WO2006131379A2 - Verfahren zum testen von substanzen oder substanzgemischen, dessen verwendung und entsprechende analysekits - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen von Substanzen und Substanzgemischen auf toxische Eigenschaften, dessen Verwendung und entsprechende Analysekits. Das Verfahren basiert im Wesentlichen auf der Bestimmung eines Fettsäurebindeproteins aus der Leber, L-FABP (Abkürzung des englischen Begriffs Liver Fatty Acid Binding Protein). Die Anwendung dieses Verfahrens liefert insbesondere frühzeitige Hinweise auf kanzerogene und vor allem tumorpromovierende Eigenschaften der getesteten Substanz oder des getesteten Substanzgemisches.

Description

Verfahren zum Testen von Substanzen oder Substanzgemischen, dessen Verwendung und entsprechende Analysekits.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen von Substanzen und Substanzgemischen auf toxische Eigenschaften, dessen Verwendung und entsprechende Analysekits. Das Verfahren basiert im Wesentlichen auf der Bestimmung eines Leber- Fettsäurebindeproteins, L-FABP (Abkürzung des englischen Begriffs Liver Fatty Acid Binding Protein). Die Anwendung dieses Verfahrens liefert insbesondere frühzeitige Hinweise auf kanzerogene und vor allem tumorpromovierende Eigenschaften der getesteten Substanz oder des getesteten Substanzgemisches.

Ein mögliches krebserzeugendes Potenzial kann für die Entwicklung eines Wirkstoffs ein "Knock Out"-Kriterium darstellen. Während für Pharmawirkstoffe je nach Anwen- dungsbereich eine solche Wirkung in Kauf genommen werden kann, ist sie für die Entwicklung von Pflanzenschutzwirkstoffen eine ernste Gefahr. Dabei gilt es grundsätzlich zu differenzieren zwischen einem krebserzeugenden Potenzial, das auf eine gentoxische Wirkung zurückzuführen ist, und einem krebserzeugenden Potenzial, dem ein nicht-gentoxischer, tumorpromovierender Mechanismus zugrunde liegt. Im letzteren Fall kann eine Wirkschwelle angenommen und häufig auch experimentell belegt werden, und die Substanz kann zugelassen werden. Allgemein ist festzuhalten, dass sich gentoxische und nicht-gentoxische Kanzerogene in wesentlichen Punkten unterscheiden, was der Differenzierung zwischen nicht-vollständigen und vollständigen Kanzerogenen gleichkommt. So sind Effekte in der frühen Promotionsphase häufig reversibel und ein Tumormarker (gentoxische Wirkung) ist nicht per se ein Marker für eine Tumorpromotion (nicht-gentoxische Wirkung). Ferner ist es nach dem zweistufigen Kanzerogenese-Modell in der Regel erforderlich, dass einer tumorpromovierenden Wirkung eine Initiation der betroffenen Zellen vorausgeht.

Eine möglichst frühe Aussage zur tumorpromovierenden Eigenschaft ist wichtig, da die klassische Prüfung in einer Kanzerisierungsstudie langwierig und kostspielig ist. Be- sonders bei gleichzeitig nicht oder nur schwach ausgeprägten gentoxischen Eigenschaften wird aus den durchgeführten Untersuchungen auf Mutagenität/Gentoxizität kein deutlicher Warnhinweis erhalten. Das Auftreten von Tumoren aufgrund tumorpromovierender Eigenschaften erfolgt erst spät in der Studie und unter hohen Dosierun- gen und ist deshalb bezüglich ihrer Relevanz für den Menschen schwierig einzustufen.

Tumorpromovierende Substanzen sind besonders gut an der Nagerleber (vor allem in der Ratte) beschrieben. Das Zielorgan Leber ist ein gutes Modellsystem, da die meisten kanzerogenen Substanzen bei den Nagern Lebertumoren erzeugen, was im Ein- klang mit der primären Rolle der Leber als Haupt-Entgiftungsorgan steht. Zur Leber- kanzerogenität gibt es eine breite mechanistische Datenbasis. Bei den nicht- gentoxischen tumorpromovierenden Substanzen mit Zielorgan Leber wurde eine Reihe von Substanzgruppen beschrieben, zu denen insbesondere solche mit Rezeptorvermittelten Wirkmechanismen, z.B. Lipidsenker und Peroxisomenproliferatoren, TCDD und Analoga sowie östrogenartige Substanzen, Enzyminduktoren, z.B. DDT, alpha- Hexachlorcyclohexan, Phenobarbital, diverse Pflanzenschutzmittel und Pharmaka sowie AH-Rezeptoragonisten und zytotoxisch mitogene Substanzen, z.B. Tetrachlorkohlenstoff und Tetrahydrofuran, oxidativen Stress fördernde Substanzen, z.B. FeNTA und Substanzen mit mitochondrialer Toxizität, z.B. einige Aromaten, Amine und Furane, gehören.

Peroxisomenproliferatoren sind wahrscheinlich nur für das Nagersystem von Bedeutung. Für antihormonelle und hormonartig auf das männliche und weibliche Reproduktionssystem wirkende Substanzen wurden bereits funktionelle Testsysteme entwickelt. Das Erscheinungsbild ist bei den Nagern eine signifikante Vergrößerung der Leber, Ausbildung präneoplastischer, immuncytochemisch nachweisbarer Läsionen, die sich in späteren Phasen zu Lebertumoren entwickeln können. Für die Erfassung der präne- oplastischen Läsionen stehen im Tierversuch verschiedene "Medium-Term"-Assays zur Verfügung (z.B. Initiations-Promotions-Modelle nach Ito (Ito. N., Imaida, K., Hasegawa, R., Tsuda, H. Crit. Rev. Toxicol. (1989) 19, 385-415) bzw. Schulte-Hermann (Schulte- Hermann, R., Bursch, W., Low-Baselli, A., Wagner, A., Grasl-Kraupp, B. Cell Biol. To- xicol. (1997) 13, 339-348). Diese sind für Screening-Zwecke allerdings zu aufwändig. Auch Screening-Systeme auf Basis von Transkriptom- und Proteomanalysen sind problembehaftet, da sich in der Regel eine Vielzahl von Markern verändert und zwi- sehen adaptiven homeostatischen und signifikant (irreversibel) veränderten Markern nur schwer unterschieden werden kann.

L-FABP ist mit 2 bis 6 % Anteil am gesamt-cytosolischen Protein ein häufig vorkommendes Protein in der Rattenleber (S. Sorof, Cancer and Metastasis Reviews (1994) 13, 317-336). Insgesamt sind sieben Fettsäurebindeproteine bekannt, die nach dem Gewebe benannt sind, aus dem sie ursprünglich isoliert wurden (R. Das, R. Hamma- mieh, R. Neill, M. Melhem, M. Jett, Clin. Cancer Res. (2001 ) 7, 1706-1715): a) Adipo- cyten (A-FABP), b) Herz oder Muskel (H-FABP), c) Hirn (B-FABP), d) Epidermis oder Psoriasis-assoziiertes (E-FABP), e) Leber (L-FABP), f) Dünndarm (I-FABP) und g) My- elin- oder P2 (P2-FABP). Hauptaufgabe der FABPs ist der Transport von langkettigen Fettsäuren und anderen hydrophoben Liganden, die teilweise in Signaltransduktions- Ketten involviert sind. Das Fehlen von bestimmten Fettsäurebindeproteinen oder deren Fehlfunktion wird in der Literatur mit Krankheiten wie Diabetes, Hyperlipidämie, Fettleibigkeit, Atherosklerose und Herzmuskel-Hypertrophie in Verbindung gebracht (J. F. Glatz, J. Storch, Curr. Opinion in Lipidology (2001) 12, 267-274).

Es gibt Hinweise, wonach Fettsäurebindeproteinen eine Funktion bei Zellteilung und - differenzierung zukommen kann. Schroeder et al. konnten zeigen, dass L-FABP das Wachstum und die Differenzierung embryonaler Stammzellen beeinflusst (F. Schroe- der, B. P. Atshaves, O. Starodub, A.L Boedeker, R.R. Smith III., J.B. Roths, W.B. Fox- worth, A.B. Kier, Molecular and Cellular Biochemistry (2001) 219, 127-138). Sorof beschreibt die Modulation der Mitogenese durch L-FABP (Sorof et al. 1994), supra). Demnach soll es eine Synergie zwischen der Wirkung von L-FABP und ungesättigten Fettsäuren bei der Promotion der Zellproliferation geben. L-FABP soll weiterhin zur Induktion der Mitogenese - induziert durch unterschiedliche Klassen nicht-gentoxischer hepatokanzerogener Peroxisomenproliferatoren - benötigt werden. Zusammen mit anderen Hinweisen soll dies den Schluss zulassen, dass L-FABP an der Regulation der Hepatocyten-Zellteilung beteiligt ist. L-FABP wird außerdem von Sorot et al. als das polypeptidische Target eines qenotoxischen Kanzerogens (2-Acetylaminofluoren) in Rattenhepatocyten beschrieben (J.A. Bassuk, P.N. Tsichlis, S. Sorof, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 84, 7547-7551 ). Allerdings wird auch dort eine sehr starke Zunahme des Proteins in Ratten-Hepatozvten während der Proliferation nach Induktion durch das Kanzerogen beschrieben. Dies steht im Einklang mit Das et al, welche beim Vergleich normaler humaner Prostatazellen mit entsprechenden Krebszellen eine deut- liehe Hochregulierung (5-9-fach) vom L- und I-FABP fanden. A- und E-FABP waren in den Krebszellen hingegen deutlich (3-20-fach) herunterreguliert. Diese Autoren schlagen FABPs als potenzielle Marker und therapeutische Ziele für Brust- und Prostatakrebs vor (US-A 2002/0127619), obwohl Veränderungen in etablierten Zelllinien bzw. nach Transformation häufig nicht signifikant sind. Das Ziel, einen frühen Marker für Tumorpromotion zu definieren, kann damit nicht erreicht werden.

Mit 2D-Gelelektrophorese konnten Celis und Mitarbeiter (J.E. Celis, M. Ostergaard, B. Basse, A. Celis, J.B. Lauridsen, G. P. Ratz, I. Andersen, B. Hein, H. Wolf, T.F. Orntoft, H.H. Rasmussen, Cancer Research (1996) 56, 4782-4790) zeigen, dass das Adipocy- ten-FABP (A-FABP) in fortgeschrittenenen Stadien von Plattenepithelkarzinomen der Harnblase drastisch abnimmt. Fortgeschrittene Stadien der Harnblasenkanzerogenese waren statistisch korreliert mit der An- oder Abwesenheit von A-FABP. Die Autoren folgern, dass A-FABP eine wichtige Komponente bei der Plattenepithelkarzinomentste- hung ist und deshalb prognostischen Wert besitzt.

Weiterhin fielen Fettsäurebindeproteine in einer Analyse von Peroxisomenproliferator- induzierten Proteomänderungen auf, bei denen die Kopplung dieser Änderungen an einen Rezeptormechanismus durch vergleichende Untersuchungen in PPAR-α (Pero- xisomenproliferator-aktivierter Rezeptor-Typ alpha)-Knock-out-Mäusen gezeigt wurde (Macdonald N., Chevalier S., Tonge R., Davison M., Rowlinson R., Young J., Rayner S., Roberts R., Arch. Toxicol (2001) 75, 415-424). Auch hier wurde über eine Zunahme des Proteins berichtet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es zum einen, ein praktikables Verfahren zum Testen von Substanzen oder Substanzgemischen zur Verfügung zu stellen, mit dem sich kanzerogene und insbesondere tumorpromovierende Eigenschaften erkennen lassen.

