antigen is thyroglobulin.
  • the first antibody contains at least one selected from the group consisting of an antibody whose amino acid sequence is SEQ ID NO: 1 and the corresponding epitope is included in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the second antibody is an antibody in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 contains the corresponding epitope
  • an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 contains the corresponding epitope.
  • the method according to (3) comprising at least one selected from the group consisting of antibodies.
  • the method of (4) wherein the first antibody is a capture antibody and the second antibody is a labeled antibody.
  • An immunoassay kit for carrying out the method according to (1) comprising a reducing agent and a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof whose corresponding antigen is thyroglobulin treated with the reducing agent.
  • thyroglobulin can be accurately measured even in anti-thyroglobulin antibody-positive specimens.
  • FIG. 2 is a diagram showing the correlation between the Tg-SH measurement system and the Tg measurement system obtained in the following examples.
  • FIG. 2 is a diagram showing the correlation between the Tg-SH measurement system and the Tg measurement system in the low concentration range obtained in the following examples.
  • concentration of "%" described in this specification is the concentration display of weight/volume (w/v) unless otherwise specified. Moreover, when the temperature is not specified, it is room temperature.
  • Thyroglobulin (Tg) to be measured in the present invention is Tg derived from any animal, but preferably mammals (e.g., primates such as humans, monkeys and chimpanzees; rodents such as mice, rats and rabbits). pets such as dogs and cats; domestic animals such as pigs and cows; working animals such as horses and sheep), more preferably primate-derived Tg, and particularly preferably human-derived Tg. be.
  • mammals e.g., primates such as humans, monkeys and chimpanzees; rodents such as mice, rats and rabbits.
  • pets such as dogs and cats
  • domestic animals such as pigs and cows
  • working animals such as horses and sheep
  • Pretreatment step The method of the present invention is a method for measuring Tg present in a specimen by an immune reaction in which the specimen and an antibody are reacted. Including a pretreatment step by blending. By the pretreatment step, Tg can be released from autoantibodies (TgAb) and the like.
  • the pretreatment liquid contains a reducing agent.
  • 2-(diethylamino)ethanethiol hydrochloride (2-DEAET), dithiothreitol (DTT), tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), 2-mercaptoethanol, mercaptoethylamine, Any existing reducing agent such as cysteine can be used, but 2-DEAET, TCEP and DTT are particularly preferred.
  • concentration of the reducing agent is preferably such that the Tg/anti-Tg antibody immune complex can be dissociated to render it unaffected by the TgAb. This concentration varies depending on the reducing agent used, and can be determined by the method specifically described in the Examples below.
  • this concentration (final concentration after pretreatment and after mixing with the sample) is about 150 mM or higher for 2-DEAET, about 10 mM or higher for DTT, and about 5 mM or higher for TCEP. be.
  • the upper limit of the concentration of the reducing agent is not particularly limited, but there is no point in increasing the concentration of the reducing agent as long as it is not affected by TgAb. is.
  • the upper limit of 2-DEACT concentration is, for example, 600 mM, preferably 300 mM
  • the upper limit of DTT concentration is, for example, 40 mM, preferably 20 mM
  • the upper limit of TCEP concentration is, for example, 20 mM, preferably 20 mM. is 10 mM.
  • Specimens used in the present invention are not particularly limited as long as they can contain Tg. Thyroid fine needle aspiration (FNA) sample, intestinal sample, liver sample).
  • the specimen is a blood specimen (whole blood, serum or plasma). More preferably, the specimen is serum or plasma.
  • the pretreatment liquid may contain other protein denaturants such as urea and thiourea, if necessary.
  • concentration of the denaturing agent is preferably 0.1M or more, more preferably 0.5M or more and less than 4M at the time of treatment.
  • any one of monosaccharides, disaccharides, citric acid, and citrates, or a combination thereof may be added to the pretreatment liquid in order to enhance the treatment effect.
  • the pretreatment liquid may contain a chelating agent such as EDTA.
  • the pretreatment liquid may contain a surfactant. Any of anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants and nonionic surfactants can be used as surfactants.
  • zwitterionic surfactants include C10APS (N-decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate), C12APS (N-dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1 -propanesulfonate), C14APS (N-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate), C16APS (N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate) be done.
  • anionic surfactants include sodium dodecyl sulfate (SDS), N-lauroylsarcosine (NLS), lithium dodecyl sulfate, sodium dodecylbenzenesulfonate, deoxycholic acid.
  • cationic surfactants include decyltrimethylammonium chloride, dodecyltrimethylammonium chloride, tetradecyltrimethylammonium chloride, hexadecyltrimethylammonium chloride (C16TAC), decyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium bromide, tetradecyltrimethylammonium bromide, hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), laurylpyridinium chloride, tetradecylpyridinium chloride, cetylpyridinium chloride and the like.
  • nonionic surfactants examples include polyoxyethylene isooctylphenyl ethers such as Triton X100 and Triton X114, polyoxyethylene nonylphenyl ethers such as NP-40, and polyoxyethylene sorbitan alkyl esters such as Tween80. be done.
  • the surfactant content is, for example, 1 to 10%, preferably 3 to 8%, based on the weight of the pretreatment liquid.
  • the pretreatment step is not particularly limited as long as the temperature does not adversely affect the immunoassay. is preferred.
  • reaction step The specimen mixture obtained in the pretreatment step of the method of the present invention is then subjected to the reaction step of immunoassay.
  • the specimen mixed solution is optionally mixed with a buffer, and the antigen in the mixed solution is reacted with an antibody against Tg or an antigen-binding fragment thereof.
  • Tg immunoassay Various methods of Tg immunoassay are well known, and any immunoassay capable of quantifying Tg can be employed.
  • buffer solution examples include those based on MES buffer, phosphate buffer, Tris buffer, and carbonate buffer, and those based on phosphate buffer can be preferably used.
  • the antibody used in the method of the present invention is a monoclonal antibody whose corresponding antigen is Tg treated with a reducing agent (hereinafter sometimes referred to as "Tg-SH").
  • Tg-SH as a corresponding antigen
  • a monoclonal antibody corresponding to Tg-SH as an antigen can be obtained by a conventional hybridoma method (see Examples below) using Tg-SH as an immunogen.
  • the isotype of the monoclonal antibody is not limited, and may be any isotype of IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, and IgY).
  • antigen-binding fragments of the above monoclonal antibodies such as F(ab')2, Fab', Fab, and Fv (in the following description (before Examples), the term "antibody” is used).
  • term means "antibody or antigen-binding fragment thereof" unless the context clearly dictates otherwise).
  • at least one of them may be a monoclonal antibody having Tg-SH as a corresponding antigen, and the other may be a polyclonal antibody. , both of which are monoclonal antibodies whose corresponding antigens are Tg-SH, since the reproducibility of the measured values is enhanced.
  • the antibody against Tg-SH may be immobilized on a solid phase.
  • an antibody immobilized on a solid phase or an antibody immobilized on a solid phase may be simply referred to as an immobilized antibody.
  • the solid phase includes, for example, a solid phase capable of containing or loading a liquid phase (e.g., supports such as plates, membranes, test tubes, etc., and containers such as well plates, microchannels, glass capillaries, nanopillars, monolithic columns, etc.) , as well as solid phases (eg, solid phase carriers such as particles) that can be suspended or dispersed in a liquid phase.
  • Solid phase materials include, for example, glass, plastics, metals, and carbon.
  • Non-magnetic materials or magnetic materials can also be used as the material of the solid phase, but magnetic materials are preferable from the viewpoint of ease of operation and the like.
  • the solid phase is preferably a solid phase support, more preferably a magnetic solid phase support, even more preferably magnetic particles.
  • a conventionally known method can be used as a method for immobilizing an antibody. Such methods include, for example, physical adsorption methods, covalent binding methods, methods utilizing affinity substances (eg, biotin, streptavidin), and ionic binding methods.
  • the antibody against Tg-SH is an antibody immobilized on a solid phase, preferably an antibody immobilized on a magnetic solid phase, more preferably magnetic particles. It is a phased antibody.
  • the mixed solution in the pretreatment step and the buffer may be mixed and then brought into contact with the immobilized antibody.
  • a particle liquid may be used, and the mixed liquid and the particle liquid may be mixed.
  • the reaction step may be carried out only in a primary reaction step such as immunoagglutination method or competitive method, or may include a secondary reaction step such as sandwich method.
  • you may provide the washing process for removing an unreacted component between a primary reaction process and a secondary reaction process.
  • the antibody against Tg-SH may be labeled with a labeling substance.
  • an antibody labeled with a labeling substance may be simply referred to as a labeled antibody.
  • labeling substances include enzymes (e.g., peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase), affinity substances (e.g., streptavidin, biotin), fluorescent substances or proteins (e.g., fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green fluorescent protein, red fluorescent protein), light-emitting or light-absorbing substances (eg, luciferin, aequorin, acridinium, ruthenium), radioactive substances (eg, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I).
