CN112771377A - 肝疾病的检查方法、其检查试剂盒和伴随诊断药 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基于仅L‑FABP的定量结果即能对从肝疾病早期患者至晚期肝硬化患者进行一致检查的肝疾病检查方法、其检查试剂盒和伴随诊断药。一种方法，所述方法包括对从受试者采集的血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序，并根据所述定量的结果对与血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质的量相关的肝疾病的发展阶段或严重程度进行检查。

Description

肝疾病的检查方法、其检查试剂盒和伴随诊断药
技术领域
本发明涉及基于仅肝型脂肪酸结合蛋白质的测定值即能对从肝疾病早期患者至晚期肝硬化患者进行一致检查且即使与以往检查中使用的血清白蛋白相比检查能力也更高的肝疾病的检查方法、其检查试剂盒和伴随诊断药(コンパニオン診断薬)。
背景技术
慢性肝疾病呈现慢性肝炎、肝硬化等多种病理状况，在晚期(進行した)肝硬化中还会并发肝肾综合征、自发性细菌性腹膜炎这样的并发症。此外，众所周知，慢性肝疾病中肝细胞癌发病率很高。作为肝硬化患者的重症度(重症度)分类、肝储备功能或者预后预测的指标，在世界范围内频繁使用Child-Pugh分类。
血清白蛋白是在肝脏中合成的蛋白，占血清中蛋白质的约50％～70％左右。已由多项临床研究显示它是肝硬化患者中的重要预后预测因子，包含在上述Child-Pugh分类等评分系统中的检查项目中。
作为包括肝功能和肝癌在内的评分系统，存在巴塞罗那临床肝癌(BarcelonaClinic Liver Cancer，BCLC)疾病分期，但其仍包括将血清白蛋白包含在其检查项目中的Child-Pugh分类。
在占肝脏中原发性肝癌中90％以上的肝细胞癌的检查中，将甲胎蛋白(AFP)和PIVKA-II用作肿瘤标志物。已知AFP-L3级分(分画)比AFP对肝细胞癌的特异性高。
肝型脂肪酸结合蛋白质(L-type Fatty Acid Binding Protein；以下也简称为“L-FABP”)存在于肝脏、肾脏等的近端肾小管的细胞质等中。据称特别是在健康人中占肝细胞细胞质内蛋白的7％～11％(例如非专利文献1)。已知L-FABP是在两个反平行β片彼此正交而成的β桶形结构中以两个α螺旋覆盖在β桶形结构上的形式而稳定化，且与两分子的游离脂肪酸结合(例如非专利文献2)。
L-FABP通过蛋氨酸残基的氧化修饰而发生结构变化，L-FABP分子的内部区域暴露(例如非专利文献3)。已知其结果是在通过使用与L-FABP分子的内部区域结合的抗体而使用ELISA等抗原抗体反应的测定中，抗体结合能力发生变化，测定值发生很大变化。此外，据报道，该L-FABP的蛋氨酸残基的氧化修饰是通过2,2'-偶氮二2-脒基丙烷(以下简称为“AAPH”)处理、空气氧化等产生的(专利文献1～专利文献3)。
据报道，血液中L-FABP对非酒精性脂肪性肝炎(NASH：Non-AlcoholicSteatioHepatitis)和慢性C型肝炎的检查有用(非专利文献4、非专利文献5)。已知在NASH中，血液中L-FABP与AST、ALT等这样的肝功能标志物或NAS(NAFLD活动度评分(NAFLDActivity Score))相关(非专利文献6)。此外，作为伴随细胞损伤将肝细胞质内L-FABP释放到血液中这一机制的一种，据报道，在对乙酰氨基酚等引起的药物性肝损伤和肝移植后急性排斥反应伴随的肝损伤中，血液中浓度上升(非专利文献7、非专利文献8)。
在专利文献4中公开了如下方法：在尿试样中添加由还原剂(谷胱甘肽、半胱氨酸、青霉胺等)、离液试剂(尿素、胍等)和表面活性剂(正十二烷基苯磺酸钠等)组成的化合物中的一种或两种作为变性剂，使用这些化合物对尿试样进行预处理，由此提高免疫测定的灵敏度(即作为测定对象物的尿中的蛋白质的测定灵敏度)。在专利文献4中，作为尿中的蛋白质的一例，列举了L-FABP，但没有关于L-FABP的检测的具体记载。此外，在专利文献5中公开了通过使用有机胺化合物在不引起载体粒子自发凝聚的情况下促进基于特异性反应的凝聚的方法。在专利文献6中公开了通过使苯甲脒衍生物等分子内具有NH2-C＝N-的部分结构和环状结构的化合物与试样中的L-FABP接触来提高测定灵敏度的方法。
然而，并没有作为使用与L-FABP分子的内部区域结合的抗体来评价L-FABP的氧化状态的方法的记载。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第6174778号公报
专利文献2：日本特许第6218983号公报
专利文献3：日本特许第6059388号公报
专利文献4：日本特开2014-85208号公报
专利文献5：国际公开WO2007/074860号
专利文献6：国际公开WO2016/136863号
非专利文献
非专利文献1：Vergani，L.，et al.：Mol Cell Biochem，98(1-2)，1990
非专利文献2：Cai，J.，et al.：Biophys J，102：2585-2594，2012
非专利文献3：Yan，J.，et al.：J Lipid Res，50：2445-2454，2009
非专利文献4：Akbal，E.，et al.：Wien Klin Wochenschr，128(1-2)：48-52，2016
非专利文献5：Akbal，E.，et al.：Arch Med Res，44(1)：34-38，2013
非专利文献6：Ozenirler，S.，et al.：Hepatogastroenterology，60(125)：1095-1100，2013
非专利文献7：Karvellas，CJ.，et al.：Hepatology，65(3)：938-949，2017
非专利文献8：Pelsers，MM.et al.：Clin Chem，48(1)：2055-2057，2002
发明内容
发明要解决的技术问题
作为肝疾病中肝储备功能、预后预测等的指标，在世界范围内频繁使用Child-Pugh分类。
然而，已经指出这个评分系统中包含脑病、腹水等的水平这样的主观因素，并且存在其应用仅限于肝硬化患者等方面的问题。
作为Child-Pugh分类中使用的检查项目的血清白蛋白，其应用仅限于肝硬化等晚期肝衰竭；除此之外，在肝衰竭发展并且肝脏中血清白蛋白合成能力大幅下降后等，也不能用于从肝硬化演变为肝癌的许多患者中。此外，血清白蛋白值不会因有无肝癌而改变。
在肝癌合并例中，使用BCLC疾病分期来进行治疗选择，但BCLC中包含Child-Pugh分类作为患者因子。近年来，虽然报道了白蛋白-胆红素(ALBI)分级的有用性，但是还不能说已进行了充分研究。此外，由于未加入肿瘤因子，所以无法预测晚期肝癌(進行肝癌)的预后。从这样的背景出发，需要使包括肝癌在内的所有慢性肝疾病的预后预测成为可能的检查项目。
在占肝脏中原发性肝癌中90％以上的肝细胞癌的检查中，将AFP和PIVKA-II用作肿瘤标志物，但在肝细胞癌中PIVKA-II阳性例为57％左右，并非所有的肝细胞癌都能够被检测到。此外，出于提高AFP的疾病特异性的目的，有时也使用AFP-L3级分，但在保险诊疗中不认可与AFP和PIVKA-II的同时测定，并且仅在强烈怀疑具有恶性肿瘤的可能性的情况下才可以进行计算。
能够对从慢性肝疾病早期至患有肝癌的患者进行一致预后评价的疾病标志物、保证在疾病分期等中使用的临床有用性的评分系统等还不存在。
关于血液中L-FABP，在对乙酰氨基酚引起的急性肝损伤中，虽然在死亡组中血液中L-FABP浓度成为显著高值，但没有关于血液中L-FABP作为NASH、C型肝炎等肝疾病患者中的预后预测因子的有用性的报道。此外，需要能够简便且高精度地进行评价的血液中L-FABP测定系统。进而，迄今为止还没有用于判定L-FABP在体内的氧化状态的方法。
肝细胞癌患者中L-FABP表达量的评价根据基于病理组织的恶性诊断、组织中的基因表达、蛋白质表达量等进行评价。此外，据报道，如果组织中的L-FABP表达量为高值，则预后不良。然而，这些方法包括复杂的工序，可实施的设施有限。此外，没有关于血液中L-FABP在肝癌患者中是否成为高值的报道，需要一种不需要复杂的工序就能够高精度地对肝疾病进行检查的血液中L-FABP测定方法。
本发明是鉴于这样的以往的慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌的检查中的实际情况而完成的，其目的在于提供基于仅L-FABP的定量结果即能对从肝疾病早期患者至晚期肝硬化患者进行一致检查的肝疾病的检查方法、其检查试剂盒和伴随诊断药。
解决技术问题的技术手段
作为本发明的发明人为解决上述课题而反复进行深入研究的结果，发现：(i)血液中L-FABP浓度在患有肝细胞癌的慢性肝疾病患者中成为显著高值；(ii)通过离液试剂或有机胺化合物处理后的L-FABP的测定值在患有肝细胞癌的慢性肝疾病患者中成为高值；(iii)血液中L-FABP总浓度与L-FABP氧化率的乘积在患有肝细胞癌的慢性肝疾病患者中表现出更高的诊断性能，发现与以往的血清白蛋白相比表现出优异的检查能力。
本发明是基于上述发现而完成的。
即，本发明如下所述。
<1>一种对与血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质的量相关的肝疾病的发展阶段(進行度)或严重程度(重篤度)进行检查的方法，所述方法包括对从受试者采集的血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序，并根据所述定量的结果对与血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质的量相关的肝疾病的发展阶段或严重程度进行检查。
<2>如<1>所述的方法，所述检查包括肝疾病引起的死亡风险的预测。