Diese Aufgabe löst die vorliegende Erfindung dadurch, dass man bestimmt, ob die Einwirkung der zu testenden Substanz oder des zu testenden Substanzgemisches auf einen Organismus oder einen Teil davon die Expression wenigstens eines L-FABP verändert. Anhand von Testsubstanzen mit eindeutig für den Endpunkt definierter Wirkung wie Tumorpromotoren und ihrer Charakterisierung im Langzeittest wurde nämlich gefunden, dass L-FABP ein relevanter Marker ist, der in der gesunden Zelle in ausrei- chend hoher Konzentration vorliegt und sich mit Substanzbehandlung verändert. Aufgrund des gefundenen Verhaltens von L-FABP bei Einwirkung von tumorpromovierenden Substanzen bietet das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere den Vorteil, eine ausreichend hohe statistische Signifikanz zu haben, womit solche Effekte vor dem Hintergrundrauschen detektiert werden können. „Hintergrund rauschen" wird in diesem Zusammenhang als Verschiebungen benachbarter Intensitäten anderer Proteine definiert, deren Veränderung kein ursächlicher Zusammenhang zugeordnet werden kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Testen von Substanzen oder Substanzgemischen, wobei man a) die Substanz oder das Substanzgemisch auf einen Organismus oder einen

Teil davon einwirken lässt; und b) die Expression wenigstens eines Leber-Fettsäurebindeproteins (L-FABP) in wenigstens einer von dem Organismus oder dem Teil stammenden Probe bestimmt. Gemäß Verfahrensschritt a) lässt man die zu testende Substanz oder das zu testende Substanzgemisch auf einen Organismus oder einen Teil davon einwirken. Ziel ist es, in Verfahrenschritt b) die mit der Einwirkung einhergehenden Veränderungen der L- FABP-Expression festzustellen und insbesondere zu quantifizieren.

Erfindungsgemäß ist es von Vorteil, die Expressionsanalyse an wenigstens zwei Zeitpunkten vorzunehmen. Durch die Wiederholung der Expressionsanalyse zu unterschiedlichen Zeitpunkten ist es möglich, die relative Veränderung der L-FABP- Expression in Abhängigkeit von der Zeit zu bestimmen. Eine solche zeitabhängige Be- Stimmung erlaubt es, eine signifikante Veränderung über die Zeit mit Hilfe geeigneter statistischer Methoden als Trend zu ermitteln, wodurch transiente Phänomene, beispielsweise eine anfängliche gegenteilige Veränderung der L-FABP-Expression, erkannt und entsprechend bewertet werden können.

Demnach beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren einer vorteilhaften Ausführungsform zufolge, dass man a) die Substanz oder das Substanzgemisch auf einen Organismus oder einen Teil davon einwirken lässt; und b) die Expression wenigstens eines Leber-Fettsäurebindeproteins- (L-FABP) in we- nigstens einer ersten und wenigstens einer zweiten von dem Organismus oder dem Teil stammenden Probe bestimmt, wobei die erste Probe dem Organismus oder den Teil davon nach einer ersten Einwirkungsdauer und die zweite Probe dem Organismus oder dem Teil davon nach einer zweiten Einwirkungsdauer entnommen ist und die erste Einwirkungsdauer von der zweiten Einwirkungsdauer verschieden ist.

Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist insbesondere dann zweckmäßig, wenn während der Einwirkungszeit der Substanz oder des Substanzgemisches Proben genommen werden können, die Probennahme die Einwirkung der Substanz oder des Substanzgemisches also nicht beendet. So ist diese Ausführungsform insbesondere für in v/fro-Systeme geeignet.

Einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform zufolge beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren, dass man a1 ) die Substanz oder das Substanzgemisch auf einen ersten Organismus oder einen Teil davon einwirken lässt; b1 ) die Expression wenigstens eines Leber-Fettsäurebindeproteins (L-FABP) in wenigstens einer von dem ersten Organismus oder dem Teil stammenden Probe bestimmt; a2) die Substanz oder das Substanzgemisch auf einen zweiten Organismus oder einen Teil davon einwirken lässt; und b2) die Expression des Leber-Fettsäurebindeproteins (L-FABP) in wenigstens einer von dem zweiten Organismus oder dem Teil stammenden Probe bestimmt, wobei die Einwirkungsdauer auf den ersten Organismus oder den Teil davon verschieden ist von der Einwirkungsdauer auf den zweiten Organismus oder den Teil davon.

Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist insbesondere dann zweckmäßig, wenn durch die Probennahme das Einwirken der Substanz oder des Substanzgemisches beendet ist. Dies gilt insbesondere für in v/Vo-Systeme, also beispielsweise Tierversuche, bei denen das Tier im Anschluss an eine bestimmte Einwirkungszeit der Substanz oder des Substanzgemisches getötet und das Tier oder ein für die Expressionsbestimmung vorgesehener Teil davon in einen Zustand versetzt wird, der keine weitere Veränderung der Expression des Leber-Fettsäurebindeproteins zu- lässt.

a) Das Einwirken der Testsubstanz bzw. des Testsubstanzgemisches

Bevorzugt ist die Einwirkung in vivo. Verwendet man dazu einen Organismus, so han- delt es sich hierbei vorzugsweise um einen tierischen Organismus, insbesondere ein Wirbeltier, vorzugsweise einen Säuger, vor allem um Nager, beispielsweise Ratten oder Mäuse. Gemäß einer besonderen Ausführungsform verwendet man einen Rattenoder Maus-Stamm, der in der Toxikologie gebräuchlich ist, beispielsweise Wistar- Ratten oder vorzugsweise Fischer 344-Ratten. Bei letzteren handelt es sich um einen Inzuchtstamm, der eine geringere Variabilität der zellulären Proteinmuster von Tier zu Tier erwarten lässt. Die zu testende Substanz oder das zu testende Substanzgemisch wird dem Organismus in der Regel gezielt verabreicht, insbesondere peroral, beispielsweise mit dem Futter oder über eine Schlundsonde, oder per Injektion, beispielsweise intraperitoneal, intravenös, subkutan oder intradermal.

Die Einwirkungsdauer ist zwar variabel. Jedoch ist einerseits eine Mindesteinwirkungsdauer für das erfindungsgemäße Verfahren von Bedeutung, damit die durch die Einwirkung hervorgerufenen Wirkungen bestimmt werden können. Andererseits ist eine relativ kurze Einwirkungsdauer zweckmäßig, damit das Verfahren rasch durchzuführen ist.. So kann die Dauer im Bereich von wenigen Stunden bis zu mehreren Tagen oder auch mehreren Wochen liegen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist allerdings einerseits eine Mindesteinwirkungsdauer im Bereich von mehr als 24 Stunden, insbesondere von wenigstens 36 Stunden und vorteilhafterweise von wenigstens 48 Stunden, andererseits eine relativ kurze Einwirkungsdauer von bis zu 10, 9, 8, 7, 6, 5 oder 4 Tagen und insbesondere von bis zu 72, 68, 64, 60, 56, 52, oder 48 Stunden.

Die erfindungsgemäß bevorzugte Kombination aus in wVo-Einwirkung (Exposition) und relativ kurzen Einwirkungszeiten ist vor allem mit folgenden Vorteilen verbunden:

- der Möglichkeit, relativ geringe Substanzmengen einsetzen zu können; - einer kurzen Durchführungsdauer des Verfahrens;

- der Verwendung einer relativ geringen Tierzahl.

Üblicherweise beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren, dass man in mehreren Ansätzen unterschiedliche Einwirkungszeiten wählt, um auf diese Art und Weise eine von der Einwirkungszeit abhängende Veränderung der L-FABP-Expression erkennen zu können. Analoges gilt für die Dosierung der zu testenden Substanz bzw. des zu testenden Substanzgemisches.

Verwendet man einen Teil eines Organismus, so kann es sich hierbei beispielsweise um Organe, Gewebepräparationen oder Isolate davon, insbesondere zellhaltige Fraktionen, handein. Diese können in zweckmäßiger Weise für ex vivo und in vitro Assays hergerichtet werden. Das Einwirken der Substanz bzw. des Substanzgemisches entspricht dann einer Inkubation.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Leber bzw. Leberbestandteile, beispielsweise Leberextrakte oder Leberzellen und Leberzellkulturen, verwendet.

Im Anschluss an das Einwirken oder die Inkubation werden bestimmte Teile aus dem behandelten Organismus bzw. das Inkubationsgemisch oder Teile des Inkubationsgemisches als Probe, erforderlichenfalls unter geeigneter Aufarbeitung, der proteinanalytischen Bestimmung zugeführt werden.

b) Die proteinanalytische Bestimmung

Die erfindungsgemäße Expressionsanalyse beinhaltet die Bestimmung der Proteinexpression und damit eine Aussage über die zum Testzeitpunkt in der Zelle vorhandene Proteinmenge und Proteinzusammensetzung. Dies ist erfindungsgemäß von Bedeu- tung. Eine mRNA-Analyse würde diese Aussage nicht ohne weiteres zulassen, da zwischen der Menge einer mRNA und der dazugehörigen Proteinmenge aufgrund von Translationsregulation, mRNA-Stabilität, Proteinstabilität und Proteinabbau keine strikte Korrelation besteht. Der Begriff "Leber-Fettsäurebindeprotein" (kurz L-FABP) bezeichnet Proteine, welche am Transport von Fettsäuren und anderen hydrophoben Liganden beteiligt sind. Entsprechend ihrer Bezeichnung kommen diese Proteine in der Leber von Wirbeltieren vor.

Aufgrund der unterschiedlichen phylogenetischen Entwicklung ergibt sich eine gewisse Species-abhängige Heterogenität innerhalb dieser Gruppe von Proteinen. Je nach Organismus wird sich die Bestimmung auf das jeweilige in dem betreffenden Organismus zu erwartende L-FABP richten. Insbesondere richtet sich die Bestimmung auf L-FABPs aus der Ratte, insbesondere aus Rattus norvegicus.

Zusätzlich zu Spezies-abhängigen Variationen finden sich für jede Spezies in der Regel auch polymorphe Varianten, die aufgrund alleler Variation unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen. Im Übrigen beinhaltet die Gruppe von L-FABPs auch Pro- teine gleicher Sequenz, die unterschiedliche posttranslationale Modifikationen aufweisen, wie bestimmte Glykosylierungsmuster.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtet sich die Expressionsanalyse auf ein L-FABP mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1.

Weitere nützliche Anweisungen zur erfindungsgemäßen Bestimmung des L-FABP kann der Fachmann auch den in den vorstehend genannten Druckschriften angegebenen Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen entnehmen. Darüber hinaus finden sich zahlreiche Einträge in einschlägigen Gendatenbanken zu L-FABP-codierenden Nuk- leinsäuresequenzen, von denen ausgehend der Fachmann in der Lage ist, geeignete Mittel zum Nachweis der entsprechenden Proteine zur Verfügung zu stellen.

Die erfindungsgemäße Analyse gliedert sich im Wesentlichen in drei Verfahrensschritte: b1 ) Zweckmäßige Bereitstellung des zu bestimmenden Expressionsproduktes;

b2) Quantifizierung des Expressionsproduktes; und gegebenenfalls

b3) Auswertung.

Die Verfahrensschritte b1 ), b2) und b3) werden vorteilhafterweise in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt. Werden weitere Untersuchungen, beispielsweise Bestimmungen weiterer Proteine, zusammen mit der L-FABP-Bestimmung durchgeführt, so können diese Untersuchungen in getrennten Verfahren oder, gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, zumindest teilweise parallel in einem entsprechend ausgestalteten Verfahren erfolgen, wobei insbesondere zumindest die Verfahrensschritte b1) und b2) parallel durchgeführt werden.

b1 ) Die Bereitstellung des zu bestimmenden Expressionsproduktes (Probe)

Im Prinzip können beliebige Proben des Organismus oder eines Teils davon analysiert werden. Körperproben wie Organe oder Gewebe, nativ, gefroren, fixiert, mit oder ohne Dissektion, und insbesondere zellhaltige Fraktionen davon, sowie die oben beschrie- benen Inkubationsgemische oder Teile davon können vorteilhaft für die erfindungsgemäße L-FABP-Bestimmung verwendet werden. Demnach handelt es sich bei diesem Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens um ein in vitro Verfahren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden als Probe Leber und Leberbestandteile bzw. Isolate, insbesondere zellhaltige Fraktionen davon, verwendet.