  • the antibody used in the secondary reaction may be labeled with such a labeling substance.
  • the method of the present invention includes another antibody against Tg-SH that recognizes an epitope different from that of the antibody against Tg-SH as an antibody used in the secondary reaction.
  • the combination of an epitope recognized by an antibody against Tg-SH and an epitope recognized by another antibody against Tg-SH is not particularly limited. The use of such separate antibodies is preferred, for example, when sandwich methods are used.
  • one of the antibodies may be a polyclonal antibody that reacts with Tg-SH as an antigen-antibody reaction.
  • a label is used on the primary or secondary antibody, it is detected by a method appropriate for the label used, eg by adding a substrate for the enzyme when an enzyme label is used.
  • a substrate for the enzyme for example, when alkaline phosphatase (ALP) is used as a labeled antibody, 3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3'-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane disodium salt
  • a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) system using (AMPPD) as an enzyme substrate can be used.
  • the method of the present invention is an immunoassay using an antibody against Tg-SH.
  • immunoassays include, for example, direct competition, indirect competition, and sandwich assays.
  • immunoassays include chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), chemiluminescence immunoassay (CLIA), turbidimetric immunoassay (TIA), enzyme immunoassay (EIA) (e.g., direct competitive ELISA, indirect competitive ELISA, and sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), latex agglutination assay, fluorescence immunoassay (FIA), and immunochromatographic methods.
  • CLIA chemiluminescent enzyme immunoassay
  • CLIA chemiluminescence immunoassay
  • TIA turbidimetric immunoassay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • FIA fluorescence immunoassay
  • an antibody against the target antigen to be measured (Tg-SH in the present invention) is immobilized on a solid phase (solid phase and immobilization are as described above), and blocking treatment is performed to prevent nonspecific adsorption.
  • a test sample containing the target antigen in the present invention, a sample subjected to the pretreatment step as described above, and a certain amount of labeled
  • an antigen label bound to the solid phase is quantified.
  • the antigen in the test sample and the labeled antigen competitively bind to the antibody, the greater the amount of antigen in the test sample, the less the amount of label bound to the solid phase.
  • Antigen standard solutions of various known concentrations were prepared, and the amount of labeling (absorbance, luminescence intensity, fluorescence intensity, etc., depending on the nature of the labeling, the same applies hereinafter) was measured for each immobilized on a solid phase to determine the antigen concentration. Create a calibration curve with the horizontal axis and the labeled amount on the vertical axis. By measuring the labeled amount of an unknown test sample and applying the measured labeled amount to a calibration curve, the amount of antigen in the unknown test sample can be measured. Direct competition methods per se are well known in the art and are described, for example, in US 20150166678 A1.
  • the target antigen (Tg-SH in the present invention) is immobilized on a solid phase (solid phase and immobilization are as described above).
  • a test sample containing a target antigen in the present invention, a sample that has undergone the pretreatment step as described above
  • a certain amount of anti-target antigen antibody in the present invention, a sample that has undergone the pretreatment step as described above
  • the anti-target antigen antibody bound to the solid phase is quantified. This can be performed by reacting a labeled secondary antibody (labeled as described above) against the anti-target antigen antibody, washing, and measuring the labeled amount.
  • Antigen standard solutions of various known concentrations are prepared, and the amount of label immobilized on the solid phase is measured for each to prepare a calibration curve.
  • the amount of antigen in the unknown test sample can be measured. It is also possible to use a labeled primary antibody without using a labeled secondary antibody. Indirect competition methods per se are well known in the art and are described, for example, in US 20150166678 A1 mentioned above.
  • the forward sandwich method involves immobilizing an anti-target antigen antibody on a solid phase (the solid phase and immobilization are as described above), optionally treating with blocking, and then applying a target antigen-containing substrate.
  • a test sample in the present invention, a specimen that has undergone the pretreatment step as described above
  • a labeled secondary antibody (labeled as described above) against the target antigen.
  • a labeled antibody (label) against a target antigen is first reacted with a test sample, and the antigen-antibody complex produced by binding the labeled antibody and the target antigen is transferred to the immobilized antibody. is reacted with, and after washing, the label bound to the solid phase is quantified.
  • an immobilized antibody, a test sample, and a labeled antibody are reacted simultaneously.
  • an antibody that is immobilized on a solid phase after reacting with a test sample may be used as the immobilized antibody.
  • the immobilized antibody When using an antibody that is immobilized on a solid phase, for example, the immobilized antibody may be immobilized on the solid phase after reacting the immobilized antibody, the test sample, and the labeled antibody, or the immobilized antibody and After reacting with the test sample, the immobilized antibody may be immobilized on the solid phase and then reacted with the labeled antibody.
  • Antigen standard solutions of various known concentrations are prepared, and the amount of label immobilized on the solid phase is measured for each to prepare a calibration curve. By measuring the labeled amount of an unknown test sample and applying the measured labeled amount to a calibration curve, the amount of antigen in the unknown test sample can be measured.
  • the sandwich method per se is well known in the field and is described, for example, in US 20150309016 A1.
  • a first antibody and a second antibody are used, and for at least one of the first antibody and the second antibody, an epitope is included in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 5. It is preferred to use antibodies. More preferably, the first antibody is at least one, preferably both, selected from the group consisting of an antibody having an epitope in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and an antibody having an epitope in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the second antibody is at least one selected from the group consisting of an antibody having an epitope in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, an antibody having an epitope in SEQ ID NO: 3, and an antibody having an epitope in SEQ ID NO: 4, preferably are at least two, more preferably all three.
  • the first antibody is used as a capture antibody (immobilized antibody) and the second antibody is used as a labeled antibody.
  • the secondary antibody may be used as the capture antibody and the primary antibody as the labeling antibody.
  • chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA), chemiluminescence immunoassay (CLIA), enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA) are the above-described direct competition method, indirect These immunoassays are classified based on the type of label used when performing a competitive method, a sandwich method, or the like.
  • a chemiluminescent enzyme immunoassay is an immunoassay using an enzyme (e.g., alkaline phosphatase, described above) as a label and a substrate that yields a chemiluminescent compound (e.g., AMPPD, described above) as a substrate.
  • An enzyme immunoassay is an immunoassay that uses an enzyme (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase, etc., as described above) as a label.
  • a compound that can be quantified by absorbance measurement or the like is used as a substrate for each enzyme.
  • MG 4-methylumbelliferyl galactoside
  • NG nitrophenyl galactoside and the like in the case of ⁇ -galactosidase
  • luciferin and the like in the case of luciferase.
  • Radioimmunoassay is a method using a radioactive substance as a label, and the radioactive substance includes radioactive elements such as 3 H, 14 C, 32 P, 35 S and 125 I as described above.
  • Fluorescence immunoassay is a method using a fluorescent substance or fluorescent protein as a label, and examples of the fluorescent substance or fluorescent protein include fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, green fluorescent protein, red fluorescent protein, etc., as described above. . Immunoassays using these labels per se are well known in the art and are described, for example, in US 8039223 B and US 20150309016 A1.
  • Turbidimetric immunoassay utilizes a phenomenon in which turbidity increases due to an antigen-antibody complex generated by an antigen-antibody reaction between a target antigen to be measured (Tg-SH in the present invention) and an antibody against the antigen. This is an immunoassay. Antigens of various known concentrations are added to the anti-target antigen-antibody solution, turbidity is measured for each, and a standard curve is created. By similarly measuring the turbidity of an unknown test sample and applying the measured turbidity to the calibration curve, the amount of antigen in the unknown test sample can be measured. Immuno-nephelometry per se is well known and described, for example, in US 20140186238 A1.
  • the latex agglutination method is similar to the immunonephelometry, but is a method using a suspension of latex particles on which anti-target antigen antibodies are immobilized on the surface instead of the antibody solution in the immunonephelometry.
  • Immunoturbidimetry and latex agglutination per se are well known in the art and are described, for example, in US 7,820,398B.
  • the immunochromatographic method is a method in which the sandwich method or competitive method described above is performed on a substrate (also called matrix or strip) formed of porous materials such as filter paper, cellulose membrane, glass fiber, and non-woven fabric.
  • a substrate also called matrix or strip
  • porous materials such as filter paper, cellulose membrane, glass fiber, and non-woven fabric.
  • a test sample containing the target antigen in the present invention, a sample that has undergone the pretreatment step as described above is ) is added to the substrate, and a developing solution is flowed from the upstream side to move the target antigen to the detection zone, where it is immobilized.
  • the target antigen in the test sample is detected by sandwiching the immobilized target antigen with a labeled secondary antibody and detecting the label immobilized in the detection zone.
  • a labeling zone containing the labeled secondary antibody upstream of the detection zone, the complex of the target antigen and the labeled secondary antibody is immobilized in the detection zone.
  • the label is an enzyme
  • a substrate zone containing a substrate for the enzyme is also provided upstream of the detection zone.
  • the target antigen is immobilized in the detection zone, and the target antigen in the test sample can compete with the target antigen immobilized in the detection zone.