<3>如<2>所述的方法，所述预测是包括天数在内的死亡风险发生的预测。
<4>一种肝疾病的检查方法，所述肝疾病是包括肝硬化在内的慢性肝疾病，所述检查方法包括对从受试者采集的血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序。
<5>如<4>所述的方法，所述肝疾病是包括肝硬化在内的慢性肝疾病和肝细胞癌的并发疾病。
<6>一种与血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质的量相关的肝疾病的检查方法，所述检查方法包括对从受试者采集的血液中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行定量的工序，
所述进行定量的工序是对所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序；或者
所述定量是在进行促进抗原抗体反应的处理并且所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下进行的定量。
<7>如<6>所述的检查方法，所述检查方法包括确定所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的定量值相对于血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质的定量值的比例作为氧化率的工序，
所述测定灵敏度高的条件是所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度相对于所述未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度为1.4倍以上的条件。
<8>如<6>所述的检查方法，所述条件是通过用离液试剂或有机胺化合物进行处理而形成的条件。
<9>如<6>～<8>中任一项所述的检查方法，所述检查方法还包括以下工序：与所述进行促进抗原抗体反应的处理并且经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件相比，在经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质和未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度差小的条件下对所述肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量。
<10>如<9>所述的检查方法，所述测定灵敏度差小的条件是通过用表面活性剂对所述血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行变性处理而形成的条件。
<11>如<9>或<10>所述的检查方法，所述检查方法还包括以下工序：基于在所述测定灵敏度差小的条件下的所述肝型脂肪酸结合蛋白质的测定值以及在所述进行促进抗原抗体反应的处理并且经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下的测定值，计算出与血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的比例大致对应的氧化率。
<12>如<1>、<2>、<3>或<6>所述的检查方法，所述肝疾病是选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病。
<13>如<4>～<6>中任一项所述的方法，所述检查包括肝疾病引起的死亡风险的预测。
<14>如<13>所述的方法，所述预测是包括天数在内的死亡风险发生的预测。
<15>一种肝疾病的检查方法，所述检查方法包括选自于由以下(1)和(2)组成的组中的至少一个工序并且基于受试者中肝型脂肪酸结合蛋白质的量或者经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值：
(1)将肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知正常范围，或选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病中肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知范围，或具有肝疾病引起的死亡风险的肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知范围与受试者中肝型脂肪酸结合蛋白质的量进行比较，决定受试者中的所述量是否属于所述范围中的任一个的工序；
(2)将经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值的已知正常范围，或选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值的已知范围，或具有肝疾病引起的死亡风险的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知范围与受试者中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行比较，决定受试者中的所述量或与其相关的参数的值是否属于所述范围中的任一个的工序。
<16>如<15>所述的方法，所述方法基于仅肝型脂肪酸结合蛋白质的定量结果。
<17>如<15>或<16>所述的方法，所述方法不包括脑病水平和腹水水平的评价。
<18>用于如<1>～<17>中任一项所述的方法的肝疾病检查试剂盒，所述肝疾病检查试剂盒包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质。
<19>如<18>所述的肝疾病检查试剂盒，所述肝疾病检查试剂盒对选自于由肝疾病的种类、发展阶段和严重程度组成的组中的至少一种进行检查。
<20>如<18>所述的肝疾病检查试剂盒，所述肝疾病检查试剂盒还包含变性处理剂。
<21>如<20>所述的肝疾病检查试剂盒，能够对所述肝型脂肪酸结合蛋白质或所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质是抗L-FABP抗体，所述变性处理剂是表面活性剂或十二烷基硫酸钠。
<22>采用如<1>～<17>中任一项所述的方法的肝疾病伴随诊断药，所述肝疾病伴随诊断药包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质。
<23>在如<1>～<17>中任一项所述的方法中作为定量对象使用的肝疾病标志物，所述肝疾病标志物由肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质构成。
<24>如<1>～<17>中任一项所述的方法，所述方法包括从受试者采集血液的工序以及对血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行检测的工序，并且包括选自于由以下(A)和(B1)～(B4)组成的组中的至少一个工序：
(A)将肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知正常范围，或选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病中肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知范围，或具有肝疾病引起的死亡风险的肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知范围与受试者中肝型脂肪酸结合蛋白质的量进行比较，决定受试者中的所述量是否属于所述范围中的任一个的工序；
(B1)将健康人的肝型脂肪酸结合蛋白质的量与受试者中肝型脂肪酸结合蛋白质的量进行比较，在检测出后者的所述量显著高于前者的所述量的情况下，决定选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病或具有肝疾病引起的死亡风险的工序；所述工序中，健康人的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量也可以是所述受试者以前健康时的量；
(B2)将慢性肝疾病患者的肝型脂肪酸结合蛋白质的量与受试者中L-FABP的量进行比较，在检测出后者的所述量显著高于前者的所述量的情况下，决定选自于由肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病或具有肝疾病引起的死亡风险的工序；所述工序中，慢性肝疾病患者的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量也可以是所述受试者以前患慢性肝疾病时的量；
(B3)将肝硬化患者的肝型脂肪酸结合蛋白质的量与受试者中肝型脂肪酸结合蛋白质的量进行比较，在检测出后者的所述量显著高于前者的所述量的情况下，决定肝细胞癌或具有肝疾病引起的死亡风险的工序；所述工序中，肝硬化患者的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量也可以是所述受试者以前患肝硬化时的量；
(B4)将肝细胞癌患者的肝型脂肪酸结合蛋白质的量与受试者中L-FABP的量进行比较，在检测出后者的所述量显著高于前者的所述量的情况下，决定肝细胞癌中死亡风险高的工序；所述工序中，肝细胞癌患者的肝型脂肪酸结合蛋白质的所述量也可以是所述受试者以前患肝细胞癌时的量。
<25>如<1>～<17>中任一项所述的方法，所述方法包括肝疾病的诊断方法。
<26>一种肝疾病的治疗或预防方法，所述方法包括如上述<1>～<17>中任一项所述的方法以及将针对通过该方法决定的肝疾病的治疗药或预防药给予受试者的工序。