Mit Blick auf die erfindungsgemäß durchzuführende Expressionsanalyse erfolgt erforderlichenfalls eine vorbereitende Aufarbeitung der in der Probe vorhandenen zellulären Bestandteile und insbesondere der zu bestimmenden Expressionsprodukte, wodurch diese im Hinblick auf das erfindungsgemäße Verfahren in einer zweckmäßigen Form bereitgestellt werden. Eine solche Aufarbeitung entspricht in der Regel üblicher Praxis und orientiert sich insbesondere an den Erfordernissen einer proteinanalytischen Expressionsbestimmung und insbesondere einer Proteomanalyse.

Die Anforderungen an eine geeignete Probenvorbereitung sind in der Regel hoch. Arti- fizielle Veränderungen der Proteinzusammensetzung, beispielsweise durch Proteolyse oder sonstige Modifikationen (z.B. Oxidationen) sollten vermieden werden.

Handelt es sich bei der Probe um Gewebe, wird dieses in der Regel zunächst homogenisiert. Anschließend erfolgt üblicherweise ein Zellaufschluss. Hierzu kann man die Probe beispielsweise Scherkräften aussetzen oder in eine hypotonische Umgebung bringen, in der die Zellen dann osmolytisch aufgebrochen werden. Letzteres kann mit üblichen Lysepuffern bewerkstelligt werden, die in der Regel auch geeignete Protease- Inhibitoren enthalten sollten. Das resultierende Lysat kann anschließend der eigentlichen proteinanalytischen Bestimmung zugeführt werden oder zunächst bei tiefer Temperatur, beispielsweise bei -80 ⁰C, aufbewahrt werden.

Um die Analyse mehrerer Lysate untereinander vergleichen zu können, kann man den Gesamtproteingehalt jedes Lysats nach üblichen Verfahren bestimmen. In der Regel bieten sich zur quantitativen Bestimmung Färbetests an, wie der Biuret-Assay, der Lowry-Assay, der Bicinchoninsäure-Assay, der Bradford-Assay, sowie weitere spektroskopische Verfahren oder auch die Bestimmung von Proteinen mittels radioaktiver Markierung.

Anhand des Gesamtproteingehalts können die Lysate entsprechend aliquotiert werden, so dass der anschließenden Analyse etwa gleiche Mengen an Gesamtprotein zugeführt werden. b2) Quantifizierung des Expressionsproduktes

Im Prinzip kann man sämtliche bekanntermaßen zur Quantifizierung von Proteinen geeignete Verfahren aus den Bereichen Proteinanalytik und insbesondere Proteom- analytik einsetzen. So können beispielsweise immunologische Techniken und bestimmte spektroskopische Verfahren, erforderlichenfalls in Kombination mit chromatographischen oder elektrophoretischen Trennmethoden, genannt werden. Um einen spezifischen Nachweis der exprimierten Proteine zu gewährleisten, kommen vorteilhafterweise immunologische Verfahren zur Anwendung. Hierfür benötigt man in der Regel Antikörper, die das zu bestimmende Protein möglichst spezifisch erkennen.

Geeignete L-FABP erkennende Antikörper sind bereits bekannt und können teilweise auch kommerziell bezogen werden. Beispielsweise werden von HyCuIt Biotechnology b.v. sowohl Antikörper gegen humanes L-FABP als auch gegen Ratten-L-FABP ange- boten. Dazu gehören sowohl monoklonale wie auch polyklonale Antikörper, die zum Teil mit L-FABP aus anderen Tierarten kreuzreaktiv sind. So können beispielsweise ein monoklonaler Antikörper gegen humanes L-FABP (Klon K5A6, Katalog-Nr. HM 2051 ), der auch in biotinylierter Form angeboten wird (Katalog-Nr. HM 2052), ein polyklonaler Antikörper gegen humanes L-FABP (Katalog-Nr. HP 9021) und ein polyklonaler Anti- körper gegen Ratten-L-FABP (Katalog-Nr. HP 8010), der mit L-FABP aus Mensch, Schwein und Maus kreuzreaktiv ist, genannt werden. Novocastra Laboratories Ltd. bietet einen monoklonalen Antikörper gegen humanes L-FABP an, der auch mit den Fettsäurebindeproteinen aus Niere und Darm reagiert.

Im Übrigen ist der Fachmann in der Lage, ausgehend von der L-FABP-Aminosäurese- quenz geeignete Antikörper herzustellen, die gegen das Protein gerichtet sind. Dazu kann man das gesamte Protein oder Derivate, z.B. Fragmente davon (Polypeptide) als Immunogen verwenden und in an sich bekannter Weise polyklonale und monoklonale Antikörper, und darauf aufbauend mittels rekombinanter Techniken auch humanisierte Antikörper, sowie Fragmente davon, herstellen. Beispielsweise können geeignete Antikörper hergestellt werden, indem man einen Wirt mit wenigstens einem erfindungsgemäßen L-FABP oder einem Derivat davon immunisiert und ein als Antwort auf die Immunisierung gebildetes Antikörper-haltiges Serum des Wirts gewinnt.

Ist das zu verwendende L-FABP nicht oder nur schwach immunogen, so kann man die Immunogenität dadurch erhöhen, dass man es an Träger, vorzugsweise ein Trägerprotein wie KLH koppelt. Dazu stehen dem Fachmann eine Reihe von Kopplungsmöglich- keiten zur Verfügung. Zweckmäßig kann beispielsweise die Umsetzung mit Glutardial- dehyd sein, beispielsweise durch Inkubation des Proteins oder eines Proteingemisches mit dem Trägerprotein oder einem Gemisch verschiedener Trägerproteine in Wasser oder einem wässrigen Lösungsmittel. In der Regel führt die Umsetzung innerhalb weniger Stunden zum erwünschten Ergebnis. Die Optimierung der Reaktionsparameter liegt im Bereich des fachmännischen Könnens.

Zusätzlich zum Antigen enthalten Immunisierungscocktails in der Regel weitere Hilfs- stoffe, insbesondere üblicherweise zur Immunisierung eingesetzte Adjuvanten, z.B. Freund-Adjuvanz.

Als Wirt eignen sich insbesondere Nager oder auch Kaninchen. Diesen oder anderen geeigneten Wirten werden die Immunisierungscocktails, vorzugsweise subkutan, injiziert. Die Antikörpertiter können mit einem Immunoassay, beispielsweise kompetitiv mit einem gegen Wirt-IgG gerichteten Schaf-Antiserum und markiertem Oligomer, be- stimmt werden. So kann gegen Ende der Immunisierung entschieden werden, ob ein bestimmter Wirt zur Antikörpergewinnung geeignet ist. Werden beispielsweise vier Immunisierungen durchgeführt, so kann man nach der dritten Immunisierung den Antikörpertiter bestimmen und dann aus Tieren, die einen ausreichenden Antikörpertiter aufweisen, Antikörper gewinnen. Zur Gewinnung gebildeter Antikörper ist es bevorzugt, den Wirten über mehrere Wochen oder Monate Blut abzunehmen. Abschließend kann man den Wirt ausbluten lassen. Aus dem gewonnen Blut kann in an sich bekannter Weise Serum gewonnen werden, das die erwünschten Antikörper enthält. Das so erhaltene Vollserum kann erfor- derlichenfalls in fachmännischer Weise weiter aufgereinigt werden, um die darin enthaltene Antikörperfraktion und insbesondere die L-FABP-erkennenden Antikörper anzureichern.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens selektiert man wenigs- tens einen Antikörper des Serums, der das als Immunogen verwendete L-FABP, ein Derivat davon oder wenigstens ein in der als Immunogen verwendeten Zusammensetzung enthaltenes L-FABP oder Derivat davon spezifisch erkennt. Spezifität meint in diesem Zusammenhang eine höhere Bindungsaffinität des Antikörpers für das Immunogen als für andere, insbesondere verwandte Proteine, vor allem weitere FABP's, wie sie eingangs genannt sind. Auch monoklonale L-FAB P-spezifische Antikörper können auf diese Art gewonnen werden. Hierzu ist es allerdings bevorzugt, den Wirten Milzge- webe zu entnehmen und ausgehend von den so gewonnenen Milzlymphocyten auf übliche Art und Weise Hybridome zu etablieren, welche die monoklonalen Antikörper produzieren.

Zu den erfindungsgemäß erhältlichen Antikörpern gehören insbesondere Antiseren, die mit obigen Verfahren erhalten werden können. Dies können Vollseren sein, d.h. aus dem Wirt gewonnenes Blut nach Abtrennung der zellulären und gerinnbaren Bestandteile, oder Fraktionen dieses Serums, in denen insbesondere die Immunglobulin- Fraktion und vorzugsweise die L-FABP-erkennende Immunglobulin-Fraktion angereichert ist. Derartige Fraktionen können mit den oben im Zusammenhang mit der Antikörper-Aufreinigung beschriebenen Verfahren erhalten werden. Polyklonale Antiseren enthalten Antikörper unterschiedlicher Spezifität, in der Regel unterschiedlicher Klassen und Subklassen, normalerweise sind sämtliche L-Ketten- Isotypen vertreten und es werden mehrere Proteinepitope erkannt.

Zu den erhältlichen Antikörpern gehören auch monoklonale Antikörper, insbesondere Chimäre und humanisierte Antikörper, sowie L-FABP-bindende Fragmente davon.

Diese Antikörper können dann insbesondere in quantitativen Immunoassays und Im- munoblot-Techniken, z.B. dem Westem-Blotting, Anwendung finden. Geeignet sind sowohl direkte als auch indirekte Assays. Insbesondere zu nennen sind kompetitive Immunoassays, d.h. das nachzuweisende Protein oder Polypeptid konkurriert als Antigen mit markiertem Antigen um die Antikörperbindung. Bevorzugt sind Sandwich- Immunoassays, d.h. die Bindung spezifischer Antikörper an das Antigen wird mit einem zweiten, meist markierten Antikörper nachgewiesen. Diese Assays können sowohl ho- mögen, d.h. ohne eine Trennung in feste und flüssige Phase, als auch heterogen, d.h. gebundene Markierungen werden von ungebundenen, beispielsweise über festpha- sengebundene Antikörper getrennt, ausgelegt sein. Die verschiedenen heterogenen und homogenen Immunoassay-Formate können je nach Markierung und Meßmethode bestimmten Klassen zugeordnet werden, beispielsweise RIAs (Radio-Immunoassays), ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), FIA (Fluoreszenz-Immunoassay), LIA (Lumineszenz-Immunoassay), TRFIA (zeitlich aufgelöster FIA), IMAC (Immunaktivie- rungsassay), EMIT (Enzyme Multiplied Immune Test), TIA (Turbidometrischer Immu- noassay).

Im Übrigen können immunologische Tests zur Bestimmung des L-FABPs auch kommerziell bezogen werden. Beispielsweise bietet HyCuIt Biotechnology b.v. einen entsprechenden ELISA-Test-Kit an, der nach dem Sandwich-Prinzip arbeitet. Kurzum, in Mikrotiterplatten, die mit L-FABP erkennenden Antikörpern beschichtet sind, werden Proben und Standards inkubiert. Während der Inkubation wird L-FABP durch den an die Festphase gebundenen Antikörper eingefangen. In der Probe vorhandenes Materi- al, das nicht bindet, wird durch Waschen entfernt. Anschließend gibt man einen zweiten gegen L-FABP gerichteten, biotinylierten Antikörper (Tracer) zu. Der Tracer- Antikörper bindet an eingefangenes L-FABP, soweit vorhanden. Überschüssiger Tracer wird durch Waschen entfernt. Anschließend gibt man ein Streptavidin-Peroxidase- Konjugat zu, das mit dem biotinylierten Tracer-Antikörper, der an das L-FABP gebunden hat, spezifisch reagiert. Überschüssiges Streptavidin-Peroxidase-Konjugat wird durch Waschen entfernt. Dann gibt man ein Substrat, insbesondere Tetramethylbenzi- din (TMB)₁ zu. Die Farbentwicklung ist proportional zu der in der Probe vorhandenen Menge an L-FABP. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von Zitronensäure gestoppt, und es wird die Extinktion bei 450 nm mit einem Spektrophotometer gemessen. Man erhält eine Standardkurve, indem man die Extinktionen gegen die entsprechenden Konzentrationen der bekannten Standards aufträgt. Die L-FABP- Konzentrationen der Proben mit unbekannten Konzentrationen, die parallel zu den Standards gefahren werden, können aus der Standardkurve abgelesen werden.