  • a labeled antibody zone is provided upstream of the detection zone, the target antigen in the test sample is reacted with the labeled antibody, and the unreacted labeled antibody is immobilized on the detection zone to detect or quantify the label.
  • a target antigen in a test sample can be detected or quantified. Immunochromatographic methods per se are well known in the art and are described, for example, in US 6210898B.
  • the Tg-SH measurement kit of the present invention is a measurement reagent capable of implementing the above-described Tg-SH measurement method.
  • the measurement reagent of the present invention contains at least a reducing agent and a monoclonal antibody whose corresponding antigen is Tg-SH.
  • the kit of the present invention may contain each component in a form isolated from each other or in the form of a composition. Specifically, each component may be provided in a form housed in a different container (e.g., tube, plate), but some components may be in the form of a composition (e.g., in the same solution). may be provided. Alternatively, the kit of the invention may be provided in the form of a device. Specifically, all of the components may be provided in a form housed in the device. Alternatively, some of the components may be provided in a form housed in the device and the rest may be provided in a form not housed in the device (eg, housed in different containers). In this case, components not housed in the device may be used by being injected into the device during measurement of the target substance.
  • a form housed in a different container e.g., tube, plate
  • some components may be in the form of a composition (e.g., in the same solution).
  • the kit of the invention may be provided in the form of
  • the kit of the present invention may have a configuration according to the type of immunoassay to be employed.
  • the kit of the present invention contains, as essential components, i) a pretreatment solution, ii) an antibody against Tg-SH, iii) a buffer, and as optional components, iv) It may contain another antibody against Tg-SH, v) a labeling substance, vi) a diluent, and optionally vii) a substrate that reacts with the labeling substance.
  • Components ii) and iii) may be contained in the same solution.
  • the component of iv) may be labeled with a labeling substance v).
  • the antibody against Tg-SH may be immobilized on magnetic particles.
  • the antigen protein Tg-SH prepared by the above method was added to 10 mM phosphate-buffered saline (pH 7.3) (PBS) containing 150 mM NaCl to a final concentration of 1.0 mg/ml. and mixed with an equal volume of Freund's adjuvant, and administered subcutaneously to 4- to 6-week-old BALB/c mice at 50-100 ⁇ g. A similar booster immunization was performed every 2 weeks, and 100 ⁇ g of the antigen protein dissolved in PBS was administered intraperitoneally as the final immunization.
  • a hybridoma was prepared by the hybridoma method of No. 1, and the culture supernatant was collected and used for the screening described later.
  • Hybridomas producing the desired antibody were screened by ELISA using the antigen protein Tg-SH described above.
  • 50 ⁇ L of Tg-SH antigen diluted to 1 ⁇ g/mL with TBS containing 1 mM TCEP and 6 M urea was added to a Nunc multi-module plate and allowed to stand at 4-8° C. overnight.
  • 100 ⁇ L of blocking solution (0.1% casein, 1 mM EDTA, PBS) was added per well and allowed to stand at room temperature for 1 hour to prepare an antigen solid phase plate.
  • the eluate was rapidly neutralized with 2 M Tris (pH 8) and buffer-exchanged into PBS using a desalting column.
  • 2 M Tris pH 8
  • Tg partial-length antigens expressed in E. coli (TGN, 20-377 aa; TG2F, 359-726 aa; TG4F, 1074-1469 aa; TG5F, 1470-1891 aa; TG6F, 1892-2187; TGC, 2336-2768 aa Table 1 shows the respective amino acid sequences.) were used to identify the reactive site of each antibody.
  • Each antigen containing Tg-SH used as an immunogen was diluted with TBS containing 1 mM TCEP and 6 M urea to 1 ⁇ g/mL, and added to Nunc's multi-module plate at 50 ⁇ L per well. It was left overnight at 8°C. After removing the antigen diluent, 100 ⁇ L of blocking solution (0.1% casein, 1 mM EDTA, PBS) was added per well and allowed to stand at room temperature for 1 hour to prepare an antigen solid phase plate.
  • 1A to 1C refer to the amino acid positions of the full-length thyroglobulin protein (SEQ ID NO: 12).
  • Anti-TrpE was used to confirm that the target protein was immobilized on the nitrocellulose membrane used in this analysis.
  • Tg-SH Tg-SH monoclonal antibodies to non-reduced Tg and reduced Tg
  • N-hydroxysuccinimide (NHS) and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC hydrochloride) were added to the magnetic particles and allowed to react at room temperature for 30 minutes. rice field. After washing the ferrite particles, anti-Tg-SH antibody or anti-Tg antibody was added, and the mixture was stirred at room temperature for 60 minutes with an endover mixer. To stop the reaction, 1 M Tris (pH 7.0) was added and stirred at room temperature for 30 minutes with an endover mixer. The particles were dispersed in a storage buffer (50 mM Tris, 2.0% BSA, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% NaN3, pH 7.2) to prepare antibody-bound magnetic particles.
  • a storage buffer 50 mM Tris, 2.0% BSA, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% NaN3, pH 7.2
  • alkaline phosphatase and N-(4-maleimidobutyryloxy)-succinimide were mixed in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) and allowed to stand at 30°C for 1 hour for maleimidation.
  • Fab' and maleimidated alkaline phosphatase were mixed at a molar ratio of 1:1 and allowed to stand at 25°C for 30 minutes for coupling.
  • 2-Mercaptoethylamine final concentration: 2 mM
  • iodoacetamide final concentration: 10 mM was added and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to block free thiol groups. After concentration and purification by gel filtration, ALP-labeled antibody was obtained.
  • Tg measurement system non-reducing Tg measurement system
  • 9E12 as a capture antibody
  • Tg-SH measurement system 9E12 as a capture antibody
  • TgAb-positive model specimen Natural Human Thyroglobulin protein (abcam, ab96518) is diluted with horse serum, and Lumipulse Presto TgAb (Fujirebio) TgAb calibrator (3000 IU/mL) is adjusted to 500 IU/mL.
  • a TgAb-positive model specimen [TgAb(+)] was prepared by adding as follows. On the other hand, a TgAb calibrator (0 IU/mL) was added in the same manner as a TgAb negative model sample [TgAb(-)].
  • the magnetic particles were collected and washed to remove components not bound to the magnetic particles, and diluted with a conjugate diluent (50 mM MES, 100 mM NaCl, 0.3 mM ZnCl2, 1 mM MgCl2, 2% BSA, 5 ⁇ g/mL 50 ⁇ L of ALP-labeled anti-Tg-SH antibody or anti-Tg antibody diluted to 0.2 ⁇ g/mL with Inactive ALP, 0.1% ProClin300, pH 6.8 was added and allowed to react at 37° C. for 8 minutes.
  • a conjugate diluent 50 mM MES, 100 mM NaCl, 0.3 mM ZnCl2, 1 mM MgCl2, 2% BSA, 5 ⁇ g/mL 50 ⁇ L of ALP-labeled anti-Tg-SH antibody or anti-Tg antibody diluted to 0.2 ⁇ g/mL with Inactive ALP, 0.1% ProClin300, pH 6.
  • Magnetism was collected and washed to remove components not bound to the magnetic particles, and 200 ⁇ L of a substrate solution containing AMPPD (Lumipulse (registered trademark) substrate solution, manufactured by Fujirebio) was added to measure the amount of light emitted by the enzymatic reaction. All the steps after sample pretreatment in this example were performed using an automatic analyzer Lumipulse L2400 (registered trademark, manufactured by Fujirebio Co., Ltd.).
  • FIG. 2 shows the results of pretreatment with various reducing agents.
  • the signal of the TgAb(+) sample was lower than that of the TgAb(-) sample, indicating that the Tg measurement was interfered with by TgAb.
  • This effect becomes smaller as the reducing agent concentration increases, but the signal also decreases significantly. Difficult to measure.
  • the reactivity of the Tg-SH measurement system was greatly increased by the addition of a reducing agent, and it was shown that the measurement can be performed at a reducing agent concentration that completely liberates TgAb.
  • Tg can be measured without interference by TgAb at a concentration of 150 mM for 2-DEAET, 10 mM for DTT, and 5 mM for TCEP as pretreatment concentrations.
  • TgAb-positive model specimens Using TgAb from Lumipulse Presto TgAb (Fujirebio), the TgAb amount was measured.
  • a model sample was prepared by adding In addition, a series of Natural Human Thyroglobulin protein (nhTg, abcam, ab96518) diluted with Lumipulse specimen diluent (Fujirebio) and a TgAb calibrator of Lumipulse Presto TgAb (Fujirebio) to 750 IU/mL Specimens #1-26 shown in Table 4 were prepared by preparing nhTg dilution series added as follows.
  • a calibration curve was obtained for each standard solution by measuring Natural Human Thyroglobulin protein (nhTg, abcam, ab96518) standard solutions corresponding to Tg levels of 0, 10, 50, 200, and 1000 ng/mL in the same manner as the sample. It was created based on the amount of light emitted. All the steps after sample pretreatment in this example were performed using an automatic analyzer Lumipulse L2400 (registered trademark, manufactured by Fujirebio Co., Ltd.).