<27>如<26>所述的方法，所述肝疾病的治疗药或预防药包括选自于由慢性肝疾病治疗药或预防药、肝硬化治疗药或预防药以及肝细胞癌治疗药或预防药组成的组中的至少一种药。
<28>如<6>～<14>中任一项所述的方法，在所述“经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件”中，“所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为被2,2'-偶氮二2-脒基丙烷氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质，且所述未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为未被2,2'-偶氮二2-脒基丙烷氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质”；“所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为被任意的氧化剂或空气氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质，且所述未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为未被任意的氧化剂或空气氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质”；或者“所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为被任意氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质，且所述未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质为未被任意氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质”。
有益效果
根据本发明，基于单个蛋白质L-FABP的测定值即能对从肝疾病早期患者(例如Child-Pugh分类中的阶段A的患者)至晚期肝硬化患者(或者患有肝细胞癌的慢性肝疾病患者)进行一致评价。此外，根据本发明，可以在不包括Child-Pugh分类中的脑病、腹水等的水平这样的主观因素的情况下进行检查。
此外，由于血液中L-FABP不会像血清白蛋白那样在晚期肝硬化患者中合成能力降低，因此根据本发明，即使与Child-Pugh分类等中也使用的作为肝疾病检查中的金标准的血清白蛋白相比检查能力也高。
附图说明
[图1]是示出参考例1的结果的图。
[图2]是示出实施例1的结果的图。
[图3]是示出实施例2的结果的图。
[图4]是示出血液中L-FABP浓度与PIVKA-II、AFP和AFP-L3级分之间的相关性分析结果的图。
[图5]是示出关于血液中L-FABP总浓度、氧化率、氧化型L-FABP的血中浓度和血清白蛋白浓度中每一个的ROC分析结果的图。
[图6]是示出氧化率、血液中L-FABP总浓度、氧化型L-FABP的血中浓度和血清白蛋白浓度各自的基准值下的生存曲线的图。
[图7]是示出关于GU处理后L-FABP的测定值的ROC分析结果和生存曲线的图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行详细描述，但是本发明不限于以下实施方式，并且可以在本发明的目的范围内添加适当修改来实施。
(L-FABP)
已经报道了L-FABP的氨基酸序列和基因序列(Veerkamp和Maatman，Prog.LipidRes.，34：17-52，1995)。序列号1表示野生型人L-FABP的氨基酸序列。
即使是因序列表的序列号1中记载的野生型人肝型脂肪酸结合蛋白质的氨基酸序列上的置换、插入、缺失等而产生的突变蛋白质，如果该突变在野生型人肝型脂肪酸结合蛋白质的三维结构中是保守性高的突变，则它们全都可以属于肝型脂肪酸结合蛋白质的范围内。
作为蛋白质结构要素的氨基酸的侧链在疏水性、电荷、大小等方面各自不同。在实质上不影响整个蛋白质的三维结构(也称为立体结构)这样的意义上，通过经验或物理化学实测而已知保守性高的几种关系。例如，关于氨基酸残基的置换，举出甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)、Gly和丙氨酸(Ala)或缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)、谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)和苏氨酸(Thr)、Thr和丝氨酸(Ser)或Ala、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等。
关于所述L-FABP的获得方法不受到特别限制，既可以是通过化学合成来合成的蛋白质，也可以是利用基因重组技术制作的重组蛋白质。
《肝疾病的检查方法》
本发明的第一方面是一种检查方法，所述检查方法是包括对从受试者(例如患者)采集的血液中的L-FABP进行定量的工序的肝疾病的检查方法，所述检查方法根据所述定量的结果对选自于由肝疾病的种类、发展阶段和严重程度组成的组中的至少一种进行判定。
在第一方面所述的肝疾病的检查方法中，作为所述肝疾病的种类，举出选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病，优选为选自于由肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病，较优选为肝细胞癌。
在本说明书和权利要求的范围中，作为慢性肝疾病，举出病毒性肝疾病(例如B型肝炎、C型肝炎)、酒精性肝疾病、脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性胆汁性胆管炎、药物性肝损伤、自身免疫性肝炎等。
作为所述肝疾病的发展阶段，举出早期、中期、晚期等。
作为所述肝疾病的严重程度，举出轻度、中度、重度等。
所述判定优选包括肝疾病引起的死亡风险的预测。
如后述实施例所示，得出如下内容：血液中L-FABP浓度与肝疾病标志物相关联，随着Child-Pugh分类以及BCLC疾病分期中的重症度上升而达到高值。此外得出如下内容：与血清白蛋白相比显示出更高的预后预测能力，肝细胞癌患者的血液中L-FABP浓度成为显著高值，同时与作为肝细胞癌肿瘤标志物的PIVKA-II、AFP、AFP-L3级分等相关联。
作为能够预测所述死亡风险的天数水平，只要能够预测肝疾病引起的死亡风险则不受到特别限制，可以是也可以不是从所述定量到规定天数以上之前的死亡风险的预测，但例如从能够预测从所述定量到100天以上之前的死亡风险、能够预测更远的将来的观点出发，优选能够预测从所述定量到500天以上之前(较优选1100天以上之前，进一步优选1500天以上之前，特别优选2000天以上之前，极为优选2500天以上之前，最优选3000天以上之前)的死亡风险这一方面。
作为所述预测水平的上限不受到特别限制，例如为6000天以下、5000天以下、4000天以下。
此外，所述预测优选为预后的预测。
本发明的第二方面是一种检查方法，所述检查方法是包括对从受试者采集的血液中的L-FABP进行定量的工序的肝疾病的检查方法，
所述肝疾病是选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病。从严重程度的观点来看，所述肝疾病优选是选自于由肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病。
第一方面和第二方面所述的肝疾病的检查方法可以包括也可以不包括从受试者采集血液的工序。第一方面和第二方面所述的肝疾病的检查方法可以包括也可以不包括对血液中的L-FABP进行检测的工序。
此外，第一方面和第二方面所述的肝疾病的检查方法可以包括也可以不包括选自于由以下(A)和(B1)～(B4)组成的组中的至少一个工序：
(A)将L-FABP的量的已知正常范围，或选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病中L-FABP的量的已知范围，或具有肝疾病引起的死亡风险的L-FABP的量的已知范围与受试者中L-FABP的量进行比较，决定受试者中的所述量是否属于所述范围中的任一个的工序；
(B1)将健康人的L-FABP的量与受试者中L-FABP的量进行比较，在检测出后者的所述量显著高于前者的所述量的情况下，决定选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病或具有肝疾病引起的死亡风险的工序；所述工序中，健康人的L-FABP的所述量也可以是所述受试者以前健康时的量；
(B2)将慢性肝疾病患者的L-FABP的量与受试者中L-FABP的量进行比较，在检测出后者的所述量显著高于前者的所述量的情况下，决定选自于由肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病或具有肝疾病引起的死亡风险的工序；所述工序中，慢性肝疾病患者的L-FABP的所述量也可以是所述受试者以前患慢性肝疾病时的量；
(B3)将肝硬化患者的L-FABP的量与受试者中L-FABP的量进行比较，在检测出后者的所述量显著高于前者的所述量的情况下，决定肝细胞癌或具有肝疾病引起的死亡风险的工序；所述工序中，肝硬化患者的L-FABP的所述量也可以是所述受试者以前患肝硬化时的量；
(B4)将肝细胞癌患者的L-FABP的量与受试者中L-FABP的量进行比较，在检测出后者的所述量显著高于前者的所述量的情况下，决定肝细胞癌中死亡风险高的工序；所述工序中，肝细胞癌患者的L-FABP的所述量也可以是所述受试者以前患肝细胞癌时的量。