Neben immunologischen Verfahren können auch nicht-immunologische, meist spektroskopische Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-FABP herangezogen werden.

Da die meisten spektroskopischen Verfahren allein allerdings den spezifischen Nachweis von L-FABP an sich nicht gewährleisten, ist es in der Regel erforderlich, mittels einschlägiger Trennmethoden das im Lysat enthaltene Gesamtprotein so aufzutrennen, dass ein spezifischer Nachweis des L-FABP mittels spektroskopischer Verfahren möglich ist.

Zur Auftrennung bieten sich chromatographische und elektrophoretische Verfahren an. Zu geeigneten chromatographischen Verfahren gehört beispielsweise die Affinitätschromatographie. Zu elektrophoretischen Verfahren gehören beispielsweise die Gelelektrophorese oder die Kapillarelektrophorese, sowohl unter denaturierenden als auch nativen Bedingungen, beispielsweise Polyacrylamidgel-Elektrophoresen, isoelektrische Fokussierung und ähnliches.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens trennt man die Proteine mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese. Diese ist für die Prote- omanalyse besonders geeignet, da sie eine hohe Auflösung bietet und relativ rasch durchzuführen ist.

Bei der zweidimensionalen Gelelektrophorese führt man in einem ersten Schritt eine isoelektrische Fokussierung (1. Dimension) und in einem zweiten Schritt eine SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2. Dimension) durch. Unter Umständen arbeitet man mit gespreizten pH-Gradienten oder mit Vorfraktionierungen, um häufige und seltene Proteine möglichst weit voneinander zu separieren.

Zur Quantifizierung der Proteine in der Gel-Matrix müssen diese markiert werden. Üblich sind Färbungen mit Coomassie-Blue und die empfindlichere Silberfärbung. Noch empfindlicher sind Nachweise von radioaktiv markierten Proteinen und immunologische Markierungen, wozu auf obige Ausführungen zu den immunologischen Verfahren verwiesen werden kann.

Je nach Markierung stehen dem Fachmann verschiedene Detektionssysteme zur Quantifizierung der angefärbten Proteine zur Verfügung. Bei den zweidimensionalen Gelen geschieht dies in der Regel durch Densitometrie, beispielsweise mit einem La- serdensitometer oder einem Scanner. Auf diese Art und Weise kann die in der Probe vorhandene Menge an L-FABP sowohl absolut gesehen als auch im Vergleich zu weiteren, in der Probe vorhandenen Proteinen quantifiziert werden.

Erforderlichenfalls kann man den oder die Spots identifizieren, die L-FABP entsprechen. Beispielsweise kann man das einem Spot entsprechende, intakte Protein aus der Gelmatrix auf eine chemisch inerte Membran transferieren und dort weiter proteinchemisch analysieren. Alternativ kann man das Protein in der Gelmatrix, beispielsweise enzymatisch, in kleinere Bruchstücke zerlegen, eluieren und die Bruchstücke anschließend analysieren. Zur Analyse des intakten Proteins kann man beispielsweise eine Aminosäuresequenzanalyse durchführen oder mittels Massenspektrometrie, insbesondere IR-MALDI-Massenspektrometrie, das Molekulargewicht des Proteins bestimmen und es damit identifizieren. Zeriegt man das Protein zunächst in kleinere Bruchstücke, so kann man dies mittels üblicher Enzyme, beispielsweise Trypsin, Endoprotease LysC und Endoprotease AspN bewerkstelligen. Die Elution der resultierenden Peptidfrag- mente gelingt meist mit organischen Lösungsmitteln und Säuren aus der Gelmatrix. Zur Analyse der Peptide bietet sich ebenfalls die Massenspektrometrie an, beispielsweise die MALDI-Massenspektrometrie oder die ESI-(Nanospray)-Massenspektro- metrie, gegebenenfalls in Kombination mit einer vorgeschalteten HPLC-T rennung der Peptide.

Von den massenspektrometrischen Methoden ist des Weiteren das sogenannte SEL- Dl-Verfahren zu nennen. Hierbei werden die zu untersuchenden Proteingemische zunächst auf geeigneten Oberflächen, z.B. festen Trägeroberflächen mit Affinität für Proteine, eingefangen, unerwünschte Substanzen erforderlichenfalls von den Oberflächen entfernt, beispielsweise durch Waschen mit geeigneten Flüssigkeiten, und anschließend mittels MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of Flight) Massenspektrometrie bestimmt.

b3) Auswertung

Mit den zuvor beschriebenen Messmethoden gelingt es, jeder untersuchten Probe einen bestimmten Wert zuzuordnen, der die Expression von L-FABP kennzeichnet und insbesondere die Menge an L-FABP in der Probe entweder absolut oder im Vergleich zu einem internen oder auch extern zugesetzten Standard angibt. Erfindungsgemäß von besonderer Bedeutung ist die Feststellung, ob sich die L-FABP- Expression durch die Einwirkung der Testsubstanz oder des Testsubstanzgemisches verändert oder nicht. Dies erfordert einen Vergleich der für eine erste Dosierung und/oder eine erste Einwirkungsdauer bestimmte Expression mit der Expression des L- FABP in einer Probe aus einem entsprechenden Organismus oder einem Teil davon, der nicht mit der Testsubstanz oder dem Testsubstanzgemisch behandelt ist, und/oder auf den die Testsubstanz oder das Testsubstanzgemisch in einer zweiten, von der ersten verschiedenen Dosierung beziehungsweise in einer zweiten, von der ersten verschiedenen Dauer eingewirkt hat.

Prinzipiell kann ein solcher Vergleich vorgenommen werden, indem man die erfindungsgemäße Bestimmung des L-FABPs vor und nach Einwirkung der Substanz oder des Substanzgemisches oder nach verschiedenen Einwirkungszeiten und/oder Dosierrungen durchführt und die L-FABP-Mengen miteinander vergleicht. Unter Umständen ist es bei einem etablierten Testsystem auch möglich, auf z.B. in einer Datenbank hinterlegte Vergleichswerte zurückzugreifen, ohne das Verfahren oder die Bestimmung an sich experimentell durchführen zu müssen.

Zweckmäßigerweise kann man zur Validierung eines bestimmten Testsystems einen bestimmten Wert (Grenzwert) festlegen, ab dem definitionsgemäß eine signifikante Veränderung der Expression vorliegt.

Ein solcher Grenzwert kann von der Art der untersuchten Probe und auch von deren Gewinnung abhängen. So ist es zweckmäßig, eine bestimmtes Modellsystem zur Aus- führung des erfindungsgemäßen Verfahrens zunächst mehrfach ohne vorherige Einwirkung von Testsubstanzen oder Testsubstanzgemischen durchzuführen und einen entsprechenden Mittelwert für die L-FABP-Expression zu ermitteln. Mit Hilfe von Substanzen, die bekanntermaßen die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zu bestimmende Eigenschaft aufweisen, und den für diese Substanzen mit dem erfindungsge- mäßen Verfahren ermittelten L-FABP-Werten lassen sich dann zweckmäßige Grenzwerte für die Beurteilung von Testsubstanzen oder Testsubstanzgemischen festsetzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist vor allem auf die Beurteilung einer toxischen, insbesondere kanzerogenen und vor allem tumorpromovierenden Eigenschaft einer getesteten Substanz gerichtet. Zu den insbesondere zu beurteilenden Eigenschaften gehören solche, die rezeptorvermittelt, enzyminduzierend, cytotoxisch-mitogen, oxida- tiven Stress fördernd und/oder mitochondrial toxisch sind.

In diesem Zusammenhang ist das erfindungsgemäße Verfahren deshalb von Vorteil, weil das Einwirken der Testsubstanz bzw. des Testsubstanzgemisches vor allem unter den oben beschriebenen bevorzugten Bedingungen (in v/Vo-Einwirkung (Exposition); relativ kurze Einwirkungszeiten) dann zu einer signifikanten Abnahme der L-FABP- Expression führt, wenn die Testsubstanz bzw. das Testsubstanzgemisch toxisch, näm- lieh kanzerogen und insbesondere tumorpromovierend ist, und eine solche signifikanten Abnahme mit gängigen, wenig aufwändigen Verfahren, z.B. immunologischen Verfahren, nachgewiesen werden kann.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu den vorstehend genannten Zwecken. Damit verbunden ist insbesondere die analytische Feststellung, ob die Einwirkung einer Substanz oder eines Substanzgemisches zu einer Veränderung und insbesondere zu einer Abnahme der L-FABP-Expression führt. Ist dies der Fall, besitzt die Substanz bzw. das Substanzgemisch toxische, nämlich kanzerogene und insbesondere tumorpromovie- rende Eigenschaften.

Auch betrifft die vorliegende Erfindung Analysekits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese enthalten in der Regel i) wenigstens ein Mittel zur Bestimmung der L-FABP-Expression, insbesondere spezifische Antiköper; sowie gegebenenfalls

ii) weitere übliche Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Weitere besondere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kits ergeben sich aus den Ausführungen zum Verfahren selbst.

Figurbeschreibung

In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 ein typisches 2D-GeIbHd von Proteinen aus der Rattenleber (100 μg Gesamtprotein, pH = 4-7, 12,5 % Acrylamid, Proteine mit Silber angefärbt);

Fig. 2 Kontrastprofile zweier Proteine, IDNR = 1168 und IDNR = 1624, über 16 mit Phenobarbital behandelte Gruppen männlicher Ratten;

Fig. 3 den (A) linearen und (B) logarithmischen Scatterplot der Proteinmengen zweier unterschiedlicher Rattenlebern aus einer Zeit/Dosisgruppe (2919

Spots sind "gematcht", der Korrelationskoeffizient beträgt 0,965);

Fig. 4 die Schnittmengenhäufigkeiten der drei Assays PHEN_M, ETHI_F und HE- XA_F getrennt nach (A) RUN1 und (B) RUN2, wobei das Testkriterium das Hochberg-Benjamini adjustierte 1 %-Niveau ist;

Fig. 5 den Plot der mittleren logarithmischen Spotintensitäten des Proteins PHEN_M ID = 3368, ETHI_F_ID = 4302, HEXA_F_ID = 4425 über 16 Behandlungskontraste, wobei die Fehlerbalken die mittleren Standardfehler bezeichnen; Fig. 6 ein synthetisches Supermastergel mit den relevanten SpotJDs ETHI_F_ID 4302 und ETHI_FJD 4316, die beide für L-FABP stehen;

Fig. 7 einen Westem-Blot, bei dem L-FABP mit einem anti-L-FABP-Ratten- Antikörper und einem Chemilumineszenz-markierten Anti-Ratte-Antikörper sichtbar gemacht ist (Spur 1: Rainbowmarker 1 :1 mit SDS-Probenpuffer; Spur 2, 3: Kontrolle nach 3 Tagen; Spur 4, 5: 10 Tage mit Phenobarbital (Hochdosierung) behandelte Ratten; Spur 6, 7: Kontrolle nach 10 Tagen; Spur 8, 9: 10 Tage mit Ethinylestradiol (Hochdosierung) behandelte weibliche Ratten; Spur 10: SDS-Probenpuffer);