  • results Table 4 shows the results of Tg-SH measurement and Tg measurement.
  • FIG. 3 shows the correlation between Tg-SH measurement and Tg measurement
  • FIG. 4 is an enlarged view of the low concentration region of FIG.
  • the Tg-SH measurement system often provides twice or more the Tg quantitative value.
  • samples #7 and #13 Tg, which could not be detected by the Tg measurement system, was detected by the Tg-SH measurement system. From the above, it was shown that the Tg-SH measurement of the present invention can avoid interference of measurement by TgAb and can improve falsely low values in Tg measurement diagnosis.

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Abstract

抗サイログロブリン抗体が陽性である検体においても、検体中のサイログロブリン量を正確に測定することができる、新規な方法を提供すること。 生体から分離された検体を、還元剤で処理する前処理工程を含む、生体から分離された検体中のサイログロブリンをイムノアッセイにより測定する方法であり、イムノアッセイが、還元剤で処理したサイログロブリンを対応抗原とするモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いるイムノアッセイである。

Description

サイログロブリンのイムノアッセイ及びそのためのキット
　本発明は、サイログロブリンのイムノアッセイ及びそのためのキットに関する。
　サイログロブリン（Ｔｇ）は、甲状腺濾胞細胞のみでつくられる分子量６６万の糖蛋白である。生合成されたＴｇは濾胞腔へ放出される。この経過中に、ペルオキシダーゼの作用によってＴｇ分子中のチロシン基にヨード分子が結合して、甲状腺ホルモンの合成が行われる。濾胞腔のＴｇは再度濾胞細胞にとりこまれ、濾胞細胞内で分解され、甲状腺ホルモンの放出が起こる。またこの過程は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の働きにより活性化される。故に、正常時では、Ｔｇそのものの血中への放出はごくわずか起こるのみであり、Ｔｇの血中放出は甲状腺の何らかの異常を示す。よってＴｇは臓器特異性が高く甲状腺疾患にはきわめて有用なマーカーである。特に、血中Ｔｇは、甲状腺分化癌の手術評価、および術後再発や転移の有無を知るマーカーとして使用される。その他、バセドウ病での治療の効果、寛解の指標、先天性甲状腺機能低下症の病型の決定や鑑別、治療モニタリングなどにも有用である。また、画像診断との組合せにより結節性甲状腺腫の術前診断や良性の甲状腺疾患と悪性腫瘍とを鑑別する可能性も示唆されている。
　しかし、被験者が抗サイログロブリン抗体（ＴｇＡｂ）陽性の場合、実際はＴｇ高値でも測定上の問題で低値になることがある。例えば、甲状腺癌では患者の２０～３０％がＴｇＡｂ陽性のため、Ｔｇ測定に際しては同時にＴｇＡｂを測定する必要があった。また、ＴｇＡｂ陽性の橋本病ではＴｇの量を正確に測定することは困難であり、同様にＴｇＡｂ陽性が観察される他の自己免疫性疾患（バセドウ病）でもＴｇの量が正確に測定出来ていないおそれがあった。
　Ｔｇの量を正確に測定することを目的として、試料を界面活性剤または酸性化剤で前処理する、サイログリブリン測定方法が知られている（特許文献１）。特許文献１には、前処理液中に、任意成分として還元剤を含めてもよい旨の記載はあるが、実施例では用いられていない。また、試料をアルカリ性物質で前処理する、サイログリブリン測定方法も知られている（特許文献２）。さらに、合成ペプチドを免疫原として作製された抗Ｔｇモノクローナル抗体を用いるサイログリブリン測定方法も知られている（特許文献３）。
WO 2018/047792 WO 2020/0241443 特開平7-46966号公報
　本発明の目的は、抗サイログロブリン抗体が陽性である検体においても、検体中のサイログロブリン量を正確に測定することができる、新規な方法を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、還元処理により、サイログロブリン／抗サイログロブリン抗体免疫複合体を解離させることができることを見出し、解離後の還元処理済サイログロブリンを対応抗原とするモノクローナル抗体を作製することに成功し、このモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイにより、抗サイログロブリン抗体陽性の検体においてもサイログロブリンを正確に測定することができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下のものを提供する。
(1)　生体から分離された検体を、還元剤で処理する前処理工程を含む、生体から分離された検体中のサイログロブリンをイムノアッセイにより測定する方法であって、該イムノアッセイが、還元剤で処理したサイログロブリンを対応抗原とするモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いるイムノアッセイである、方法。
(2)　前記モノクローナル抗体の対応エピトープが、配列番号１～５のいずれかで表されるアミノ酸配列に含まれる、(1)記載の方法。
(3)　前記イムノアッセイがサンドイッチ法であり、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が、該サンドイッチ法の第一抗体及び第二抗体の少なくともいずれか一方に用いられる、(1)又は(2)記載の方法。
(4)　前記第一抗体が、配列番号１のアミノ酸配列に前記対応エピトープが含まれる抗体及び配列番号５のアミノ酸配列に前記対応エピトープが含まれる抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含み、前記第二抗体が、配列番号２のアミノ酸配列に前記対応エピトープが含まれる抗体、配列番号３のアミノ酸配列に前記対応エピトープが含まれる抗体及び配列番号４のアミノ酸配列に前記対応エピトープが含まれる抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、(3)に記載の方法。
(5)　前記第一抗体が捕捉抗体であり、第二抗体が標識抗体である、(4)に記載の方法。
(6)　還元剤と、還元剤で処理したサイログロブリンを対応抗原とするモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とを含む、(1)記載の方法を行うための、イムノアッセイキット。
　本発明によれば、抗サイログロブリン抗体陽性の検体においてもサイログロブリンを正確に測定することができる。
下記実施例において得られた、エピトープ解析の結果を示す図である。 同上 同上 下記実施例において得られた、各種還元剤による前処理の効果を示す図である。 下記実施例において得られた、Ｔｇ－ＳＨ測定系とＴｇ測定系の相関性を示す図である。 下記実施例において得られた、低濃度領域におけるＴｇ－ＳＨ測定系とＴｇ測定系の相関性を示す図である。
　本明細書中で記載される「％」の濃度は、特に記載のない限り、重量／体積（ｗ／ｖ）の濃度表示である。また、温度が特に記載されていない場合には室温である。
＜サイログロブリンの測定方法＞
　本発明で測定されるサイログロブリン（Ｔｇ）は、任意の動物由来のＴｇであるが、好ましくは、哺乳動物（例、ヒト、サル、チンパンジー等の霊長類；マウス、ラット、ウサギ等の齧歯類；イヌ、ネコ等の愛玩動物；ブタ、ウシ等の家畜；ウマ、ヒツジ等の使役動物）由来のＴｇであり、より好ましくは霊長類由来のＴｇであり、特に好ましくは、ヒト由来のＴｇである。
１．前処理工程
　本発明の方法は、検体と抗体とを反応させる免疫反応により検体中に存在するＴｇを測定する方法であるが、免疫反応（反応工程）の前に、検体と前処理液とを混和することによる前処理工程を含む。前処理工程により、Ｔｇを自己抗体（ＴｇＡｂ）等から遊離させた状態とすることができる。前処理液は、還元剤を含む。還元剤としては、２－（ジエチルアミノ）エタンチオール塩酸塩（２－ＤＥＡＥＴ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、２－メルカプトエタノール、メリカプトエチルアミン、システイン等の既存の還元剤をいずれも使用可能であるが、２－ＤＥＡＥＴ、ＴＣＥＰ、ＤＴＴを特に好適に使用できる。還元剤の濃度としては、Ｔｇ／抗Ｔｇ抗体免疫複合体を解離させてＴｇＡｂの影響を受けなくすることが可能な濃度が好ましい。この濃度は、使用する還元剤によって異なり、下記実施例に具体的に記載する方法により調べることができる。簡単に述べると、各種濃度の還元剤で前処理した検体について、ＴｇＡｂ存在下及びＴｇＡｂ非存在下で、他は同じ条件でイムノアッセイを行い、ＴｇＡｂ存在下及びＴｇＡｂ非存在下でイムノアッセイの測定値が異ならないようになる濃度である。下記実施例に具体的に記載されるとおり、この濃度（前処理時の、検体と混合後の終濃度）は、２－ＤＥＡＥＴで約１５０ｍＭ以上、ＤＴＴで約１０ｍＭ以上、ＴＣＥＰで約５ｍＭ以上である。還元剤の濃度の上限は特に限定されないが、ＴｇＡｂの影響を受けない濃度であれば、還元剤の濃度を高める意味はないので、通常は、上記各濃度の４倍以下、好ましくは２倍以下である。すなわち、２－ＤＥＡＣＴの濃度の上限は、例えば、６００ｍＭ、好ましくは３００ｍＭであり、ＤＴＴの濃度の上限は、例えば、４０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭであり、ＴＣＥＰの濃度の上限は、例えば、２０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭである。