在第一方面和第二方面所述的肝疾病的检查方法中，作为L-FABP的检测或定量等的测定方法，举出采用酶免疫测定法(EIA，ELISA)、荧光酶免疫测定法(FLEIA)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、荧光抗体法(FA)、放射免疫测定法(RIA)、蛋白质印迹法(WB)、免疫印迹法等的测定法。作为L-FABP的检测或定量等的测定方法，优选为使用抗L-FABP抗体的测定。
作为使用的抗L-FABP抗体，只要能识别L-FABP就不受到特别限制，既可以是已知的抗体，也可以是今后开发的抗体。例如，举出识别通过下述变性处理而暴露在外部的位点的抗体。
在通过抗L-FABP抗体进行定量的情况下，优选在通过用表面活性剂对所述血液中的L-FABP进行变性处理而形成的条件下进行定量。由此，可以在维持L-FABP的一级结构的状态下通过切断氢键、二硫键等而使其立体结构变性，即使在抗体与L-FABP分子的内部区域结合的情况下也不会受到L-FABP的氧化状态的影响，可以高灵敏度且特异性地对L-FABP进行检测或定量。
作为所述表面活性剂，优选十二烷基硫酸钠(SDS)。
作为所述变性处理，举出在室温(例如25℃)或加温条件下(例如37℃)用适当浓度(例如0.2质量/体积％(w/v％)～10质量/体积％，优选0.4质量/体积％(w/v％)以上、0.5质量/体积％(w/v％)以上或0.7质量/体积％(w/v％)以上)的表面活性剂处理适当时间(例如5分钟～60分钟)的方法。
典型地，举出用1w/v％SDS在25℃下变性处理10分钟。
作为所述测定方法，更详细地说，优选是将对抗原(L-FABP)的识别位点不同的两种抗体组合使用的夹心ELISA法。
作为识别位点不同的两种抗体，优选将一种用作结合在微孔板的孔表面上的固相化抗体，而将另一种用作用于检测或定量的标记抗体。作为所述标记抗体中的标记不受到特别限制，例如举出过氧化物酶标记等酶标记、荧光标记、紫外线标记、放射标记等。
作为对抗原(L-FABP)的识别位点不同的抗体，举出包含选自于由抗L-FABP抗体克隆1、克隆2、克隆L和克隆F组成的组中的抗体在内的抗体(例如专利文献1～专利文献3)，优选包含抗L-FABP抗体克隆L的组合或包含抗L-FABP抗体克隆2的组合，较优选包含抗L-FABP抗体克隆L的组合，进一步优选将抗L-FABP抗体克隆L用作固相化抗体并将任意的抗L-FABP抗体用作标记抗体，特别优选将抗L-FABP抗体克隆L用作固相化抗体并将抗L-FABP抗体克隆2用作标记抗体。
作为利用夹心ELISA法的L-FABP测定试剂盒的市售品，举出“レナプロL-FABPテストTMB”(シミックホールディングス公司制造)、“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス公司制造)等。
在第一方面和第二方面所述的肝疾病的检查方法中，所述血液中的L-FABP可为经氧化的L-FABP(以下也简称为“氧化型L-FABP”)，也可为未经氧化的L-FABP(以下也简称为“非氧化型L-FABP”)，还可为氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的混合物，但是优选为氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的混合物或氧化型L-FABP。
对于L-FABP，可以将序列号1中第19个、第74个和第113个蛋氨酸氧化；所述氧化型L-FABP可以是第19个、第74个和第113个蛋氨酸中的至少任一个被氧化的L-FABP。特别是，关于使用抗L-FABP抗体的测定值的变化，由于认为第19个和第113个蛋氨酸的氧化占主导地位，因此优选第19个和第113个蛋氨酸中的至少任一个被氧化的L-FABP。
作为氧化型L-FABP的检测或定量等的测定方法，举出与作为“L-FABP的检测或定量等的测定方法”在上文描述的具体例和优选例相同的实例。在使用抗L-FABP抗体进行测定的情况下，使用的抗L-FABP抗体也相同，但进一步优选识别通过所述蛋氨酸的氧化而暴露在外部的位点的抗体。
本发明的第三方面是一种肝疾病的检查方法，所述检查方法包括对从受试者采集的血液中的氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值进行定量的工序。
所述进行定量的工序优选为在促进抗原抗体反应的处理后对氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值进行定量的工序。
作为与氧化型L-FABP的量相关的参数，举出由测定值(例如标记强度)换算而计算出的参数，而不是氧化型L-FABP的量本身的参数。作为所述参数，具体而言，举出后述的氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下的测定值、后述的“血液中的L-FABP的氧化率”等。
在第三方面所述的肝疾病的检查方法中，优选所述进行定量的工序是对所述氧化型L-FABP的量进行定量的工序。
在第二方面和第三方面所述的肝疾病的检查方法中，所述肝疾病的检查举出选自于由以下检查组成的组中的至少一种检查：选自于由肝疾病的种类、发展阶段和严重程度组成的组中的至少一种的判定；肝疾病引起的死亡风险的预测；肝疾病发展风险(進行リスク)的预测；以及肝疾病发展的监测。较优选所述肝疾病的检查为选自于由以下检查组成的组中的至少一种检查：选自于由肝疾病的种类、发展阶段和严重程度组成的组中的至少一种的判定；肝疾病引起的死亡风险的预后预测；肝疾病发展风险的预后预测；以及基于肝疾病发展的监测的预后预测。
此外，所述肝疾病的检查当然可以作为疾病发展状况的判断、治疗方针的参考，但也可以用于肝疾病引起的死亡风险的预测，较优选用于肝疾病引起的死亡风险的预后的预测。
在第三方面所述的肝疾病的检查方法中，所述肝疾病优选为选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病，较优选为选自于由肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病，进一步优选为肝细胞癌。
在第三方面所述的肝疾病的检查方法中，优选所述定量是在进行促进抗原抗体反应的处理并且氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下进行的定量。
所述“氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件”可以满足选自于由以下条件组成的组中的任一种或至少一种：“所述氧化型L-FABP为被AAPH氧化的L-FABP，且所述非氧化型L-FABP为未被AAPH氧化的L-FABP”；“所述氧化型L-FABP为被任意的氧化剂或空气氧化的L-FABP，且所述非氧化型L-FABP为未被任意的氧化剂或空气氧化的L-FABP”；以及“所述氧化型L-FABP为被任意氧化的L-FABP，且所述非氧化型L-FABP为未被任意氧化的L-FABP”，或者也可以满足其它条件。
作为所述条件下的定量，具体而言，例如较优选为以下条件下的定量：在使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス株式会社制造)的抗体分别对用50mM AAPH在37℃下处理60分钟的氧化型重组L-FABP和未处理的非氧化型重组L-FABP进行ELISA测定，测定标记抗体的显色强度(OD450nm)的情况下，在浓度25ng/ml下，氧化型L-FABP的测定灵敏度相对于非氧化型L-FABP的测定灵敏度为1.4倍以上(优选1.5倍以上，较优选1.8倍以上，进一步优选2.0倍以上)高的条件下的定量。
作为测定灵敏度的倍率的上限值不受到特别限制，例如举出6倍以下或4倍以下。
这里所说的“未处理的非氧化型重组L-FABP”是指在用1000mM苯甲脒盐酸盐或1500mM氯化胍中的至少一种在25℃下处理10分钟后，在使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”的抗体进行ELISA测定，测定标记抗体的显色强度(OD450nm)的情况下，在浓度25ng/ml下，相对于用50mM AAPH在37℃下处理60分钟的氧化型L-FABP，显色强度为0.7倍以下的L-FABP。
例如，在使用抗L-FABP抗体进行定量等情况下，在所述进行促进抗原抗体反应的处理并且氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下，L-FABP的物理化学特性轻度改变而促进L-FABP与抗体的反应，但并未变性到破坏L-FABP的立体结构的程度。由此，能够在维持或增强氧化型L-FABP的测定灵敏度高于非氧化型L-FABP的测定灵敏度的特性的同时提高绝对测定灵敏度。
这样的条件可以通过将各种蛋白质变性剂与适当的使用条件组合使用而形成，从提高使用条件的自由度的观点来看，优选使用蛋白质变性作用温和的物质。然而，即使使用蛋白质变性作用强的物质(例如十二烷基硫酸钠(SDS))，使用条件的自由度相应降低(增加了低浓度、低温、短时间等制约因素)，但也能够形成上述条件。
从该观点来看，优选所谓的免疫凝集促进剂，具体而言，较优选离液试剂或有机胺化合物。
如参考例1中在后文描述的，就在适当条件下使用免疫凝集促进剂处理后的测定灵敏度而言，对于氧化型L-FABP绝对地显著提高，同时与非氧化型L-FABP相比相对较高。
因此，可以由用免疫凝集促进剂处理后的使用抗L-FABP抗体的测定值和未进行上述处理的使用抗L-FABP抗体的测定值(优选为在后述的氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下的测定值)之间的比较，对血液中的氧化型L-FABP进行定量。
作为免疫凝集促进剂，举出离液试剂、有机胺化合物、还原剂(谷胱甘肽、半胱氨酸、青霉胺等)、表面活性剂(正十二烷基苯磺酸钠等)或具有相同效果的物质等，优选离液试剂或有机胺化合物。