Fig. 8 einen Westem-Blot, bei dem L-FABP mit einem anti-L-FABP-Ratten-

Antikörper und einem Chemilumineszenz-markierten Anti-Ratte-Antikörper sichtbar gemacht ist (Spur 1: Rainbowmarker 1 :1 mit SDS-Probenpuffer; Spur 2, 3, 6, 7: Kontrolle nach 10 Tagen; Spur 4, 5, 8, 9: 10 Tage mit alpha-

Hexachlorcyclohexan (Hochdosierung) behandelte weibliche Ratten; Spur 10: SDS-Probenpuffer);

Fig. 9 einen Western-Blot, bei dem L-FABP mit einem anti-L-FABP-Ratten- Antikörper und einem Chemilumineszenz-markierten Anti-Ratte-Antikörper sichtbar gemacht ist (Spur 1: Rainbowmarker 1 :1 mit SDS-Probenpuffer; Spur 2, 4, 6, 8: Kontrolle nach 10 Tagen; Spur 3, 5: 10 Tage mit Tetrachlorkohlenstoff (Hochdosierung) behandelte weibliche Ratten; Spur 7, 9: 10 Tage mit Furan (Hochdosierung) behandelte weibliche Ratten; Spur 10: SDS- Probenpuffer);

Fig. 10 einen Western-Blot, bei dem L-FABP mit einem anti-L-FABP-Ratten-

Antikörper und einem Chemilumineszenz-markierten Anti-Ratte-Antikörper sichtbar gemacht ist (Spur 1: SDS-Probenpuffer; Spur 2, 4, 6, 8: Kontrolle nach 10 Tagen; Spur 3, 5: 10 Tage mit 2,6-Dinitrotoluol (Hochdosierung) be- handelte weibliche Ratten; Spur 7, 9: 10 Tage mit 2,4-Dinitrotoluol (Hochdosierung) behandelte weibliche Ratten Spur 10: Rainbowmarker 1 :1 mit SDS- Probenpuffer);

Fig. 11 einen Westem-Blot, bei dem L-FABP mit einem anti-L-FABP-Ratten-

Antikörper und einem Chemilumineszenz-markierten Anti-Ratte-Antikörper sichtbar gemacht ist (Spur 1 : Rainbowmarker 1 :1 mit SDS-Probenpuffer; Spur 2, 4, 6, 8: Kontrolle nach 10 Tagen; Spur 3, 5: 10 Tage mit 2,6-Diaminotoluol (Hochdosierung) behandelte weibliche Ratten; Spur 7, 9: 10 Tage mit 2,4- Diaminotoluol (Hochdosierung) behandelte weibliche Ratten Spur 10: Rainbowmarker 1:1 mit SDS-Probenpuffer);

Fig. 12 einen Westem-Blot, bei dem L-FABP mit einem anti-L-FABP-Ratten-

Antikörper und einem Chemilumineszenz-markierten Anti-Ratte-Antikörper sichtbar gemacht ist (Spur 1 : Rainbowmarker 1 :1 mit SDS-Probenpuffer; Spur

2, 4, 6, 8: Kontrolle nach 10 Tagen; Spur 3, 5: 10 Tage mit WY 14,643 (Hochdosierung) behandelte weibliche Ratten; Spur 7, 9: 10 Tage mit Cyproteron Azetat (Hochdosierung) behandelte weibliche Ratten Spur 10: SDS- Probenpuffer);

Fig. 13 einen Westem-Blot, bei dem L-FABP mit einem anti-L-FABP-Ratten-

Antikörper und einem Chemilumineszenz-markierten Anti-Ratte-Antikörper sichtbar gemacht ist (Spur 1, 7, 8, 9, 10: SDS-Probenpuffer; Spur 2: Rainbowmarker 1:1 mit SDS-Probenpuffer , Spur 3, 5: Kontrolle nach 10 Tagen; Spur 4, 6: 10 Tage mit Nafenopin (Hochdosierung) behandelte weibliche Ratten.

Ausführungsbeispiele

1. Exposition der Tiere mit den Testsubstanzen Die Tierversuche werden an der Fischer 344-Ratte durchgeführt. Dieser Rattenstamm ist ein Inzuchtstamm und lässt gegenüber anderen, in der Toxikologie gebräuchlichen Stämmen wie Wistar eine geringere Variabilität der Effekte von Tier zu Tier erwarten. Zu jeder Dosisstufe werden in jedem Versuch pro Zeitpunkt 5 Tiere (weibliche, bei der Phenobarbital-Gruppe zusätzlich gleiche Anzahl männlicher Tiere) eingesetzt. Die Exposition erfolgt für 4 bzw. 17 Stunden sowie 3 bzw. 10 Tage. Für jeden Zeitraum wird eine Kontrollgruppe von 5 Tieren mitgeführt, die entweder das Vehikel der Testsubstanzlösung (Maiskeimöl oder Aqua bidest.) oder substanzfreies Futter erhält. Zu je- dem Zeitpunkt werden eine niedrige, mittlere und eine hohe Dosis verwendet. Pro Versuch werden also 80 Tiere eingesetzt. Die Substanzgabe erfolgt für die beiden Kurzzeitwerte über die Schlundsonde mit einer einmaligen Applikation zu Anfang des Zeitfensters. Bei den 3 und 10 Tage-Expositionen erhalten die Tiere die Testsubstanz über das Futter. Eine Ausnahme bildet die Exposition mit dem stark bioakkumulierenden alpha-Hexachlorcyclohexan. Hier erhalten die Tiere bei der 3 und 10 Tage-Exposition eine Initialdosis per Schlundsonde und anschließend über das Futter eine Erhaltungsdosis von 10 % der Initialdosis. Am Ende der Expositionszeit werden die Tiere durch Kohlendioxid-Begasung betäubt und durch Dekapitieren entblutet. Die Lebern werden möglichst rasch entnommen, in Segmente aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockge- froren und bis zur Analyse tiefgekühlt aufbewahrt. Die Nieren werden als Kontrollorgane ohne weitere Unterteilung in gleicher Weise asserviert, aber im Rahmen dieses Beispiels nicht weiter untersucht.

2. Probenaufschluss der Rattenlebern

Für den Zellaufschluss wird ein tiefgefrorenes Lebersegment zunächst in flüssigem Stickstoff weiter herunter gekühlt. Danach wird es mit Hilfe eines Metallpistills zertrümmert. Es werden Aliquots von jeweils ca. 47-52 mg in 2 ml Eppendorfgefäße portioniert und bei -80 ⁰C aufbewahrt. Damit wird vermieden, dass die Leberfragmente für jeden Probenaufschluss beim Aliquotieren antauen. Zum eigentlichen Probenaufschluss werden zwei Aliquots der gleichen Probe entnommen und mit Lysepuffer (42,04 g Harnstoff, 15,22 g Thioharnstoff, 4,0 g CHAPS, 1 ,0 g DTT, 2 ml Ampholine pH 3,5 - 10, 48 mg Pefabloc SC, 48 mg EDTA, 50 μg Leupeptin, 70 μg Pepstatin, 100 μg Aprotinin; mit WFI-Wasser ad 100 ml) versetzt. Bei beiden Proben werden 50 mg Leberzellen mit 1000 μl Puffer versetzt. Zu diesem Gemisch wird unverzüglich die gleiche Menge Glasperlen (Glasbeads No. 2; Fa. Buddeberg, Bestellnummer 22.222.0002) zugesetzt, welche der Masse an jeweiliger Rattenle- bereinwaage zuzüglich Lysepuffer entspricht. Danach werden die Proben im Kühlraum bei +4 ⁰C mit der Schwingmühle (30', volle Leistung) homogenisiert. Die Probenbecher der Schwingmühle werden vor dem Einsetzen der Proben auf -20 ⁰C gekühlt.

Dem Homogenisieren in der Schwingmühle folgt eine Inkubationsphase von 60 Minuten für die proteomanalytische und von 30 Minuten für die immunologische Bestim- mung. Während der Inkubation wird durch gelegentliches Überkopfdrehen des Eppen- dorfgefäßes erneut durchmischt.

Nach Ablauf dieser Zeit werden die Proben bei 22.000 Upm für 90 Minuten bei 20 ⁰C im HFA 22.2 Rotor der Biofuge 28RS Zentrifuge, Fa. Heraeus, separiert. Anschließend werden die beiden Überstände vorsichtig abgenommen und in einem 1,5 ml Eppen- dorfgefäß zusammengeführt. Die Rückstände werden verworfen. Der Überstand wird nun nochmals für die Dauer von 60 Minuten in einem HFA 28.1 Rotor bei 28.000 Upm (45.000 xg) und 20 ⁰C zentrifugiert. Danach wird der Überstand vorsichtig in ein neues 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und abschließend in Aliquots ä 80 μl bei -80 ⁰C auf- bewahrt.

3. Proteinbestimmung

3.1. Nach Lowry 2

Damit auf jedes 2D-GeI später die gleiche Menge Protein aufgetragen werden kann, wird vor der Elektrophorese für jede einzelne Probe eine Proteinbestimmung nach Lowry durchgeführt. Zur Proteinbestimmung der Rattenleberextrakte wird das Protein Assay Kit (Protein Assay Kit, Fa. Sigma, Bestellnummer: P 5656) benutzt. Dabei wer- den vor der eigentlichen Bestimmung des Proteingehalts sämtliche Proteine durch TCA-Fällung präzipitiert. Eventuelle Störungen der Messmethode durch z.B. Harnstoff, DTT oder CHAPS werden hiermit umgangen, da diese bei der Fällung mit dem Überstand entfernt werden.

1 ,5 ml Eppendorfgefäße werden mit entsprechender Beschriftung (Proben, 5 Standards und ein Leerwert) vorbereitet. Von den Leberextrakten werden 20 μl entnommen, mit 980 μl VE-Wasser versetzt und auf dem Vortexer homogenisiert. Für die Standardreihe wird zunächst der Inhalt einer Standardflasche (BSA) des Proteinkits mit der erforderlichen Menge an VE-Wasser gelöst. Alle weiteren Lösungen werden wie im Beipackzettel zum Protein Assay Kit der Fa. Sigma beschrieben angesetzt. Danach wird die BSA-Standardreihe analog Tabelle 1 vorbereitet:

Tabelle 1 : Ansatz für die BSA-Standardreihe

Das Wasser wird vorgelegt, anschließend die entsprechende BSA-Stammlösung zugegeben. Mittels Vortexer wird gut gemischt. Als Leerwert werden in ein 1 ,5 ml Eppen- dorfgefäß 1000 μl VE -Wasser pipettiert. Zu den verschiedenen Eppendorfgefäßen (Probe, Standard und Leerwert) werden je 100 μl DOC (Desoxycholat) gegeben, homogenisiert und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden 100 μl TCA (Trichloressigsäure) zugegeben und gut durchmischt. Die Probengefäße werden 10 Minuten bei 45.000 xg zentrifugiert. Die Überstände der Zentrifugation werden vorsichtig abdekantiert und verworfen. Die Rückstände werden jeweils in 1 ml "Lowry Reagent Solution" gelöst. Diese Lösungen werden nun in bereits vorbereitete Makro-Küvetten (Makro-Küvetten, Fa. Greiner, Best.-Nr.: 61 41 01) für die spektroskopische Messung überführt. Die Eppendorfgefäße werden anschließend mit 1 ml VE-Wasser nachgespült. Die Spüllösung wird unter Rühren mit einem Rührstäbchen zu der Lowrylösung in den Küvetten gegeben. Die Probelösungen werden 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird in jede Küvette 500 μl "Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent Working Solution" gegeben. Mit dem Rührstäbchen wird gut gemischt. Nach einer weiteren Standzeit von 30 Minuten werden die Proben bei 750 nm im UV/VIS-Spektrometer gegen die Leerprobe ver- messen. Die Absorptionen der Standardproben werden in einer Eichkurve gegen die jeweilige BSA-Konzentration aufgetragen. Die Proteinkonzentration der Rattenleber- proben wird mit Hilfe dieser Eichkurve ermittelt.