　本発明で用いられる検体は、Ｔｇを含有し得る試料であれば特に限定されず、例えば、血清、血漿、全血、尿、便、口腔粘膜、咽頭粘膜、腸管粘膜および生検試料（例、甲状腺穿刺吸引細胞診（Ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ：ＦＮＡ）試料、腸管試料、肝臓試料）が挙げられる。好ましくは、検体は、血液検体（全血、血清または血漿）である。より好ましくは、検体は、血清または血漿である。
　前処理液には、必要に応じて、尿素、チオ尿素等、他のタンパク変性剤が含まれていてもよい。変性剤の濃度は、処理時濃度で０．１Ｍ以上が好ましく、さらに０．５Ｍ以上４Ｍ未満が好ましい。また、前処理液には、処理効果を増強させるために、単糖類、二糖類、クエン酸、及びクエン酸塩類のいずれか、またはこれらを組合せて添加してもよい。さらに、前処理液には、ＥＤＴＡ等のキレート剤が含まれていてもよい。また、前処理液には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤のいずれも使用可能である。両イオン性界面活性剤の例としては、Ｃ１０ＡＰＳ（Ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート）、Ｃ１２ＡＰＳ（Ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート）、Ｃ１４ＡＰＳ（Ｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート）、Ｃ１６ＡＰＳ（Ｎ－ヘキサデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホネート）が挙げられる。陰イオン性界面活性剤の例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ－ラウロイルサルコシン（ＮＬＳ）、ドデシル硫酸リチウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、デオキシコール酸が挙げられる。陽イオン性界面活性剤の例としては、デシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド（Ｃ１６ＴＡＣ）、デシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、ラウリルピリジニウムクロライド、テトラデシルピリジニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライド等が挙げられる。非イオン性界面活性剤の例としては、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ＴｒｉｔｏｎＸ１１４などのポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル類、ＮＰ－４０などのポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル類、Ｔｗｅｅｎ８０などのポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類が挙げられる。界面活性剤の含有量は、例えば、前処理液の重量を基準として１～１０％、好ましくは３～８％である。
　前処理工程は、イムノアッセイに悪影響を与えない温度であれば特に限定されず、例えば、０℃～３７℃で可能であるが、室温において問題なく実施することができるので、室温で行うことが簡便で好ましい。
２．反応工程
　本発明の方法の上記前処理工程で得られた検体混和液は、次いでイムノアッセイの反応工程に供される。反応工程においては、検体混和液を所望により緩衝液と混合させ、混合液中の抗原をＴｇに対する抗体又はその抗原結合性断片と反応させる。なお、Ｔｇのイムノアッセイ自体は種々の方法が周知であり、Ｔｇを定量可能ないずれのイムノアッセイをも採用することができる。
　前記緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液をベースとしたものが挙げられ、特にリン酸緩衝液をベースとしたものを好適に使用できる。
　本発明の方法で使用される抗体は、還元剤で処理したＴｇ（以下、「Ｔｇ－ＳＨ」と呼ぶことがある）を対応抗原とするモノクローナル抗体である。ここで、「Ｔｇ－ＳＨを対応抗原とする」とは、Ｔｇ－ＳＨを免疫原として誘導された、Ｔｇ－ＳＨと抗原抗体反応するモノクローナル抗体である。Ｔｇ－ＳＨを対応抗原とするモノクローナル抗体は、Ｔｇ－ＳＨを免疫原として用いた、常法であるハイブリドーマ法（下記実施例参照）により、得ることができる。モノクローナル抗体のアイソタイプは限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。また、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ等の、上記モノクローナル抗体の抗原結合性断片を用いることも可能である（以下の説明（実施例の前まで）では、「抗体」という語は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、「抗体又はその抗原結合性断片」を意味する）。また、サンドイッチ法のように、２種類の抗体が用いられる場合には、少なくともいずれか一方が、Ｔｇ－ＳＨを対応抗原とするモノクローナル抗体であればよく、他方はポリクローナル抗体であってもよいが、両者ともにＴｇ－ＳＨを対応抗原とするモノクローナル抗体であれば、測定値の再現性が高まるので好ましい。
　下記実施例においては、Ｔｇ－ＳＨを免疫原として用いたハイブリドーマ法により、５種類のモノクローナル抗体が得られた。各モノクローナル抗体のエピトープはそれぞれ、配列番号１～５に含まれる。Ｔｇ－ＳＨを免疫原として用いたハイブリドーマ法により、５種類のそれぞれ異なるモノクローナル抗体が得られたので、Ｔｇ－ＳＨを対応抗原とするモノクローナル抗体は、Ｔｇ－ＳＨを免疫原として用いる常法のハイブリドーマ法により再現性をもって得ることができることが明らかになった。
　Ｔｇ－ＳＨに対する抗体は、固相に固相化されていてもよい。本明細書において、固相に固相化された抗体又は固相に固相化される抗体を、単に固相化抗体ということがある。固相としては、例えば、液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、及びウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）、ならびに液相中に懸濁または分散可能な固相（例、粒子等の固相担体）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、及びカーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料、又は磁性材料を用いることができるが、操作の簡便性等の観点から、磁性材料が好ましい。固相は、好ましくは固相担体であり、より好ましくは磁性固相担体であり、さらにより好ましくは磁性粒子である。抗体の固相化方法としては、従前公知の方法を利用することができる。このような方法としては、例えば、物理的吸着法、共有結合法、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン）を利用する方法、及びイオン結合法が挙げられる。特定の実施形態では、Ｔｇ－ＳＨに対する抗体は、固相に固相化された抗体であり、好ましくは、磁性の固相に固相化された抗体であり、より好ましくは、磁性粒子に固相化された抗体である。
　反応工程は、前処理工程の混和液と緩衝液とを混合した後、固相化した抗体に接触させてもよく、また、緩衝液中に例えば粒子上に固相化した抗体を予め入れて粒子液とし、前記混和液と粒子液とを混合させてもよい。反応工程は、例えば免疫凝集法や競合法のように一次反応工程のみで実施してもよいが、サンドイッチ法のように二次反応工程を設けてもよい。なお、二次反応工程を設ける場合、一次反応工程と二次反応工程の間に、未反応成分を除去するための洗浄工程を設けてもよい。
　Ｔｇ－ＳＨに対する抗体は、標識物質で標識化されていてもよい。本明細書において、標識物質で標識化された抗体を、単に標識化抗体ということがある。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）、発光又は吸光物質（例、ルシフェリン、エクオリン、アクリジニウム、ルテニウム）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。また、本発明の方法では二次反応を設ける場合、二次反応に用いる抗体としては、このような標識物質で標識化されていてもよい。
　特定の実施形態では、本発明の方法は、二次反応に用いる抗体として、Ｔｇ－ＳＨに対する抗体と異なるエピトープを認識するＴｇ－ＳＨに対する別の抗体を含む。Ｔｇ－ＳＨに対する抗体により認識されるエピトープと、Ｔｇ－ＳＨに対する別の抗体により認識されるエピトープとの組合せは、特に限定されない。このような別の抗体の使用は、例えば、サンドイッチ法が利用される場合に好ましい。なお、上記のとおり、一方の抗体はＴｇ－ＳＨと抗原抗体反応するポリクローナル抗体であってもよい。
３．　検出工程
　一次抗体又は二次抗体に標識を用いた場合、使用する標識に適した方法、例えば酵素標識を用いた場合は酵素の基質を添加することによって、検出する。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を標識抗体として用いた場合は、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を酵素基質として用いた化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）の系とすることができる。
　本発明の方法は、Ｔｇ－ＳＨに対する抗体を使用するイムノアッセイである。このようなイムノアッセイとしては、例えば、直接競合法、間接競合法、及びサンドイッチ法が挙げられる。また、このようなイムノアッセイとしては、化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、及びサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及びイムノクロマトグラフィー法が挙げられる。これらのイムノアッセイ自体は周知であり、ここで詳しく述べる必要はないが、それぞれ簡単に説明する。