在第一方面所述的肝疾病的检查方法中，所述定量较优选是利用离液试剂或有机胺化合物进行处理后的L-FABP的定量。
测定中使用的抗L-FABP抗体与上文所述的相同，但进一步优选识别通过所述蛋氨酸的氧化而暴露在外部的位点的抗体。
作为所述离液试剂或有机胺化合物的具体例，优选使用选自于尿素、2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐、苯甲脒盐酸盐、苄胺盐酸盐、胍盐酸盐、氨基比林、安替比林、4-氨基安替比林、邻苯二胺二盐酸盐、对茴香胺盐酸盐、苯海拉明盐酸盐、2,4-二氨基茴香醚二盐酸盐、吡啶盐酸盐、盐酸1,4-苯二胺、氨基胍盐酸盐、甜菜碱盐酸盐中的至少一种。这些当中，进一步优选苯甲脒盐酸盐、苄胺盐酸盐、2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐。
此外，还可以优选使用下述式(A)表示的化合物或其盐或酯，下述式(B)表示的化合物或其盐。
[化1]
Figure BDA0002996767820000181
(式(A)中，Xa1为氢原子、羟基或烷基，Xa2～Xa6各自独立地表示氢原子、卤素原子、烷基、羟基、羧基、氨基或-SXa7(Xa7表示氢原子、羟基或烷基；当存在多个Xa7时，各自可以为相同或不同的基团)。)
作为所述烷基，举出直链状或支链状烷基，优选碳原子数1～3的烷基。
[化2]
Figure BDA0002996767820000182
(式(B)中，Xb1～Xb4各自独立地为氢原子、卤素原子、烷基、氨基、任选被卤素原子取代的苯基或-SXb6(Xb6表示氢原子、羟基或烷基；当存在多个Xb6时，各自可以为相同或不同的基团)；其中，当存在Xb1和Xb2两者时，可各自一起形成羰基，当存在Xb3和Xb4两者时，可各自一起形成羰基，Xb5为氢原子、卤素原子或烷基，
Eb1为氮原子或硫原子，
Eb2和Eb3各自独立地为碳原子或氮原子，
q、r、s、t和u各自独立地为0或1，
Eb1和Eb3之间的双点划线以及Eb2和Eb3之间的双点划线各自独立地为单键或双键，上述q、r、s、t和u的值与Eb1和Eb3之间的双点划线以及Eb2和Eb3之间的双点划线的键表示根据Eb1～Eb3的原子价而适当确定的值和键。)
作为所述烷基，举出直链状或支链状烷基，优选碳原子数1～3的烷基。
另外，作为各有机胺化合物的盐，硫酸盐、硝酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、氟硼酸盐、草酸盐、乳酸盐、己二酸盐、酒石酸盐、氢碘酸盐、甲苯磺酸盐、丙二酸盐、碳酸氢盐等不受到特别限制，除了本发明的效果以外，还可以考虑作为试剂的处理容易度、获得容易度等而适当选择。
作为利用所述离液试剂、有机胺化合物等免疫凝集促进剂进行的处理，举出在室温(例如25℃)或加温条件下(例如37℃)用适当浓度(例如10mM～3000mM)的免疫凝集促进剂处理适当时间(例如5分钟～60分钟)的方法。作为所述处理，优选在室温(例如25℃)下用任意浓度的免疫凝集促进剂进行处理的方法。作为所述处理，典型地，举出用1000mM苯甲脒盐酸盐或1500mM氯化胍在25℃下处理10分钟。
所述离液试剂、有机胺化合物等免疫凝集促进剂可以单独使用一种，也可以将多种混合使用。
作为利用SDS等表面活性剂进行的处理，举出在低温(例如25℃以下)下用适当低浓度(例如小于0.12质量/体积％)的表面活性剂处理适当的短时间(例如小于4分钟)的方法。
第三方面所述的肝疾病的检查方法优选还包括以下工序：与所述氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件相比，在氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下对所述L-FABP进行定量。
作为氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件，例如举出在使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス株式会社制造)的抗体对用50mM AAPH在37℃下处理60分钟的氧化型重组L-FABP和未处理的非氧化型重组L-FABP进行ELISA测定，测定标记抗体的显色强度(OD450nm)的情况下，在浓度25ng/ml下，氧化型L-FABP的测定灵敏度相对于非氧化型L-FABP的测定灵敏度为0.8倍以上且小于1.4倍(优选0.9倍以上且1.25倍以下)的条件。
关于在此所说的“未处理的非氧化型重组L-FABP”，如上所述。
这样的测定灵敏度差小的条件可以通过将各种蛋白质变性剂与适当的使用条件组合使用而形成，从提高使用条件的自由度的观点来看，优选使用蛋白质变性作用强的物质。然而，即使使用蛋白质变性作用温和的物质(例如所述免疫凝集促进剂)，使用条件的自由度相应降低(增加了高浓度、高温、长时间等制约因素)，但也能够形成上述条件。
从该观点来看，优选表面活性剂，具体而言，优选十二烷基硫酸钠(SDS)。
作为所述变性处理，举出在室温(例如25℃)或加温条件下(例如37℃)用适当浓度(例如0.2质量/体积％(w/v％)～10质量/体积％，优选0.4质量/体积％(w/v％)以上、0.5质量/体积％(w/v％)以上或0.7质量/体积％(w/v％)以上)的表面活性剂处理适当时间(例如5分钟～60分钟)的方法。
作为所述变性处理，典型地，举出用1w/v％SDS在25℃下变性处理10分钟。
作为利用免疫凝集促进剂进行的处理，举出在加温条件下(例如37℃以上)用适当高浓度(例如3500mM)的免疫凝集促进剂处理适当的长时间(例如80分钟)的方法。
在本说明书和权利要求的范围中，可以将血液中的氧化型L-FABP相对于血液中L-FABP的总浓度(氧化型L-FABP与非氧化型L-FABP的总和)的比例定义为“血液中的L-FABP的氧化率”。
从实施例部分中在后文描述的检查能力的观点来看，第三方面所述的肝疾病的检查方法优选还包括以下工序：基于在所述测定灵敏度差小的条件下的所述L-FABP的测定值以及在所述氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下的测定值，计算出与血液中的L-FABP中的氧化型L-FABP的比例大致对应的氧化率。
“血液中的L-FABP的氧化率”可以大致对应于在所述氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下的测定值相对于在所述氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下的L-FABP的测定值(例如标记强度)的比例(例如下式所示的吸光度比(OD比))。
所述氧化型L-FABP的测定灵敏度比非氧化型L-FABP的测定灵敏度高的条件下的OD值/所述氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下的L-FABP的OD值
此外，“血液中的L-FABP的氧化率”例如也可以由下式表示。
(aX+bY)(OD值)/血液中L-FABP的总浓度(OD值)
(上述式中，a、b表示系数，X表示氧化型L-FABP的浓度，Y表示非氧化型L-FABP的浓度。)
系数a优选为表示抗体对氧化型L-FABP的反应性的系数，系数b优选为表示抗体对非氧化型L-FABP的反应性的系数。
如上所述，第三方面所述的肝疾病的检查方法包括对受试者的血液中的氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值进行定量的工序，所述进行定量的工序优选为对所述氧化型L-FABP进行定量的工序。
这是因为，如实施例部分中在后文描述的，“氧化型L-FABP的量”这方面能够比“血液中的L-FABP的氧化率”和“血液中L-FABP的总浓度”各自单独的定量结果更高精度地进行检查。
所述氧化型L-FABP的浓度可以由所述氧化率与在所述氧化型L-FABP和非氧化型L-FABP的测定灵敏度差小的条件下的L-FABP的测定值(血液中L-FABP的总浓度)的乘积来定量。
此外，也可以使用虽然不识别非氧化型L-FABP、但能够特异性识别氧化型L-FABP的抗氧化型L-FABP抗体来对所述氧化型L-FABP进行定量。
在第一方面～第三方面所述的肝疾病的检查方法中，所述定量可以或也可以不根据所测定的标记的强度(例如吸光度、酶标记强度、荧光强度、紫外线强度、放射强度等)与L-FABP的量(例如浓度)之间的关系制作校准曲线，并基于所述校准曲线(例如进行比较)进行定量。
本发明的第四方面是一种肝疾病的检查方法，所述检查方法包括选自于由以下(1)和(2)组成的组中的至少一个工序并且基于受试者中L-FABP的量或者氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值：
(1)将L-FABP的量的已知正常范围，或选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病中L-FABP的量的已知范围，或具有肝疾病引起的死亡风险的L-FABP量的已知范围与受试者中L-FABP的量进行比较，决定受试者中的所述量是否属于所述范围中的任一个的工序；
(2)将氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值的已知正常范围，或选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病中氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值的已知范围，或具有肝疾病引起的死亡风险的氧化型L-FABP的量的已知范围与受试者中氧化型L-FABP的量或与其相关的参数的值进行比较，决定受试者中的所述量或与其相关的参数的值是否属于所述范围中的任一个的工序。