3.2. Nach Popov Für die immunologische Bestimmung wurde der Proteingehalt der einzelnen Extrakte nach Popov bestimmt (N. Popov. M. Schmitt, S. Schulzeck, H. Matthies, Acta biol. med. germ. 34, S. 1441 - 1446 (1975)).

4. Proteomanalyse

4.1. Isoelektrische Fokussierung (IEF) - 1. Dimension

4.1.1. Rehydratisierung Zur Rehydratisierung der IEF-Streifen (Immobiline DryStrip pH 4-7, 24 cm, Fa. Amers- ham Pharmacia, Bestellnummer: 17-6002-46) wird frischer Rehydratisierungspuffer (8 M (14,41 g) Harnstoff, 2 M (4,57 g) Thioharnstoff, 20 mM (92,52 mg) Dithiothreitol (DTT), 1 % (300 mg) CHAPS, 156 μl IPG-Buffer pH 3-10 (Fa. Amersham Pharmacia, Best.-Nr.: 17-6000-87) ad 30 ml mit WFI-Wasser) angesetzt. Nun wird von dem Ratten- leberlysat ein 100 μg entsprechendes Volumen entnommen, in ein 1 ,5 ml Eppendorf- gefäß gegeben und durch Zugabe von Rehydratisierungspuffer auf ein Gesamtvolumen von 600 μl verdünnt. Die Lösung wird mit dem Vortexer gut durchmischt. Danach wird die Lösung als langgezogene Spur in eine der Vertiefungen des "Immobiline DryStrip Reswelling Trays" gegeben. Das Tray wird vor der Benutzung mit Hilfe der Rändelschrauben nivelliert. Vom IEF-Streifen wird nun die Schutzfolie abgezogen und der Streifen mit der Gelseite nach unten in die Vertiefung mit dem Rehydratisie- rungspuffer/Proben-Gemisch gelegt. Nachdem alle Gelstreifen eingelegt sind, wird die Kammer verschlossen und zur besseren Abdichung mit Klebeband verklebt. Die Re- hydratisierung erfolgt bei RT für die Dauer von 24 Stunden.

4.1.2. Isoelektrische Fokussierung

Nach 24 Stunden wird die Kammer geöffnet, der erste Gelstreifen entnommen und auf mit WFI-Wasser angefeuchtetem Filterpapier (Whatman-Filterpapier No. 3, Best.-Nr.: 1003-917) abgetupft. Diese Prozedur erfolgt analog für alle Streifen. Die IEF-Streifen werden mit der Gelseite nach oben in den "Immobiline DryStrip Aligner" auf der MuI- tiphor-Kammer von Pharmacia eingelegt. Zwei Elektrodenstreifen werden mit WFI- Wasser befeuchtet. Das überschüssige Wasser wird durch Abtupfen an einem Papier- tuen entfernt. Sowohl auf der Kathoden- wie auch auf der Anodenseite wird je ein E- lektrodenstreifen quer über alle Gelstreifen gelegt. Die Elektrodenstreifen werden vor dem Auflegen auf exakte Länge gebracht. Anschließend werden die Elektroden aufgesetzt, mit 80 ml Cover-Fluid (DryStrip Cover Fluid, Fa. Amersham Pharmacia, Best.- Nr.: 17-1335-01 ) überschichtet, die Anschlüsse vorgenommen und die Kammer ge- schlössen. Die isoelektrische Fokussierung wird mit den in Tabelle 2 aufgelisteten Parametern durchgeführt.

Tabelle 2: Parameter für die isoelektrische Fokussierung auf der Multiphor-Kammer

Am nächsten Morgen, nach ca. 25-30 kVh, werden die Elektrodenstreifen gewechselt. Dazu wird das Spannungsteil in den Pausemodus gesetzt und die Kammer geöffnet. Die Elektrodenbrücken werden abgenommen und die alten Elektrodenstreifen vorsichtig entfernt. Danach werden neue, mit WFI-Wasser befeuchtete Elektrodenstreifen eingesetzt. Die Elektrodenbrücken werden wieder aufgesetzt, die Kammer geschlossen und das Spannungsteil wieder in den RUN-Modus versetzt. Nach Beendigung des Laufes wird das Spannungsteil ausgeschaltet, die Kammer geöffnet und die Elektroden- brücken, sowie die Elektrodenstreifen, vorsichtig abgenommen. Anschließend werden die Gelstreifen auf mit WFI-Wasser angefeuchtetem Filterpapier abgetupft, um die anhängende Cover-Fluid zu entfernen. Nachfolgend werden die Gelstreifen, falls nicht direkt für die zweite Dimension genutzt, in einer DIN-A-4-Prospekthülle angetackert und bei -80 ⁰C aufbewahrt.

4.2. SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE) - 2. Dimension

4.2.1. Vorbereitung der Ettan DALT-II Kammer

Zunächst wird die Laufkammer mit 7,5 I WFI-Wasser befüllt und das Steuergerät der Kammer eingeschaltet. Die Umwälzpumpe wird aktiviert und das Anodenpufferkon- zentrat (75 ml) eingefüllt. Anschließend werden die SDS-GeIe (Ettan DALT Il Gel (12,5 %): Fa. Amersham Pharmacia, Best.Nr.: 17-6002-36, Ettan DALT Il Buffer Kit, Fa. A- mersham Pharmacia, Best.-Nr.: 17-6002-50) mit 2 ml Gelpuffer in die Gelrahmen eingelegt (Gelseite zur Glasplatte) und der überschüssige Gelpuffer mittels eines handelsüblichen Tapetenrollers ausgewalzt. Nach dem Schließen des Rahmens werden durch Schrägstellen desselben Reste überschüssigen Puffers entfernt. Danach werden mit bei 85 ⁰C aufgeschmolzener Agarose die Kanäle am linken und rechten Rand der Gele verschlossen. Nachfolgend werden die Rahmen am unteren Ende mit WFI- Wasser benetzt und in die Ettan DALT-Kammer eingesetzt. Die Gele werden nun mit dem 1 :10 verdünnten Kathoden pufferkonzentat bis zur Füllmarke überschichtet.

4.2.2. Equilibrierung der Gelstreifen

Die Streifen werden mit der Gelseite nach oben in das Equilibrierungstray gelegt und im ersten Schritt mit jeweils 4 ml DTT-Eq uilibrierungspuffer (4 ml Equilibrierungs- Stammpuffer (6 M (36 g) Harnstoff, 30 % (30 g) Glycerin, 2 % (2 g) SDS, 3,3 ml Tris- HCI-Puffer pH 8,8 (1 ,5 M (18,2 g) Tris/HCI, 0,4 % (0,4 g) SDS, pH 8,8 ad 100 ml mit WFI-Wasser), ad 100 ml mit WFI-Wasser) + 20 μl Bromphenolblaulösung (30 mg Bromphenolblau in 10 ml Tris/HCI-Puffer pH 8,8) + 200 μl DTT + 1 ml WFI-Wasser)) versetzt. Das Tray wird nachfolgend 15 Minuten auf einem Laborschüttler horizontal bewegt. Anschließend wird der Puffer vorsichtig abdekantiert. Danach wird nochmals für 15 Minuten mit 4 ml Jodacetamid-Equilibrierungspuffer (4 ml Equilibrierungs- Stammpuffer + 20 μl Bromphenolblaulösung (vgl. Equilibrierungspuffer) + 260 mM (192 mg Jodacetamid)) horizontal geschüttelt. Der Puffer wird vorsichtig abgeschüttet. Die nun equilibrierten Gelstreifen werden auf einem WFI-Wasser-angefeuchteten Filterpa- pier vom überschüssigen Equilibrierungspuffer befreit.

4.2.3. Elektrophoreselauf

Die equilibrierten Gelstreifen werden dann vorsichtig mit der Trägerfolienseite zur Glasplatte hin orientiert in den Spalt zwischen der Glasplatte des Gelrahmens und der Trägerfolie des DALT- Gels gegeben und im Puffer abgesenkt. Mit Hilfe des "thin fluo- rescent rulers" werden die Gelstreifen positioniert und leicht auf das DALT-GeI angedrückt. Dabei werden auch eventuelle Luftblasen beseitigt. Danach wird die Kammer geschlossen und der Lauf mit den Parametern aus Tabelle 3 gestartet.

Tabelle 3

Nachdem der Lauf beendet ist, d.h. die Bromphenolblaufront den unteren Rand des Gels erreicht hat, wird die Spannung abgeschaltet und die Kammer geöffnet. Die Gele werden aus den Gelrahmen ausgebaut und für mindestens zwei Stunden, meist jedoch über Nacht, mit Fixierlösung (50 % VE-Wasser, 40 % Methanol und 10 % Eisessig) geschüttelt.

4.3. Silberfärbung der Gele

Die Silberfärbung der Gele erfolgte in Anlehnung an die einzelnen in Tabelle 4 aufgelisteten Teilschritte.

4.3.1. Färbeautomat

Zur Beschleunigung der Färbung und zur Steigerung der Reproduzierbarkeit wurde das in Tabelle 4 beschriebene Protokoll im Färbeautomaten durchgeführt. Tabelle 4: Silberfärbung der Proteine nach der 2D-PAGE

Figur 1 zeigt ein typisches silbergefärbtes 2D-GeI der Rattenlebern im analysierten pH- Bereich von 4 bis 7.

4.4. Auswertung der 2D-GeIe: Spot-Detektion, Quantifizierung, "Matching", Mastergele

Nach dem Digitalisieren der Gele mit einem 12 bit Graustufen-Scanner (Agfa Arcus II, 300 Lines per inch) werden diese einer Bildauswertung unterzogen. Eingesetzt wurde dafür das Melanie 3 Software-Paket der Firma Genebio. Zunächst werden alle Spots automatisch detektiert. Bei durchschnittlich über 3000 Proteinen pro Gel ist in den Be- reichen hoher Proteinkonzentration ein aufwändiges Nacheditieren von Hand erforderlich. Die Quantifizierung der Spots erfolgt nach der Detektion automatisch.

Anschließend werden die Gele miteinander zur Deckung gebracht ("Matching"). Dabei wird ein synthetisches Mastergel erzeugt, welches alle im Experiment detektierten Proteine beinhaltet und für jedes Protein eine gemeinsame Identifikationsnummer (Master- ID) erzeugt. Auch hier leisten alle kommerziellen Software-Pakete nur unvollkommene Arbeit: Auf Grund der in den Gelen vorkommenden Verzerrungen muss das "Matching" von Hand überprüft und im Bedarfsfall verbessert werden.

Im ersten Versuch (Phenobarbital, weibliche Tiere) wird mit Melanie 3 in jedem Zeit- Dosisbereich ein Sub-Mastergel erstellt. Aus allen Sub-Mastergelen wird dann ein Mastergel generiert. Dabei zeigt sich aber, dass die Anzahl der Fehl"matches" zu hoch wird. Die Anzahl der Fehl"matches" entspricht der Anzahl der Singulärresponder, wor- unter Proteine verstanden werden, die in nur einer Behandlungsgruppe gefunden werden. Aus statistischer Sicht sind solche Behandlungskontraste außerordentlich ungünstig, da diese den Versuchsfehler erheblich unterschätzen. Deshalb wurde dieser Versuch zunächst nicht mit in die Auswertung einbezogen.

Bei der Auswertung der nächsten Gruppen (Phenobarbital, männliche Tiere; alpha- Hexachlorcyclohexan, weibliche Tiere; Ethinylestradiol, weibliche Tiere) wird ein anderes Vorgehen gewählt: aus je zwei Gelen aus dem mittleren Zeit/Dosisbereich wird für jede Substanz ein Mastergel erstellt. Auf dieses Mastergel wird dann jedes einzelne Gel der Gruppe "gematched". Zusätzlich auftauchende Spots werden addiert.