　直接競合法は、測定すべき標的抗原（本発明ではＴｇ－ＳＨ）に対する抗体を固相に固相化し（固相及び固相化については上記のとおり）、非特異吸着を防ぐためのブロッキング処理（血清アルブミン等のタンパク質溶液で固相を処理）後、この抗体と、前記標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った検体）と、一定量の標識した抗原（標識は上記のとおり）とを反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。被検試料中の抗原と標識抗原とが、抗体に対して競合的に結合するので、被検試料中の抗原量が多いほど、固相に結合する標識の量が少なくなる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化されて標識量（標識の性質に応じて、吸光度、発光強度、蛍光強度等、以下同じ）を測定して、抗原濃度を横軸、標識量を縦軸にとった検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。直接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、US 20150166678 A1に記載されている。
　間接競合法では、標的抗原（本発明ではＴｇ－ＳＨ）を固相に固相化する（固相及び固相化については上記のとおり）。次いで、固相のブロッキング処理後、標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った検体）と、一定量の抗標的抗原抗体とを混合し、前記固相化抗原と反応させる。洗浄後、固相に結合された前記抗標的抗原抗体を定量する。これは、前記抗標的抗原抗体に対する標識した二次抗体（標識は上記のとおり）を反応させ、洗浄後、標識量を測定することにより行うことができる。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化されて標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。なお、標識二次抗体を用いずに、標識した一次抗体を用いることも可能である。間接競合法自体はこの分野において周知であり、例えば、上記したUS 20150166678 A1に記載されている。
　サンドイッチ法のうち、例えば、フォワードサンドイッチ法は、固相に抗標的抗原抗体を固相化し（固相及び固相化については上記のとおり）、任意にブロッキングで処理した後、標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った検体）を反応させ、洗浄後、標的抗原に対する標識した二次抗体（標識は上記のとおり）を反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。サンドイッチ法のうち、例えば、リバースサンドイッチ法は、標的抗原に対する標識した抗体（標識）と被験試料を先に反応させ、標識抗体と標的抗原との結合により生じた抗原抗体複合物を固相化抗体と反応させ、洗浄後、固相に結合した標識を定量する方法である。また、固相化抗体と、被験試料と、標識抗体を同時に反応させるサンドイッチ法もある。サンドイッチ法において、固相化抗体として、被験試料と反応させた後に固相に固相化される抗体を用いてもよい。固相に固定化される抗体を用いる場合、例えば、固相化抗体と被験試料と標識抗体を反応させた後に、固相化抗体を固相に固定化してもよいし、固相化抗体と被験試料とを反応させた後に、固相化抗体を固相に固定化し、その後、標識抗体と反応させてもよい。種々の既知濃度の抗原標準液を作製し、それぞれについて固相に固定化された標識量を測定して、検量線を作成する。未知の被検試料について、標識量を測定し、測定された標識量を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。サンドイッチ法自体はこの分野において周知であり、例えば、US 20150309016 A1に記載されている。
　例えば、サンドイッチ法では、第一抗体及び第二抗体を使用し、第一抗体及び第二抗体の少なくともいずれか一方について、配列番号１～５のいずれかで表されるアミノ酸配列にエピトープが含まれる抗体を用いることが好ましい。より好ましくは、第一抗体は、配列番号１のアミノ酸配列にエピトープが含まれる抗体及び配列番号５のアミノ酸配列にエピトープが含まれる抗体からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは両方であり、第二抗体は、配列番号２のアミノ酸配列にエピトープが含まれる抗体、配列番号３にエピトープが含まれる抗体及び配列番号４にエピトープが含まれる抗体からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つすべてである。
　好ましくは、第一抗体は捕捉抗体（固相化抗体）として用いられ、第二抗体は標識抗体として用いられる。一方で、第二抗体が捕捉抗体として用いられ、第一抗体が標識抗体として用いられてもよい。
　上記した各種イムノアッセイのうち、化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は、上記した直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等を行う際に用いる標識の種類に基づいて分類したイムノアッセイである。化学発光酵素イムノアッセイ法（ＣＬＥＩＡ）は、標識として酵素（例えば、上記したアルカリホスファターゼ）を用い、基質として化学発光性化合物を生じる基質（例えば、上記したＡＭＰＰＤ）を用いて、イムノアッセイである。酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）は、標識として酵素（例えば、上記したペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等）を用いるイムノアッセイである。各酵素の基質としては、吸光度測定等により定量可能な化合物が用いられる。例えば、ペルオキシダーゼの場合には、1,2-フェニレンジアミン(OPD)や3,3'5,5'-テトラメチルベンチジン(TMB)等、アルカリホスファターゼの場合には、p-ニトロフェニルフォスフェート(pNPP)等、β－ガラクトシダーゼの場合には、MG：4-メチルウンベリフェリルガラクトシド、NG：ニトロフェニルガラクトシド等、ルシフェラーゼの場合には、ルシフェリン等が用いられる。放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）は、標識として放射性物質を用いる方法であり、放射性物質としては、上記のとおり３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ等の放射性元素が挙げられる。蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は、標識として蛍光物質または蛍光タンパク質を用いる方法であり、蛍光物質または蛍光タンパク質としては、上記のとおりフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質等が挙げられる。これらの標識を用いるイムノアッセイ自体はこの分野において周知であり、例えば、US 8039223 BやUS 20150309016 A1に記載されている。
　免疫比濁法（ＴＩＡ）は、測定すべき標的抗原（本発明ではＴg－ＳＨ）と、該抗原に対する抗体との抗原抗体反応により生成された抗原抗体複合体により濁度が増大する現象を利用したイムノアッセイである。抗標的抗原抗体溶液に、種々の既知濃度の抗原を添加し、それぞれ濁度を測定し、検量線を作成する。未知の被検試料について、同様に濁度を測定し、測定された濁度を検量線に当てはめることにより、未知の被検試料中の抗原量を測定することができる。免疫比濁法自体は周知であり、例えば、US 20140186238 A1に記載されている。ラテックス凝集法は、免疫比濁法と類似しているが、免疫比濁法における抗体溶液に代えて、表面に抗標的抗原抗体を固定化したラテックス粒子の浮遊液を用いる方法である。免疫比濁法及びラテックス凝集法自体はこの分野において周知であり、例えば、US7,820,398Bに記載されている。
　イムノクロマトグラフィー法は、ろ紙、セルロースメンブレン、ガラス繊維、不織布等の多孔性材料で形成された基体（マトリックスやストリップとも呼ばれる）上で上記したサンドイッチ法や競合法を行う方法である。例えば、サンドイッチ法によるイムノクロマトグラフィー法の場合、抗標的抗原抗体を固定化した検出ゾーンを上記基体上に設け、標的抗原を含む被検試料（本発明では、上記のとおり前処理工程を行った検体）を基体に添加し、上流側から展開液を流して標的抗原を検出ゾーンまで移動させ、検出ゾーンに固定化させる。固定化された標的抗原を、標識した二次抗体でサンドイッチして、検出ゾーンに固定化された標識を検出することにより、被検試料中の標的抗原を検出する。標識二次抗体を含む標識ゾーンを検出ゾーンよりも上流側に形成しておくことにより、標的抗原と標識二次抗体との結合体が検出ゾーンに固定化される。標識が酵素の場合には、酵素の基質を含めた基質ゾーンも検出ゾーンよりも上流側に設けられる。競合法の場合には、例えば、検出ゾーンに標的抗原を固定化しておき、被検試料中の標的抗原と、検出ゾーンに固定化された標的抗原とを競合させることができる。検出ゾーンよりも上流側に標識抗体ゾーンを設けておき、被検試料中の標的抗原と標識抗体を反応させ、未反応の標識抗体を検出ゾーンに固定化して標識を検出又は定量することにより、被検試料中の標的抗原を検出又は定量することができる。イムノクロマトグラフィー法自体は、この分野において周知であり、例えばUS 6210898 Bに記載されている。
＜Ｔｇ－ＳＨの測定キット＞
　本発明のＴｇ－ＳＨの測定キットは、上述のＴｇ－ＳＨの測定方法を実現し得る測定試薬である。本発明の測定試薬は、還元剤と、Ｔｇ－ＳＨを対応抗原とするモノクローナル抗体とを少なくとも含む。
　本発明のキットは、互いに隔離された形態または組成物の形態において各構成成分を含んでいてもよい。具体的には、各構成成分はそれぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよいが、一部の構成成分が組成物の形態（例、同一溶液中）で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