第一方面～第四方面所述的肝疾病的检查方法中，作为ROC(受试者工作特征)分析结果，优选可以在曲线下面积(AUC)为0.650以上的情况下进行检查，较优选可以在0.700以上的情况下进行检查，进一步优选可以在0.710以上的情况下进行检查。
第一方面～第四方面所述的肝疾病的检查方法可以基于仅L-FABP的定量结果，但也可以与其它检查方法(例如基于Child-Pugh分类、BCLC疾病分期、MELD(终末期肝病模型(Model for End-Stage Liver Disease))等的检查方法)组合使用或不组合使用。
此外，第一方面～第四方面所述的肝疾病的检查方法能够对从肝疾病早期患者(例如Child-Pugh分类中的阶段A的患者)至晚期肝硬化患者(或者患有肝细胞癌的慢性肝疾病患者)进行一致评价，但也可以不对从肝疾病早期患者至晚期肝硬化患者进行一致评价。
第一方面～第四方面所述的肝疾病的检查方法不包括Child-Pugh分类中的脑病水平和腹水水平的评价，可以在不包括主观因素的情况下进行检查。
第一方面～第四方面所述的肝疾病的检查方法可以包括也可以不包括肝疾病的诊断方法。
此外，本发明可以涉及肝疾病的治疗或预防方法，所述肝疾病的治疗或预防方法包括第一方面～第四方面所述的肝疾病的检查方法以及将针对通过该方法决定的肝疾病的治疗药或预防药给予受试者的工序，也可以不涉及上述方法。
作为所述肝疾病的治疗药或预防药，举出选自于由慢性肝疾病治疗药或预防药、肝硬化治疗药或预防药以及肝细胞癌治疗药或预防药组成的组中的至少一种药。
《检查试剂盒、伴随诊断药》
本发明的第五方面是包含能够对L-FABP或氧化型L-FABP进行定量的物质的肝疾病检查试剂盒，优选为用于第一方面～第三方面所述的肝疾病的检查方法的检查试剂盒。
本发明的第六方面是包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质的量或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质的肝疾病伴随诊断药，优选为使用第一方面～第三方面所述的肝疾病的检查方法的伴随诊断药。
本发明的第七方面是在第一方面～第三方面所述的方法中作为定量对象使用的肝疾病标志物，所述肝疾病标志物由肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质构成。
在本说明书和权利要求的范围中，“伴随诊断药”是指在实际开始给药之前进行的检查中使用的诊断药，用于预测对于个体肝疾病患者的医药品的效果、副作用的风险、适当的给药量。
在第五方面所述的肝疾病检查试剂盒中，所述肝疾病的检查举出选自于由以下检查组成的组中的至少一种检查：选自于由肝疾病的种类、发展阶段和严重程度组成的组中的至少一种的判定；肝疾病引起的死亡风险的预测；肝疾病发展风险的预测；以及肝疾病发展的监测，较优选为选自于由以下检查组成的组中的至少一种检查：选自于由肝疾病的种类、发展阶段和严重程度组成的组中的至少一种的判定；肝疾病引起的死亡风险的预后预测；肝疾病发展风险的预后预测；以及基于肝疾病发展的监测的预后预测。
在第六方面所述的伴随诊断药中，优选为选自于由肝疾病的种类、发展阶段和严重程度组成的组中的至少一种的判定；肝疾病引起的死亡风险的预测；肝疾病发展风险的预测；以及肝疾病发展的监测组成的组中的至少一种的伴随诊断药，较优选为选自于由肝疾病的种类、发展阶段和严重程度组成的组中的至少一种的判定；肝疾病引起的死亡风险的预后预测；肝疾病发展风险及其预后预测；以及基于肝疾病发展的监测的预后预测组成的组中的至少一种的伴随诊断药。
此外，对于所述肝疾病的伴随诊断药，优选肝疾病引起的死亡风险的预测，较优选肝疾病引起的死亡风险的预后预测。
在第六方面所述的伴随诊断药中，作为肝疾病的种类，优选为选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病，较优选为选自于由肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病，进一步优选为肝细胞癌。
在第五方面所述的检查试剂盒和第六方面所述的伴随诊断药中，作为能够对L-FABP或氧化型L-FABP进行定量的物质，举出基于酶免疫测定法(EIA，ELISA)、荧光酶免疫测定法(FLEIA)、化学发光酶免疫测定法(CLEIA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、荧光抗体法(FA)、放射免疫测定法(RIA)、蛋白质印迹法(WB)、免疫印迹法等对L-FABP或氧化型L-FABP进行定量的物质；具体而言，优选抗L-FABP抗体。
作为使用的抗L-FABP抗体，只要能识别L-FABP就不受到特别限制，既可以是已知的抗体，也可以是今后开发的抗体。例如，举出识别通过所述变性处理、所述蛋氨酸的氧化等而暴露在外部的位点的抗体。
作为所述定量手段，更详细地说，优选为采用将对抗原(L-FABP)的识别位点不同的两种抗体组合使用的夹心ELISA法的测定系统。
关于识别位点不同的两种抗体，如《肝疾病的检查方法》中在上文所述。
作为所述定量手段，作为试剂优选含有所述抗L-FABP抗体，较优选还含有标记的抗L-FABP抗体；根据需要还可以含有抗吸附剂(牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、脱脂乳、聚乙二醇等)、预处理液(任意的表面活性剂、任意的缓冲液等)、反应缓冲液(任意的缓冲液等)、显色底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺、过氧化氢水溶液(過酸化水素水)等)等。
只要不损害本发明的效果，作为所述定量手段中的抗吸附剂的含量就不受到特别限制，优选为0.05质量％～10质量％。
作为所述定量手段，优选为使用将对抗原的识别位点不同的两种抗体组合使用的夹心ELISA法的试剂盒；较优选为将抗L-FABP抗体克隆L用作固相抗体并将抗L-FABP抗体克隆2用作标记抗体的试剂盒。
对于第五方面所述的检查试剂盒和第六方面所述的伴随诊断药，当使用抗L-FABP抗体进行定量时，优选具备在定量之前通过表面活性剂对L-FABP进行变性的手段。
第五方面所述的肝疾病检查用试剂盒较优选还具备：通过表面活性剂对所述血液中的L-FABP进行变性处理的手段；以及
对上述变性处理后的L-FABP进行定量的手段。
作为所述表面活性剂，如上所述。
作为所述变性手段，举出在室温(例如25℃)或加温条件下(例如37℃)用任意浓度(例如0.2质量/体积％～10质量/体积％)的表面活性剂进行处理的手段(例如包含所述表面活性剂、任意的缓冲液等的变性处理液)。
第五方面所述的检查试剂盒和第六方面所述的伴随诊断药优选还具备通过免疫凝集促进剂(优选离液试剂或有机胺化合物)对血液中的L-FABP进行处理的手段，并且所述进行定量的手段优选为对上述处理后的L-FABP进行定量的手段。
对于第五方面所述的检查试剂盒和第六方面所述的伴随诊断药，作为它们是使用夹心ELISA法的试剂盒时的具体方式，例如举出包含以下(1)～(10)的试剂盒：
(1)L-FABP抗体固相化微孔板……抗人L-FABP小鼠单克隆抗体结合孔(例如来自克隆L产生细胞株)
(2)变性处理液(例如任意的表面活性剂)
(3)免疫凝集促进剂处理液(例如离液试剂、有机胺化合物)
(4)反应缓冲液
(5)酶标记抗体……过氧化物酶标记抗人L-FABP小鼠单克隆抗体(例如来自克隆2产生细胞株)
(6)酶底物液
(7)洗涤剂(任意的缓冲液、表面活性剂等)
(8)反应停止液(1N硫酸等)
(9)标准缓冲液(任意的缓冲液等)
(10)肝型脂肪酸结合蛋白质标准品
作为(10)肝型脂肪酸结合蛋白质标准品的浓度不受到特别限制，例如举出10ng/mL～10000ng/mL，优选50ng/mL～5000ng/mL，较优选100ng/mL～1000ng/mL，进一步优选200ng/mL～800ng/mL，特别优选300ng/mL～600ng/mL。
第五方面所述的检查试剂盒和第六方面所述的伴随诊断药优选出于防止蛋白吸附的目的而包含含有BSA的蛋白质保存缓冲液。例如，举出下述蛋白质保存缓冲液。
(蛋白质保存缓冲液)
10mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、150mM NaCl、1.0％BSA、0.1％NaN3实施例
以下示出本发明的实施例来更具体地说明本发明，但本发明并不限定于此，可以在不脱离本发明的技术构思的范围内进行各种应用。
<参考例1>
将用50mM AAPH在37℃下处理60分钟的各种浓度的氧化型重组L-FABP和未处理的各种浓度的非氧化型重组L-FABP分别用1w/v％SDS在25℃下变性处理10分钟后，使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス株式会社制造)的抗体实施ELISA测定，测定标记抗体的显色强度(OD450nm)。所述检查用试剂盒的使用方法按照通常所附的说明书根据测定方法来进行。
结果示于图1(a)中。
另一方面，除了用1000mM苯甲脒盐酸盐在25℃下处理10分钟(以下也称为“BA处理”)来代替用SDS进行的变性处理之外，以同样的方式实施ELISA测定。结果示于图1(b)中。
此外，除了用1500mM氯化胍在25℃下处理10分钟(以下也称为“GU处理”)来代替用SDS进行的变性处理之外，以同样的方式实施ELISA测定。结果示于图1(c)中。
由图1(a)所示的结果可以清楚地看出，在重组L-FABP的各浓度下，氧化型重组L-FABP的OD测定值(强度)与非氧化型重组L-FABP的OD测定值差不多是相同的。
另一方面，由图1(b)和图1(c)所示的结果可以清楚地看出，进行BA处理或GU处理来代替用SDS进行的变性处理时，在重组L-FABP的任意一个浓度下，氧化型重组L-FABP的OD测定灵敏度都比非氧化型重组L-FABP的OD测定灵敏度高。
认为该测定灵敏度的提高是由氧化型L-FABP发生了使得抗体识别的L-FABP内部区域暴露在外部的结构变化而引起的。