Zur Generierung eines "Supermastergels" werden alle Mastergele auf das Mastergel für Ethinylestradiol "gematched". Eine abschließende Tabelle ordnet die einzelnen MasterlDs den entsprechenden Supermaster-IDs zu.

4.5. Statistik Ziel der statistischen Datenanalyse ist eine konsistente Bewertung der Behandlungskontraste. Dazu ist es zunächst erforderlich, das zugrunde liegende Datendesign einer näheren Betrachtung zu unterziehen. Jedem der drei Assays PHEN_M, ETHI_F, HE- XA_F (kurz für die Assays Phenobarbital/männlich, Ethinylestradiol/weiblich bzw. al- pha-Hexachlorcyclohexan/weiblich) liegen zwei 4^*2-vollfaktorielle Versuchsdesigns in den Faktoren DOSE (D) und TIME (T) zugrunde. Ein i^*j-faktorielles Design bezeichnet in dieser Notation ein Versuchsdesign, bei dem der erste Faktor auf i- und der zweite Faktor auf j-Stufen variiert wurde. Alternativ kann ein i^*j-faktorielles Versuchsdesign als eine zweidimensionale Datenmatrix aufgefasst werden mit der ersten Dimension auf i- und der zweiten Dimension auf j-Stufen (vergleiche z.B. Tabelle 5). Jeder der beiden Faktoren DOSE und TIME wird auf vier

T₂J variiert, wobei die Zeitstufen für alle drei Assays konsistent "4h", "17h", "3d" und "10d" betragen, während die Dosierungsregimes zwischen den drei Assays unterschiedlich sind. In Tabelle 5 ist das Behandlungsregime der drei Assays zusammengefasst.

Tabelle 5: Übersicht der Behandlungsregime der drei Assays PHEN_M, ETHI_F, HE- XA F

^* ppm: parts per millioπ im Futter: Umrechnung: 0,1 ^* ppm = mg/kg Körpergewicht

Die beiden Designs können als 4x2 Hochdosis/Kurzzeit- und 4x2 Niedrigdosis/Langzeitdesigns aufgefasst werden, und es ist statistisch und biologisch sinnvoll, diese beiden Teildesigns - im Folgenden RUN1 und RUN2 genannt - getrennt zu bewerten. 3

Insgesamt liegen in jedem Assay somit 16 Behandlungsgruppen und in jeder Behandlungsgruppe 5 unabhängige Wiederholungen vor, d.h. jeder Assay wird durch 80 Gele repräsentiert. Bedingt durch "missing values" liegen bei allen drei Assays allerdings weniger als 80 Gele vor. Jedes dieser Gele beinhaltet k-verschiedene Proteine, die zu i-verschiedenen Zeiten und j-verschiedenen Dosierungen in der l-ten Wiederholung bestimmt wurden, d.h. die Daten bestehen aus den indizierten integralen Spotintensitäten Y_hjl .

In der exploratorischen Vorbetrachtung der Spotintensitäten Y_kl]l zeigt sich, dass die mittleren Spotintensitäten der Kontrollgruppen mit D=O inhomogen sind, weshalb alle 80 Gele eines Assays vor der weiteren Prozessierung auf einen gemeinsamen Mittelwert zentriert werden gemäß

Y ¹ IcIjI - ~ Y ^l kιß — Y ¹ » ιß ' worin Y, _tjl die mittlere Spotintensität der 80 einzelnen Gele bezeichnet. Durch diese Zentrierung werden auf natürliche Weise Über- bzw. Unterfärbeeffekte zwischen den Gelen eliminiert, ohne dabei die Effektstruktur wesentlich zu beeinflussen.

Die so vorprozessierten Daten werden entsprechend der zugrunde liegenden Datenstruktur mit varianzanalytischen Methoden (ANOVA für ANalysis OF VAriance) weiter untersucht, um damit die Behandlungskontraste proteinweise hinsichtlich Signifikanz zu bewerten.

Dazu wird die Response F ₍ varianzanalytisch zerlegt gemäß

Darin bezeichnet ju_k den Globalmittelwert des k-ten Proteins über alle Behandlungen, a_h und ß^ den Beitrag der i-ten Dosisstufe und γ_klJ den synergistischen Beitrag zur Response / _; . Der Term ε_kljl bezeichnet den Fehler, der als normal verteilt mit konstanter Varianz σ_k angenommen wird, d.h. ε_kljl » N(O, σ_k ) .

Erste varianzanalytische Voruntersuchungen der Daten zeigen jedoch, dass einfache AΝOVA-Verfahren für die vorliegenden Daten wenig geeignet sind. Um diese Schwie- rigkeiten zu veranschaulichen, sind in Figur 2 stellvertretend die Intensitätskontraste zweier Proteine geplottet. Aufgetragen ist die logarithmierte, integrale Spotintensität der Proteine IDNR=1168 und IDNR=1624 über alle 16 Behandlungsgruppen zusammen mit den Standard Errors ofMean als Fehlerbalken und Maß der Versuchsvarianz.

In Figur 2 sind eine Rehe von Nullrespondern zu erkennen, die in der ANOVA zu einer extremen Aufblähung der Fehiervarianz führen und dadurch Behandlungseffekte verdecken. Diese Nullresponder werden als Artefakte des "Matching"prozesses aufge- fasst, d.h. es handelt sich dabei um Proteinspots, die in einzelnen Gelen - wahrschein- lieh bedingt durch Verzerrungseffekte - fehl"gematched" wurden.

Um eine sinnvolle Bewertung der Daten in Gegenwart extremer "Ausreißer" zu ermöglichen, ist es somit notwendig, die Annahme der Normalverteilung fallen zu lassen und auf die Klasse der verteilungsfreien oder nichtparametrischen Methoden zurückzugrei- fen. Dem kommt entgegen, dass in den letzten Jahren große Fortschritte zur verteilungsfreien Analyse faktorieller Designs gemacht wurden. In voüfaktoriellen Versuchsplänen mit k-Faktoren auf nk-Stufen werden alle kombinatorisch möglichen Faktorstufenkombinationen, d.h. (n_k)^k-Kombinationen, realisiert. Diese Pläne erlauben die Identifizierung von polynomialen Effekten bis zur (n_k-1 )-Ordnung und erlauben es insbeson- dere, Wechselwirkungen (Synergien) zu identifizieren (siehe z.B. Brunner, E.; Puri,

M. L. Nonparametric methods in design and analysis of experiments, Handbook of Sta- tistics 13 (1996) 631-703). Der Kern der Methode besteht darin, die ursprüngliche Skala Y proteinweise (k-weise) über die Behandlungen und Wiederholungen auf Ränge zu transformieren, d.h. ⁷*„, ROß) ^{> R}y,ß wobei R(ijl) die Rangbildung über die Klassen i.j.l indiziert.

Das nichtparametrische ANOVA-Problem lässt sich nun analog schreiben

wobei die Varianzen nun inhomogen über die Klassen k,i,j sind, d.h. ε_kljl « N(0, σ_k ² _ιJ ) . Die freien Parameter des gemischten Modells, (Gl. 2.0), können mittels Maximum-

Likelihood Methoden bestimmt werden und erlauben es, die Nullhypothese HO:

( a_ki = 0 , ßi_g = 0 , γ_klJ = 0 ) gegen die Alternativhypothese H 1 : ( a_kι ≠ 0 oder ß_kj ≠ 0 oder γ_ku ≠ 0 ) zu testen.

Abhängig von der jeweiligen Anzahl von Proteinspots führt die geschilderte Methode zu einer sehr großen Anzahl individueller Tests, wovon jeder dieser Tests auf dem 1%- Signifikanzniveau a bewertet wurde. Um den Fehler 1. Art α des Gesamtassays zu kontrollieren, ist es notwendig, diese individuellen Signifikanzniveaus zu adjustieren.

Hierzu wird die False-Discovery-Rate-Methode von Hochberg-Benjamini (Benjamini, Y. and Hochberg, Y, Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Ap- proach to Multiple Testing. Journal ofthe Royal Statistical Society B, 57 (1995) 289- 300) verwendet und den drei Assays ein adjustiertes Testniveau von 1 % zugrunde gelegt.

4.6. Proteinidentifikation

Die interessierenden Proteine werden je dreimal aus unabhängigen Coomassie- gefärbten präparativen 2D-Gelen identifiziert. Verwendet werden dafür die Lebern zweier weiblicher und einer männlichen Ratte. Die entsprechenden Protein-Spots werden ausgestanzt und mit Hilfe von Trypsin enzymatisch im Gel gespalten. Die resultierenden Peptide werden dann mit Hilfe der Nano-LC-MS/MS analysiert.

5. Immunologische Bestimmung mittels Western-Blotting

Die Rattenleberextrakte wurden zur besseren Pipettierbarkeit zunächst 1 :10 mit SDS- Probenpuffer versetzt, mit dem Vortexer homogenisiert und 10 Minuten bei 95 Grad Celsius gekocht. Danach erfolgte mit SDS-Probenpuffer eine erneute Verdünnung auf eine Protein-Endkonzentration von 0,5 μg/μl. 4-12%ige Novex Bis/Tris-Gele wurden mit jeweils 20 μl (Probe, Kontrolle, Marker oder Puffer) pro Spur gefahren (Gel- Laufbedingungen: MOPS-Puffer; 1=100 mA, P=50 W, t ca. 90 Min) und geblottet (Blot- Bedingungen: 0,2 μm PVDF-Membran, Fa. Invitrogen; U=200 V, 1=102 mA, t=75 Min.)

Die Detektion erfolgte analog der Vorschrift des BM Chemiluminescence Western Blot- ting Kits (Mouse/Rabbit) der Fa. Roche Diagnostics. Der anti-FABP-Antikörper (Fa. abcam Ltd., Best.-Nr.: ab7847-500, rat-liver from rabbit, polyclonal) wurde 1 :500, der anti-Ratte-Kaπiπchenantikörper auf 40 mU/ml verdünnt.

Weiterhin wurde zur Verstärkung des Signals das "ECL plus Western Blotting Detecti- on" System der Fa. Amersham Biosciences eingesetzt. Die Chemolumineszenz wurde mit Hilfe einer photonenzählenden Kamera gemessen. Die Integrationsdauer betrug 2,5 bzw. 5 Minuten.

6. Ergebnisse

6.1. Proteomanalyse

Von den mit insgesamt zwölf nicht-gentoxischen, tumorpromovierenden Substanzen exponierten Gruppen weiblicher (12) und männlicher Ratten (1) werden vier Gruppen proteomanalytisch untersucht, nämlich die weiblichen mit Ethinylestradiol, alpha- Hexachlorcyclohexan und Phenobarbital behandelten Tiere sowie die ebenfalls mit Phenobarbital behandelten männlichen Tiere.

Die Reproduzierbarkeit der 2D-Elektrophorese wird mit Hilfe eines Scatterplots über- prüft. Dabei werden für jedes zugeordnete ("gematchte") Protein aus zwei Gelen die mit Melanie 3 ermittelten Proteinmengen gegeneinander aufgetragen. Figur 3 zeigt beispielhaft einen solchen Scatterplot. Bei je zwei Gelen (entspricht zwei unterschiedlichen Tieren) aus einer Zeit/Dosisgruppe ist die Korrelation der integralen Proteinmengen in der Regel größer als 96 %. Die verbleibende Differenz repräsentiert die Summe aus Gel-zu-Gel-Variationen und inter-individuellen Unterschieden. Diese hohe Reproduzierbarkeit ermöglicht es, mit nur einem einzigen Gel pro Leber zu arbeiten. Auf das Poolen mehrerer Lebern aus einer Zeit/Dosis-Gruppe wird verzichtet, da dabei wichtige statistische Informationen über die Intersubjektvarianz verloren gingen. Das Poolen hätte allerdings den Vorteil einer wesentlich geringeren Anzahl an 2D-Gelen.