　好ましい実施形態では、本発明のキットは、採用されるべきイムノアッセイの種類に応じた構成を有していてもよい。例えば、サンドイッチ法が採用される場合、本発明のキットは、必須の構成成分として、ｉ）前処理液、ｉｉ）Ｔｇ－ＳＨに対する抗体、ｉｉｉ）緩衝液、並びに任意の構成成分として、ｉｖ）Ｔｇ－ＳＨに対する別の抗体、ｖ）標識物質、ｖｉ）希釈液、及び、必要に応じて、ｖｉｉ）標識物質と反応する基質を含んでいてもよい。ｉｉ）及びｉｉｉ）の構成成分は、同一溶液に含まれていてもよい。ｉｖ）の構成成分は、ｖ）標識物質で標識化されていてもよい。好ましくは、Ｔｇ－ＳＨに対する抗体は、磁性粒子に固相化されていてもよい。
　以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．抗Tg-SHモノクローナル抗体の取得
(A)免疫抗原の調製
　Natural Human Thyroglobulin protein (abcam社、ab96518)を150 mM NaClを含むリン酸バッファー(pH7.2)を用いて10 mg/mLに調製した。ここに還元剤TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン)を最終濃度10 mMとなるように添加し37℃、30分間反応させた。脱塩カラムを用いて1 mM EDTAと150 mM NaClを含むリン酸バッファー(pH6.0)へバッファー交換することで還元処理サイログロブリン(Tg-SH)を調製した。
(B)免疫及び細胞融合
  前記方法により調製した抗原たんぱく質Tg-SHを150 mM NaClを含む10 mMリン酸緩衝生理食塩水（pH7.3）（PBS）を用いて終濃度1.0 mg／mlとなるように希釈し、等量のフロイントアジュバントと混和し、4~6週令のBALB／cマウスに50-100 μｇ皮下投与した。２週間ごとに同様の追加免疫を行い、さらにPBSに溶解した抗原たんぱく質100 μgを最終免疫として腹腔内に投与し、最終免疫後３日目にこのマウスより脾臓を無菌的に摘出し、常法のハイブリドーマ法によりハイブリドーマを作製し、その培養上清を回収し後述のスクリーニングに用いた。
(C)抗Tg-SH抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
　目的の抗体を産生するハイブリドーマを上述の抗原たんぱく質Tg-SHを用いたELISA法により検索した。1 mM TCEPと６ M 尿素を含むTBSで1 μg/mLとなるように希釈したTg-SH抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり50 μL添加し、4-8℃に一夜静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり100 μLのブロッキング液(0.1 ％カゼイン、1 mM EDTA、PBS)を加え、室温に1時間静置し抗原固相プレートを調製した。
　抗原固相プレートの各ウェルに反応液(0.1 ％カゼイン、1 mM EDTA、PBS)で希釈したハイブリドーマの培養上清を50 μL加え、室温に1時間静置した。ウェルを0.05% Tween20（商品名）を含むPBS で洗浄した後、 50 μLのホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)標識された抗マウスIgG Fc特異的抗体を加え、室温に1時間静置した。ウェルを0.05% Tween20（商品名）を含むPBS で洗浄した後、TMB溶液を各ウェルに50 μL添加して、発色誘導させた。その後、2 M H2SO4を各ウェルに添加し反応を停止させ、吸光度を450 nmの波長で測定し、所望の反応特異性を有する抗体産生ハイブリドーマを得た。
(D)ハイブリドーマのクローニング
  得られたハイブリドーマについて、限界希釈法により単一クローン化を行い、抗体産生ハイブリドーマを樹立した。得られたハイブリドーマを9E12、A1010、A1024、A2029、A2068と命名した。
(E)抗Tg-SHモノクローナル抗体の調製
　樹立した抗体産生ハイブリドーマを、無血清培地(Hybridoma-SFM、GIBCO)で馴化培養した。T75フラスコ50 mLまで拡大培養し、細胞密度がおよそ5×105cells/mlとなったときに500 mLの無血清培地で満たした培養バッグ(ニプロ社)へ移植した。2－4週間培養し、培養上清を回収した。プロテインGセファロース(GEヘルスケア社)を充填したカラムに培養液をアプライし、結合した抗体をｐH3の緩衝液で溶出した。2 M Tris(pH8)を用いて溶出液を速やかに中和し、脱塩カラムを用いてPBSへバッファー交換した。培養液500 mLから5-20 mgの抗Tg-SHモノクローナル抗体を取得することができた。
２．　サイログロブリン部分長抗原を用いた抗Tg-SH抗体の反応領域の同定
　大腸菌で発現させたTg部分長抗原6種類(TGN, 20-377 a.a ; TG2F, 359-726 a.a.; TG4F, 1074-1469 a.a ; TG5F, 1470-1891 a.a. ; TG6F, 1892-2187; TGC, 2336-2768 a.a. 表1にそれぞれのアミノ酸配列を示す。) を用いて各抗体の反応部位を特定した。免疫原として用いたTg-SHを含む各抗原を1 mM TCEPと６ M 尿素を含むTBSで1 μg/mLとなるように希釈し、ヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり50 μL添加、4-8℃に一夜静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり100 μLのブロッキング液(0.1 ％カゼイン、1 mM EDTA、PBS)を加え、室温に1時間静置し抗原固相プレートを調製した。
　抗原固相プレートの各ウェルに反応液(0.1 ％カゼイン、1 mM EDTA、PBS)で希釈した抗Tg-SH抗体を50 μL加え、室温に1時間静置した。ウェルを0.05% Tween20（商品名）を含むPBS で洗浄した後、 50 μLのホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)標識された抗マウスIgG Fc特異的抗体を加え、室温に1時間静置した。ウェルを0.05% Tween20（商品名）を含むPBS で洗浄した後、TMB溶液を各ウェルに50 μL添加して、発色誘導させた。その後、2 M H2SO4を各ウェルに添加し反応を停止させ、吸光度を450 nmの波長で測定した。その結果、9E12はTGN、A1010はTGC、A1024、A2029及びA2068はTG5Fを認識することが示された(表2)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 なお、表１中の各部分配列を配列表の配列番号６～１１にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
３．抗Tg-SH抗体のエピトープ解析
　得られた抗Tg-SH抗体のエピトープを解析するために、上述の部分長サイログロブリン抗原TGN、TG5F、TGCの欠失変異体を大腸菌に発現させ、その大腸菌破砕液を用いたドットブロット法により解析して得られた図１Ａ～Ｃに示す結果に基づいて、9E12抗体は、34-50 a.a.のCELQRETAFLKQADYVP配列（配列番号１）内にエピトープが存在することが示され、A1024は1579-1592 a.a.のVIFDANAPVAVRSK（配列番号２）内に、A2029は1593-1608a.a.のVPDSEFPVMQCLTDCT（配列番号３）内に、A2068は1793-1809 a.a.のLGDQEFIKSLTPLEGTQ配列（配列番号４）内にエピトープが存在することが示され、A1010は2683-2698 a.a.のTPWPDFVPRAGGENYK配列（配列番号５）内にエピトープが存在することが示された。なお、図１Ａ～Ｃに示される数値（例えば、TGN20-377の20-377）は、サイログロブリンの全長タンパク質（配列番号１２）のアミノ酸位置を意味する。なお、Anti-TrpEは本解析において使用したニトロセルロース膜上に目的のタンパク質が固定されていることを確認したものである。
４．抗Tg-SHモノクローナル抗体の反応性評価
　取得したTg-SHモノクローナル抗体について、非還元Tgと還元型Tg(Tg-SH)に対する反応性を比較した。Natural Human Thyroglobulin protein (abcam社、ab96518)を1μg/mLとなるようにPBSを用いて希釈したものを非還元Tg、5 mM TCEPを含むPBSを用いて希釈したものをTg-SHとし、それらの抗原をヌンク社のマルチモジュールプレートにウェルあたり50 μL添加し、4-8℃に一夜静置した。抗原希釈液を除いた後、ウェルあたり100 μLのブロッキング液(0.1 ％カゼイン、1 mM EDTA、PBS)を加え、室温に1時間静置し抗原固相プレートを調製した。抗原固相プレートの各ウェルに反応液(0.1 ％カゼイン、1 mM EDTA、PBS)で希釈した抗Tg抗体および抗Tg-SH抗体を50 μL加え、室温に1時間静置した。ウェルを0.05% Tween20（商品名）を含むPBS で洗浄した後、 50 μLのアルカリホスファターゼ(ALP)標識された抗マウスIgG Fc特異的抗体を加え、室温に1時間静置した。ウェルを0.05% Tween20（商品名）を含むPBS で洗浄した後、AMPPDを含む基質液(ルミパルス(登録商標)基質液、富士レビオ社製)を各ウェルに50 μL添加して、酵素反応による化学発光をプレートリーダーで測定した。
　表３に結果を示す。一般的な抗Tg抗体AおよびBは非還元Tgに対する反応性と比較してTg-SHに対する反応性は10％以下であるが、取得した抗Tg-SH抗体は非還元TgよりもTg-SHに対して高い反応性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
５．　高感度自動分析測定系の構築
　以下、(A)抗体結合フェライト粒子の調製と(B)アルカリホスファターゼ(ALP)標識抗体の調製を行い、高感度自動分析測定系を構築した。
(A)抗体結合磁性粒子の調製
　磁性粒子にN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)と1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC塩酸塩）を添加し室温で30分間反応させた。フェライト粒子を洗浄した後、抗Tg-SH抗体又は抗Tg抗体を加え、室温、60分間エンドオーバーミキサーで撹拌した。反応を停止するために、1 M Tris(pH7.0)を添加し室温、30分間エンドオーバーミキサーで撹拌した。この粒子を保存バッファー(50 mM Tris、2.0 % BSA、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% NaN3, pH7.2)に分散させ、抗体結合磁性粒子を調製した。