另一方面，在非氧化型重组L-FABP中，认为即使在测定中使用识别L-FABP内部区域的抗L-FABP抗体，由于没有发生所述使得抗体识别的L-FABP内部区域暴露在外部的结构变化，因此测定强度不会提高。
<实施例1>
使用慢性肝炎(CH)患者、肝硬化(LC)患者、Child-Pugh分类中的阶段A(以下也简称为“CP A”)的患者、阶段B(以下也简称为“CP B”)的患者及阶段C(以下也简称为“CP C”)的患者的各血液样本，用1w/v％SDS在25℃下变性处理10分钟后，使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス株式会社制造)的抗体测定血液中L-FABP浓度(ng/ml)。结果示于图2(a)和图2(b)中。分别地，图中**表示显著性水平p<0.01，***表示p<0.001。
由图2(a)所示的结果可以清楚地看出，LC患者的血液中L-FABP浓度显著高于CH患者。
此外，由图2(b)所示的结果可以清楚地看出，从Child-Pugh分类中的阶段A的患者开始，每进展至阶段B、阶段C这样的病情阶段，血液中L-FABP浓度都成为显著高值，通过测定血液中L-FABP浓度，可以对从慢性肝炎患者至晚期肝硬化患者进行检查。
此外，迄今为止还没有报道在世界范围内频繁使用的Child-Pugh分类的每个病情阶段的L-FABP值都会变高；此外，在由具有各种肝疾病背景而非HCV、NASH这样的有限的肝疾病的患者群构成的样本中，得到了L-FABP的高检查能力。
<实施例2>
使用患有肝细胞癌(HCC)的慢性肝疾病患者(HCC(+))和未患HCC的慢性肝疾病患者(HCC(-))的各血液样本，用1w/v％SDS在25℃下变性处理10分钟后，使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス株式会社制造)的抗体测定血液中L-FABP浓度(ng/ml)。结果示于图3(a)中。图中***表示p<0.001。
由图3(a)所示的结果可以清楚地看出，与未患HCC的慢性肝疾病患者相比，患有HCC的慢性肝疾病患者中血液中L-FABP浓度成为显著高值，通过测定血液中L-FABP浓度，还可以进一步在慢性肝疾病患者中检查有无HCC。
在慢性肝疾病中，对于病情进一步发展的肝硬化(LC)患者，使用患有肝细胞癌(HCC)的LC患者(HCC(+))和未患HCC的LC患者(HCC(-))的各血液样本，以同样的方式进行变性处理后，测定血液中L-FABP浓度(ng/ml)。结果示于图3(b)中。图中**表示p<0.01。
由图3(b)所示的结果可以清楚地看出，与未患HCC的LC患者相比，患有HCC的LC患者中血液中L-FABP浓度成为显著高值，通过测定血液中L-FABP浓度，还可以进一步在LC患者中检查有无HCC。
对于BCLC分类的阶段A～阶段D的患者，也以同样的方式在变性处理后测定血液中L-FABP浓度(ng/ml)。结果示于图3(d)中。
此外，由图3(d)所示的结果可以清楚地看出，与BCLC分类的阶段A的患者相比，确认在阶段B～阶段D的患者中具有成为高值的倾向。
(比较例1)
作为比较例1，使用患有HCC的LC患者(HCC(+))和未患HCC的LC患者(HCC(-))的各血液样本，测定血液中白蛋白(Alb)浓度(U/L)。结果示于图3(c)中。
由图3(c)所示的结果可以清楚地看出，在HCC(+)和HCC(-)之间血液中Alb浓度没有显著性差异。
可以看出，在慢性肝疾病中，在病情进一步发展的LC患者中，Alb合成能力降低，不能检查有无HCC。
进行了血液中L-FABP浓度与肝细胞癌的检查标志物PIVKA-II、AFP和AFP-L3级分的相关性分析。另外，已知AFP-L3级分对肝细胞癌的特异性高于AFP。结果示于图4(a)～图4(c)中。
由图4(a)～图4(c)所示的结果可以清楚地看出，发现血液中L-FABP浓度与PIVKA-II显著地(p<0.0001)高相关，相关系数r＝0.518；发现与AFP显著地(p＝0.002)低相关，相关系数r＝0.271；发现与AFP-L3级分显著地(p<0.004)高相关，相关系数r＝0.415。
以上，基于实施例2所示的结果，可以说通过测定血液中L-FABP浓度，能够对从Child-Pugh分类中的阶段A的患者至晚期肝硬化患者或患有肝细胞癌的慢性肝疾病患者进行一致评价，并且能够在不包括Child-Pugh分类中的脑病、腹水水平这样的主观因素的情况下对肝疾病发展风险的预测或肝疾病发展的监测进行检查。
<实施例3>
使用患有HCC的慢性肝疾病患者(HCC(+))和未患HCC的慢性肝疾病患者(HCC(-))的各血液样本，用1w/v％SDS在25℃下变性处理10分钟后，使用“レナプロL-FABPテストHS(高灵敏度)”(シミックホールディングス株式会社制造)的抗体测定血液中L-FABP总浓度(ng/ml)。
此外，除了对HCC(+)和HCC(-)的各血液样本进行GU处理来代替用SDS进行的变性处理以外，以同样的方式实施ELISA测定，由GU处理后的OD值/用SDS进行变性处理后的OD值计算出L-FABP的氧化率。
此外，由上文得到的氧化率与所述血液中L-FABP总浓度(ng/ml)的乘积计算出氧化型L-FABP的血中浓度(ng/ml)。结果示于下表1中。
此外，使用因肝疾病死亡的组(死亡组)和未因肝疾病死亡的组(存活组)的慢性肝疾病患者的各血液样本，以同样的方式测定血液中L-FABP总浓度以及GU处理后强度，分别计算出L-FABP的氧化率、氧化型L-FABP的血中浓度。结果示于下表2中。
(比较例2)
此外，作为比较例2，在HCC(+)、HCC(-)、死亡组以及存活组的各血液样本中也测定了血清白蛋白浓度(U/L)。结果示于下表1和表2中。
[表1]
Figure BDA0002996767820000301
[表2]
Figure BDA0002996767820000302
上表中，L-FABP总浓度*1表示用SDS进行变性处理后的浓度(ng/ml)，氧化率*2表示GU处理后的OD值/用SDS进行变性处理后的OD值。
由上表1和表2所示的结果可以清楚地看出，与HCC(-)相比，在HCC(+)中L-FABP总浓度成为显著高值；与存活组相比，在死亡组中L-FABP总浓度成为显著高值。
此外可以看出，与HCC(-)相比，在HCC(+)中L-FABP的氧化率具有成为高值的倾向；与存活组相比，在死亡组中L-FABP的氧化率成为显著高值。
此外可以看出，对于由氧化率与血液中L-FABP总浓度的乘积得到的氧化型L-FABP的血中浓度，与HCC(-)相比，在HCC(+)中成为显著高值；与存活组相比，在死亡组中成为显著高值。
与L-FABP总浓度、氧化率相比，氧化型L-FABP的血中浓度这一方面在与HCC(-)相比的HCC(+)以及与存活组相比的死亡组中均显示出在较小p值下成为显著高值，因此可以说能够以最高精度对肝疾病进行检查。
另一方面，可以看出，比较例2的血清白蛋白浓度在HCC(-)和HCC(+)之间没有显著性差异，在存活组和死亡组之间没有显著性差异，对肝疾病的检查能力差。
从更详细地评价肝疾病的检查能力的精度的观点来看，对所述血液中L-FABP总浓度、L-FABP的所述氧化率以及由所述氧化率与所述血液中L-FABP总浓度的乘积得到的氧化型L-FABP的血中浓度中的每一个进行了ROC分析。此外，对比较例2的血清白蛋白浓度也进行了ROC分析。结果示于图5中。
由图5所示的结果可以清楚地看出，L-FABP的氧化率的AUC为0.658，p为0.009；血液中L-FABP总浓度的AUC为0.701，p为0.0008；并且由所述氧化率与所述血液中L-FABP总浓度的乘积得到的氧化型L-FABP的血中浓度的AUC为0.729，p为0.0001，可以看出肝疾病的检查能力的精度按照所述氧化率、所述血液中L-FABP总浓度和所述氧化型L-FABP的血中浓度的顺序提高，可以看出上述任一者都可以高精度地对肝疾病进行检查，特别是可以看出所述氧化型L-FABP的血中浓度在肝疾病的检查能力的精度方面是最优异的。
另一方面，关于比较例2的血清白蛋白浓度，AUC低至0.568，p值也高至0.29，没有显著性，可知对肝疾病的检查能力差。
由上述ROC分析结果可以得出，血液中L-FABP总浓度的基准值(阈值)为7.7，由与所述血液中L-FABP总浓度的乘积得到的氧化型L-FABP的血中浓度的基准值为1.9，血清白蛋白浓度的基准值为3.1。
用所述血液中L-FABP总浓度的所述基准值划分的生存曲线；用由所述氧化率与所述血液中L-FABP总浓度的乘积得到的氧化型L-FABP的血中浓度的所述基准值划分的生存曲线；以及用血清白蛋白浓度的所述基准值划分的生存曲线示于图6(a)～图6(c)中。
由图6(a)所示的结果可以清楚地看出，所述血液中L-FABP总浓度大于基准值7.7时和在基准值7.7以下时的生存曲线间的p值为<0.003，有显著性差异，可知可以预测肝疾病引起的死亡风险(优选地，从定量到1100天以上之前的死亡风险)。
由图6(b)所示的结果可以清楚地看出，进而，由所述氧化率与所述血液中L-FABP总浓度的乘积得到的氧化型L-FABP的血中浓度大于基准值1.9时和在基准值1.9以下时的生存曲线间的p值为<0.0001，显著性差异大，可知肝疾病的检查能力特别优异，可以预测肝疾病引起的死亡风险。
另一方面，由图6(c)所示的结果可以清楚地看出，血清白蛋白浓度大于3.1时和血清白蛋白浓度在3.1以下时的生存曲线间的p值为<0.02，显著性小，可知肝疾病的检查能力差。
对GU处理后的L-FABP的测定值也进行了ROC分析。结果示于图7(a)中。
此外，为了比较，将关于所述血液中L-FABP总浓度、由所述氧化率与所述血液中L-FABP总浓度的乘积得到的氧化型L-FABP的血中浓度以及比较例2的血清白蛋白浓度中每一个的ROC分析结果从图5复制过来。