Im Anschluss an die Bildauswertung mit Spotdetektion, Integration und "Matching" wird für jede Substanzgruppe mit der Melanie 3 ein synthetisches Mastergel erzeugt. Die zunächst eingesetzte "Matching "-Methode (Phenobarbital, weibliche Tiere) ist nur bedingt verwendbar, da der resultierende Fehler zu groß ist. Jeder Fehl"match" erzeugt einen zusätzlichen Spot im Gel. Statt der pro Einzelgel vorhandenen ca. 3000 Spots zeigt das Mastergel 9317 Spots.

Mit der einfacheren und weniger aufwendigen zweiten "Matching"-Variante resultieren für die drei verbliebenen Gruppen Mastergele, die bei Phenobarbital (männliche Tiere) 3306 Proteine, bei den weiblichen Tieren bei alpha-Hexachlorcyclohexan 4277 und bei Ethinylestradiol 4161 Proteinspots zeigen (siehe Tabelle 6). Als Grundlage für das Su- permastergel wird das in Figur 7 gezeigte synthetische Ethinylestradiol-Mastergel verwendet.

Aus den drei Mastergelen werden dann Textfiles erzeugt, welche in der ersten Spalte die Master-Protein-ID, in den restlichen 80 Spalten die numerischen Integrale der ein- zelnen Proteinmengen für jedes Gel aus der Gruppe enthalten. Eine zusätzliche Tabelle ordnet die einzelnen MasterlDs den entsprechenden SupermasterlDs eindeutig zu.

Die drei Datensätze wurden mit den unter Ziffer 8 geschilderten Verfahren vorprozessiert und die Behandlungskontraste hinsichtlich statistischer Signifikanz bewertet. Ta- belle 6 gibt einen Überblick über die den drei Assays zugrunde liegende Proteinanzahl und die in den statistischen Tests gefundene Anzahl signifikanter Kontraste. Dabei wurden die Daten getrennt nach Kurzzeit/Hochdosis- (RUN1 ) und Langzeit/Niedrigdosis- (RUN2) Behandlungsregime verwertet. Aus dem Vergleich von RUN1 mit RUN2 in Tabelle 6 ist unmittelbar zu entnehmen, dass das Behandlungsregime 2 - niedrige Dosierung über längere Zeiträume - ein höheres Effekt/Rauschverhältnis aufweist und damit auch biologisch gesehen effektiver ist. Dies ist nicht ganz unerwartet, da unter diesen Bedingungen variable Anfluteffekte (u.a. bedingt durch eine initiale hohe "Bolus"-Gabe) durch eine zeitlich stärker verteilte Aufnahme ersetzt werden und damit Spitzeneffekte mit Übergängen in einen akut toxischen Bereich vermieden werden.

Tabelle 6: Gesamtzahl und Zahl der signifikant bewerteten Behandlungskontraste auf dem Hochber -Ben amini ad ustierten 1-%-Si nifikanzniveau

In Figur 4 sind die Schnittmengenhäufigkeiteπ der drei Assays graphisch veranschaulicht. Danach sind alle Schnittmengen in RUN1 leer, d.h. keines der in einem Assay signifikant bewerteten Proteine wird in den komplementären Assays gefunden und vice versa.

Dagegen ergeben sich in RUN2 nichtleere Schnittmengen, sowohl im binären als auch ternären Schnitt, wobei insbesondere der Temärschnitt Beachtung verdient. Die weitere Untersuchung zeigt nämlich, dass das in diesem Schnitt identifizierte Protein, näm- lieh L-FABP (PHEN_M_ID=3368, ETHI_F_ID=4302, HEXA_F_ID=4425) unter Behand- lungseinfluss nach 10d verschwindet, wobei dieser Effekt konsistent in allen drei Assays beobachtet wird. Figur 5 ist ein Plot der mittleren Behandlungskontraste der drei Assays über alle 16 Behandlungen und demonstriert die Proteinsuppression über mehrere Zehnerpotenzen eindrucksvoll.

Das Protein L-FABP (ETHI_F=4302) weist die mit Abstand größte Korrespondenz der Behandlungseinflüsse auf, wie die paarweisen Korrelationskoeffizienten der Assays zeigen. Bei diesem Protein stimmen die mittleren Behandlungseinflüsse der Assays PHEN_M und HEXA_F praktisch überein, während die Paare PHEN_M, ETHI_F und HEXA_F, ETHI_F geringer, jedoch signifikant positiv korrelieren.

Die L-FABP-Proteine ETHI_F_ID 4302 und ETHI_F_ID 4316 werden in drei unterschiedlichen präparativen 2D-Gelen identifiziert. Verwendet werden dafür die Lebern zweier weiblicher und einer männlichen Ratte. Die Protein-Spots werden ausgestanzt, mit Trypsin enzymatisch im Gel gespalten und mit der Nano-LC-MS/MS analysiert.

Alle sechs Proteine wurden anhand ihrer Peptidmassen und internen "sequence-tags" als Fettsäurebindeprotein aus der Rattenleber (L-FABP, SWISS-Prot-ID P02692) identifiziert.

6.2. Western-Blot

Die proteomanalytischen Ergebnisse für die Substanzen Phenobarbital, Ethinylestradiol und alpha-Hexachlorcyclohexan konnten mittels Western-Blotting bestätigt werden (Fig. 7 und 8).

Bei den folgenden Verbindungen wurde mittels Western-Blotting ebenfalls eine Abnahme des L-FABP detektiert: Tetrachlorkohlenstoff, Furan, 2,6-Dinitrotoluol und Cyproteron Azetat (Fig. 9, 10 und 12).

Keine Veränderung des L-FABP-Spiegels hingegen resultierte in der höchsten gewähl- ten Dosierung bei 2,4-Dinitrotoluol, 2,6-Diaminotoluol, 2,4-Diaminotoluol, und bei den beiden Peroxisomenproliferatoren WY 14,643 und Nafenopin eine tendenzielle leichte Erhöhung (Fig. 10, 11, 12 und 13).

7. Diskussion

Die statistische Auswertung zeigt, dass L-FABP (ETHI_F_ID 4302) bei allen untersuchten Ratten, die mit dem synthetischen Östrogen Ethinylestradiol und den beiden Enzyminduktoren Phenobarbital und alpha-Hexachlorcyclohexan behandelt werden, mit längerer Expositionsdauer und höherer Dosierung in der Leber signifikant niedriger exprimiert wird als in den Kontrollen. In unmittelbarer Nachbarschaft zu ETHI_F_ID 4302 befindet sich der Proteinspot ETHI_F_ID 4316, der in der graphischen Exploration ein zu ETHI_F_ID 4392 analoges Profil der Behandlungseffekte aufweist, d.h. nach 10 Tagen unter Behandlungseinfluss verschwindet. Das Protein ETHI_F_ID 4302 unterscheidet sich von ETHI_F_ID 4316 nicht in der Sequenz, erscheint im 2D-GeI bei gleichem isoelektrischen Punkt und bei höherer Masse. Das lässt auf eine eventuelle posttranslationale Modifikation schließen, die keinen Einfluss auf den pH-Wert hat. Der Unterschied zwischen beiden Proteinen könnte in einer unterschiedlichen N- Glykosylierung am Asparagin (N) im Hexapeptid MEGDNK liegen, welches vermutlich deshalb nach tryptischer Spaltung des Proteins in den "Peptid-maps" der Mas- senspektrometrie kein einziges Mal detektiert werden konnte.

Interessant ist, dass die Expression von ETHI_F_ID 4302 hochsignifikant um mehrere Größenordnungen dosisabhängig bei allen drei Substanzexpositionen gegenüber den Kontrollen herabgesetzt war. Wichtig ist dabei die Beobachtung, dass die verwendeten Prüfsubstanzen unterschiedlichen mechanistischen Wirkungsklassen angehören, nämlich der Familie der Enzyminduktoren und der Östrogen wirkenden Substanzen. Damit erfüllt L-FABP mehrere wesentliche Merkmale für einen signifikant tumorpromotion- assoziierten Marker:

Erweiterte Substanzklassen-Korrelation (Enzyminduktion und Östrogene Wirkung)

Geschlechtsübergreifeπd: Detektion bei männlichen (Phenobarbital) und weiblichen Tieren (Ethinylestradiol und alpha-Hexachlorcyclohexan (zusätzliche Sub- stanzen bei weiblichen Tieren im Westemblot).

Weiterhin handelt es sich um einen frühen Marker, dessen Mengenveränderung in der Leber schon nach wenigen Stunden Substanzexposition bei den männlichen Phenobarbital behandelten und den weiblichen alpha- Hexachlorcyclohexan behandelten Tieren zu sehen ist.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Testen von Substanzen oder Substanzgemischen, wobei man a) die Substanz oder das Substanzgemisch auf einen Organismus oder einen Teil davon einwirken lässt; und b) die Expression wenigstens eines Leber-Fettsäurebindeproteins (L-FABP) in wenigstens einer von dem Organismus oder dem Teil stammenden Probe bestimmt, wobei die Einwirkungsdauer mehr als 48 Stunden beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Einwirkungsdauer 60 Stunden oder mehr beträgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Einwirkungsdauer bis zu 10 Tage beträgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Einwirkungsdauer bis zu 5 Tage beträgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Einwirkungsdauer bis zu 72 Stunden beträgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bestimmung vor und nach Einwirkung der Substanz oder des Substanz- gemisches durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die vor und nach Einwirkung der Substanz oder des Substanzgemisches bestimmte L-FABP- Expression miteinander vergleicht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine durch die Einwirkung der Substanz oder des Substanzgemisches bewirkte Veränderung der L-FABP-Expression für eine toxische Eigenschaft der Substanz oder des Substanzgemisches steht.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung eine Abnahme der L-FABP-Expression ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bestimmung für wenigstens zwei verschiedene Einwirkungszeiten durchführt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei man a1 ) die Substanz oder das Substanzgemisch auf einen ersten Organismus oder einen Teil davon einwirken lässt; b1) die Expression wenigstens eines Leber-Fettsäurebindeproteins (L-FABP) in wenigstens einer von dem ersten Organismus oder dem Teil stammenden Probe bestimmt; a2) die Substanz oder das Substanzgemisch auf einen zweiten Organismus oder einen Teil davon einwirken lässt; und b2) die Expression des Leber-Fettsäurebindeproteins (L-FABP) in wenigstens einer von dem zweiten Organismus oder dem Teil stammenden Probe bestimmt, wobei die Einwirkungszeit auf den ersten Organismus oder den Teil davon verschieden ist von der Einwirkungsdauer auf den zweiten Organismus o- der den Teil davon.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei man a) die Substanz oder das Substanzgemisch auf einen Organismus oder einen Teil davon einwirken lässt; und b) die Expression wenigstens eines Leber-Fettsäurebindeproteins- (L-FABP) in wenigstens einer ersten und wenigstens einer zweiten von dem Organismus oder dem Teil stammenden Probe bestimmt, wobei die erste Probe dem Organismus oder dem Teil davon nach einer ersten Einwirkungsdauer und die zweite Probe dem Organismus oder dem

Teil davon nach einer zweiten Einwirkungsdauer entnommen ist und die erste Einwirkungsdauer von der zweiten Einwirkungsdauer verschieden ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung proteinanalytisch durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinanalytische Bestimmung ein immunologisches Verfahren ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinanalytische Bestimmung ein spektroskopisches Verfahren ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus eine Ratte ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Teil des Organismus eine Leber oder ein Teil davon ist.

18. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Identifizie- rung toxischer Eigenschaften einer Substanz oder eines Substanzgemisches.

19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die toxische Eigenschaft eine tumorpromovierende Eigenschaft ist.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die tumorpromovierende Eigenschaft rezeptorvermittelt, enzyminduzierend, cytotoxisch-mitogen, oxidativen Stress fördernd und/oder mitochondrial toxisch ist.