(B)アルカリホスファターゼ(ALP)標識抗体の調製
　脱塩処理したモノクローナル抗体をペプシン消化し、カップリングバッファー(0.1 M リン酸バッファー、1 mM EDTA、pH6.0)を用いてゲルろ過精製を行い、Fc領域を除去した抗体を得た。次に、2-メルカプトエチルアミン(終濃度10mM)を添加して37℃、３時間静置し、チオール化を行った。更にカップリングバッファーを用いて脱塩処理し、Fab’抗体を得た。 一方、脱塩処理したアルカリホスファターゼとＮ-(4-マレイミドブチリロキシ)-スクシンイミド(GMBS)を0.1 M リン酸バッファー(pH7.0)中で混合し、30℃、１時間静置してマレイミド化を行った。 カップリングバッファーを用いて脱塩処理した後、Fab’とマレイミド化アルカリホスファターゼをモル比1:1の割合で混合し、25℃にて30分静置してカップリングを行った。カップリング液に２-メルカプトエチルアミン(終濃度2 mM)を添加し、室温、30分間静置し、反応を停止させた。さらにヨードアセトアミド(終濃度10 mM)を添加し室温、30分間静置し、遊離のチオール基をブロックした。濃縮し、ゲルろ過精製を行い、ALP標識抗体を得た。
(C)抗体の組み合わせ
　非還元Tg測定系(以降、Tg測定系と称する)として抗Tg抗体A結合フェライト粒子とALP標識抗Tg抗体Bを組み合わせ、Tg-SH測定系は捕捉抗体としての9E12とA1010の共結合フェライト粒子と、ALP標識体（標識抗体）としてのA1024、A2029及びA2068を混合し組み合わせることでそれぞれの測定系を構築した。
６．　還元前処理の効果確認試験
(A)　還元前処理液の調製
　前処理液の基本組成を2M アルギニン塩酸塩、50 mM Tris、pH7.5とし、還元剤2-DEAET(2-ジエチルアミノエタンチオール塩酸塩)は0-500 mM、DTT(ジチオトレイトール)は0-50 mM、TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)は0－50 mMの濃度範囲で添加した還元前処理剤を調製した。
(B) TgAb陽性モデル検体の調製
　Natural Human Thyroglobulin protein (abcam社、ab96518)をウマ血清で希釈し、ルミパルスプレストTgAb(富士レビオ社)のTgAbキャリブレーター(3000 IU/mL)を500 IU/mLとなるように添加することでTgAb陽性モデル検体[TgAb(+)]を調製した。一方、同じ方法でTgAbキャリブレーター(0 IU/mL)を添加したものをTgAb陰性モデル検体[TgAb(-)]とした。
(C)測定方法
　検体30 μL と前処理液90 μLとを混和し、室温で30分間静置し前処理検体を調製した。このうち50 μLを抗Tg-SH抗体または抗Tg抗体結合磁性粒子を含む磁性粒子液(50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、20 mM EDTA 3Na、5% Gelatin from cold water fish skin、1 M アルギニン塩酸塩、100 mM ヨードアセトアミド、pH 7.5)　 50 μLと混合し、37℃で8分間反応させた。磁性粒子を集磁・洗浄して、磁性粒子に未結合の成分を除去し、標識体希釈液(50 mM　MES、100 mM NaCl、0.3 mM ZnCl2、1 mM MgCl2、2%　BSA、5 μg/mL Inactive ALP、0.1% ProClin300、pH6.8で0.2 μg/mLとなるように希釈したALP標識抗Tg-SH抗体または抗Tg抗体を50 μL添加し、37℃で8分間反応させた。磁性粒子を集磁・洗浄して、磁性粒子に未結合の成分を除去し、AMPPDを含む基質液(ルミパルス(登録商標)基質液、富士レビオ社製) 200 μLを添加することで酵素反応による発光量をカウントした。本実施例の検体前処理以降の工程は、すべて自動分析機器ルミパルスL2400(登録商標、富士レビオ社製)を用いて行った。
(A) 結果
　図2に各種還元剤による前処理の結果を示す。Tg測定系において、還元剤無添加の時、TgAb(+)検体はTgAb(-)検体のシグナルよりも低いため、TgAbによりTg測定の妨害を受けていることが示されている。還元剤濃度の増加ととともにこの影響は小さくなるが、シグナルも大きく低下してしまうため、TgAb(+)とTgAb(-)の値が一致する(TgAbが完全に遊離する)還元剤濃度での測定は難しい。一方、Tg-SH測定系は還元剤の添加により反応性が大きく上昇するため、TgAbが完全に遊離する還元剤濃度での測定が可能であることが示された。前処理時濃度で2-DEAETは150 mM、DTTは10 mM、TCEPは5 mM以上の濃度でTgAbの妨害を受けることなくTgを測定できる。
７．　ヒト検体を用いた還元前処理の効果確認試験
(A)還元前処理液の調製
　還元処理による検体中たんぱく質の凝集や検体粘度の上昇を防ぎ、操作性を上げること、測定感度の向上を目的として前処理液組成を検討した結果、2.4 M尿素、6.4% C16APS(N-ヘキサドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート)、0.16M NaCl、50 mM Tris、20 mM TCEP、pH7.5の条件となった。比較対照用のTg測定系はこの組成からTCEPを除いたものを前処理液として用いた。
(B)TgAb陽性モデル検体の調製
　ルミパルスプレストTgAb(富士レビオ社)のTgAbを用いてTgAb量を測定した甲状腺関連疾患血清または健常人血清に対して検体希釈液(富士レビオ社)またはTg高値検体を添加することでモデル検体を調製した。また、Natural Human Thyroglobulin protein (nhTg、abcam社、ab96518)をルミパルス検体希釈液(富士レビオ社)を用いて希釈した系列と、ルミパルスプレストTgAb(富士レビオ社)のTgAbキャリブレーターを750 IU/mLとなるように添加したnhTg希釈系列を調製することで表4に示す#1-26の検体を調製した。
(C)測定方法
　検体30 μL と前処理液90 μLとを混和し、室温で30分間静置し前処理検体を調製した。このうち50 μLを抗Tg-SH抗体または抗Tg抗体結合磁性粒子を含む磁性粒子液(100 mM Tris-HCl、200 mM NaCl、20 mM EDTA 3Na、0.1% ProClin 300、2% BSA、pH 7.5) 50 μLと混合し、8分間反応させた。磁性粒子を集磁・洗浄して、磁性粒子に未結合の成分を除去し、標識体希釈液(50 mM MES、0.1 mM ZnCl2、1 mM MgCl2、3% BSA、5 μg/mL Inactive ALP、0.10% NaN3、pH6.8)で0.2 μg/mLとなるように希釈したALP標識抗Tg-SH抗体または抗Tg抗体を50 μL添加し、8分間反応させた。磁性粒子を集磁・洗浄して、磁性粒子に未結合の成分を除去し、AMPPDを含む基質液(ルミパルス(登録商標)基質液、富士レビオ社製) 200 μLを添加した。酵素反応による発光量をカウントし、検量線を用いて、前記カウントから検体中のTg値を算出した。検量線は、0、10、50、200、1000 ng/mL のTg量に相当するNatural Human Thyroglobulin protein (nhTg、abcam社、ab96518)標準液を、検体と同様に測定し、各標準液について得られた発光量に基づいて作成した。本実施例の検体前処理以降の工程は、すべて自動分析機器ルミパルスL2400(登録商標、富士レビオ社製)を用いて行った。
(A) 結果
　表4にTg-SH測定とTg測定の結果を示す。図3はTg-SH測定とTg測定の相関性であり、図4は図3の低濃度域を拡大したものである。Tg測定系と比較してTg-SH測定系は2倍以上のTg定量値となるものが多い。特に検体#7と#13においてはTg測定系で検出できなかったTgをTg-SH測定系では検出できている。以上より、本発明のTg-SH測定はTgAbによる測定の妨害を回避し、Tg測定診断における偽低値を改善できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004

Claims (6)

  1. 　生体から分離された検体を、還元剤で処理する前処理工程を含む、生体から分離された検体中のサイログロブリンをイムノアッセイにより測定する方法であって、該イムノアッセイが、還元剤で処理したサイログロブリンを対応抗原とするモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いるイムノアッセイである、方法。
  2. 　前記モノクローナル抗体の対応エピトープが、配列番号１～５のいずれかで表されるアミノ酸配列に含まれる、請求項１記載の方法。
  3. 　前記イムノアッセイがサンドイッチ法であり、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が、該サンドイッチ法の第一抗体及び第二抗体の少なくともいずれか一方に用いられる、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記第一抗体が、配列番号１のアミノ酸配列に前記対応エピトープが含まれる抗体及び配列番号５のアミノ酸配列に前記対応エピトープが含まれる抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含み、
    　前記第二抗体が、配列番号２のアミノ酸配列に前記対応エピトープが含まれる抗体、配列番号３のアミノ酸配列に前記対応エピトープが含まれる抗体及び配列番号４のアミノ酸配列に前記対応エピトープが含まれる抗体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記第一抗体が捕捉抗体であり、第二抗体が標識抗体である、請求項４に記載の方法。
  6. 　還元剤と、還元剤で処理したサイログロブリンを対応抗原とするモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とを含む、請求項１記載の方法を行うための、イムノアッセイキット。
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