由图7(a)所示的结果可以清楚地看出，GU处理后L-FABP的测定值的AUC为0.717，p值为0.0009，得到了与所述氧化型L-FABP的血中浓度的AUC和p值接近的值，能够以符合所述氧化型L-FABP的血中浓度那样的水平高精度地对肝疾病进行检查。
由所述ROC分析结果得出，GU处理后L-FABP的测定值的基准值为4.5。
用GU处理后L-FABP的测定值的基准值4.5划分的生存曲线如图7(b)所示。
由图7(b)所示的结果可以清楚地看出，GU处理后L-FABP的测定值大于基准值4.5时和在基准值4.5以下时的生存曲线间的p值为＝0.0002，显著性差异大，可知肝疾病的检查能力优异，可以预测肝疾病引起的死亡风险(优选地，从定量到1100天以上之前的死亡风险)。
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1 5 10 15
Ala Phe Met Lys Ala Ile Gly Leu Pro Glu Glu Leu Ile Gln Lys Gly
20 25 30
Lys Asp Ile Lys Gly Val Ser Glu Ile Val Gln Asn Gly Lys His Phe
35 40 45
Lys Phe Thr Ile Thr Ala Gly Ser Lys Val Ile Gln Asn Glu Phe Thr
50 55 60
Val Gly Glu Glu Cys Glu Leu Glu Thr Met Thr Gly Glu Lys Val Lys
65 70 75 80
Thr Val Val Gln Leu Glu Gly Asp Asn Lys Leu Val Thr Thr Phe Lys
85 90 95
Asn Ile Lys Ser Val Thr Glu Leu Asn Gly Asp Ile Ile Thr Asn Thr
100 105 110
Met Thr Leu Gly Asp Ile Val Phe Lys Arg Ile Ser Lys Arg Ile
115 120 125

Claims (23)

1.一种对与血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质的量相关的肝疾病的发展阶段或严重程度进行检查的方法，
所述方法包括对从受试者采集的血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序，并根据所述定量的结果对与血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质的量相关的肝疾病的发展阶段或严重程度进行检查。
2.如权利要求1所述的方法，所述检查包括肝疾病引起的死亡风险的预测。
3.如权利要求2所述的方法，所述预测是包括天数在内的死亡风险发生的预测。
4.一种肝疾病的检查方法，所述肝疾病是包括肝硬化在内的慢性肝疾病，所述检查方法包括对从受试者采集的血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序。
5.如权利要求4所述的方法，所述肝疾病是包括肝硬化在内的慢性肝疾病和肝细胞癌的并发疾病。
6.一种与血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质的量相关的肝疾病的检查方法，所述检查方法包括对从受试者采集的血液中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行定量的工序，
所述进行定量的工序是对所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的工序；或者
所述定量是在进行促进抗原抗体反应的处理并且所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下进行的定量。
7.如权利要求6所述的检查方法，所述检查方法包括确定所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的定量值相对于血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质的定量值的比例作为氧化率的工序，
所述测定灵敏度高的条件是所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度相对于所述未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度为1.4倍以上的条件。
8.如权利要求6所述的检查方法，所述条件是通过用离液试剂或有机胺化合物进行处理而形成的条件。
9.如权利要求6～8中任一项所述的检查方法，所述检查方法还包括以下工序：与所述进行促进抗原抗体反应的处理并且经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件相比，在经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质和未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度差小的条件下对所述肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量。
10.如权利要求9所述的检查方法，所述测定灵敏度差小的条件是通过用表面活性剂对所述血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质进行变性处理而形成的条件。
11.如权利要求9或10所述的检查方法，所述检查方法还包括以下工序：基于在所述测定灵敏度差小的条件下的所述肝型脂肪酸结合蛋白质的测定值以及在所述进行促进抗原抗体反应的处理并且经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度比未经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的测定灵敏度高的条件下的测定值，计算出与血液中的肝型脂肪酸结合蛋白质中的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的比例大致对应的氧化率。
12.如权利要求1、2、3或6所述的检查方法，所述肝疾病是选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病。
13.如权利要求4～6中任一项所述的方法，所述检查包括肝疾病引起的死亡风险的预测。
14.如权利要求13所述的方法，所述预测是包括天数在内的死亡风险发生的预测。
15.一种肝疾病的检查方法，所述检查方法包括选自于由以下(1)和(2)组成的组中的至少一个工序并且基于受试者中肝型脂肪酸结合蛋白质的量或者经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值：
(1)将肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知正常范围，或选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病中肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知范围，或具有肝疾病引起的死亡风险的肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知范围与受试者中肝型脂肪酸结合蛋白质的量进行比较，决定受试者中的所述量是否属于所述范围中的任一个的工序；
(2)将经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值的已知正常范围，或选自于由慢性肝疾病、肝硬化和肝细胞癌组成的组中的至少一种疾病中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值的已知范围，或具有肝疾病引起的死亡风险的经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量的已知范围与受试者中经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质的量或与其相关的参数的值进行比较，决定受试者中的所述量或与其相关的参数的值是否属于所述范围中的任一个的工序。
16.如权利要求15所述的方法，所述方法基于仅肝型脂肪酸结合蛋白质的定量结果。
17.如权利要求15或16所述的方法，所述方法不包括脑病水平和腹水水平的评价。
18.用于如权利要求1～17中任一项所述的方法的肝疾病检查试剂盒，所述肝疾病检查试剂盒包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质。
19.如权利要求18所述的肝疾病检查试剂盒，所述肝疾病检查试剂盒对选自于由肝疾病的种类、发展阶段和严重程度组成的组中的至少一种进行检查。
20.如权利要求18所述的肝疾病检查试剂盒，所述肝疾病检查试剂盒还包含变性处理剂。
21.如权利要求20所述的肝疾病检查试剂盒，能够对所述肝型脂肪酸结合蛋白质或所述经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质是抗L-FABP抗体，所述变性处理剂是表面活性剂或十二烷基硫酸钠。
22.采用如权利要求1～17中任一项所述的方法的肝疾病伴随诊断药，所述肝疾病伴随诊断药包含能够对肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质进行定量的物质。
23.在如权利要求1～17中任一项所述的方法中作为定量对象使用的肝疾病标志物，所述肝疾病标志物由肝型脂肪酸结合蛋白质或经氧化的肝型脂肪酸结合蛋白质构成。
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