DE69835741T2

DE69835741T2 - Inhibitoren der wechselwirkung zwischen nukleäre protein und nukleären rezeptoren

Info

Publication number: DE69835741T2
Application number: DE69835741T
Authority: DE
Inventors: Michael David HEERY; George Malcolm PARKER
Original assignee: Imperial Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Horizons Ltd
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2018-04-29
Also published as: PT980526E; WO1998049561A1; ES2271993T3; EP0980526A1; CY1105809T1; AU7220798A; GB9708676D0; DK0980526T3; DE69835741D1; ATE338276T1; JP2002512690A; JP2007304102A; EP0980526B1; JP4206420B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Hemmung der Wechselwirkung zwischen nukleären Proteinen und nukleären Rezeptoren durch die Identifizierung der entscheidenden Strukturelemente, die für die Wechselwirkung verantwortlich sind.
Die Bindung von lipophilen Hormonen, Retinoiden und Vitaminen an Mitglieder der Superfamilie der nukleären Rezeptoren (NR) (um "an einen Liganden gebundene" Rezeptoren zu binden) verändert ihre DNA-Bindungs- und Transkriptionseigenschaften, was die Aktivierung oder Repression von Zielgenen ergibt^1,2. Ligandbindung induziert Konformationsänderungen in NRs und fördert ihre Verknüpfung mit einer vielförmigen Gruppe von nukleären Proteinen, einschließlich SRC-1/p160^3.4.5, TIF2^6.7 und CBP/p300^4.5.8.9, die als Coaktivatoren wirken, und RIP-140¹⁰, TIF1¹¹ und TRIP1/SUG1^12.13 deren Funktionen unklar sind.
Man denkt, dass die Rekrutierung von nukleären Proteinen (Coaktivatoren und/oder anderen so genannten Brückenproteine) durch NRs wesentlich für ihre Funktion als Ligand-induzierte Transkriptionsfaktoren ist. Strukturelle Studien der Liganden-Bindungsdomänen (LBDs) von drei unterschiedlichen nukleären Hormonrezeptoren des Retinoid-X-Rezeptors α (RXRα)¹⁵ des Retinsäure-Rezeptors γ (RARγ)¹⁶ und des Schilddrüsenhormon-Rezeptors β (TRβ)¹⁷, haben zu dem Vorschlag geführt, dass eine Bindung von Ligand eine Neuausrichtung einer konservierten, amphipathischen α-Helix, Helix 12 (H12), ergibt was eine neue Oberfläche erzeugt, die für die Bindung des Coaktivators und nachfolgend für Aktivatorfunktion 2 (AF2)-abhängige Transaktivierung erforderlich ist. Damit übereinstimmend stören Mutationen von konservierten, hydrophoben Resten in H12, welche AF2^14.18-20 beeinträchtigen, auch die Fähigkeit von NRs, Ccoaktivatoren zu binden ^4.6.10.13. Weniger ist über die Coaktivator-Sequenzen, welche die Wechselwirkung mit NRs vermitteln, bekannt obwohl einige Proteine mehrfache NR-Bindestellen ^5.8.21 zu enthalten scheinen. Le Douarin et al (1996) in EMBO Journal, 15, 6701-6715) identifizierte einen Leucin-reiche Bereich in drei Coaktivatoren (TIF1, RIP140 & TRIP3), welche sie die "NR Box" nannten; siehe 3D darin. Der gegenwärtige Stand des Wissens schweigt sich jedoch vollständig darüber aus, wie genau mit einem Liganden versehene, nukleäre Rezeptoren mit nukleären Proteinen als eine Klasse wechselwirken, um ihre DNA-Bindungs- und Transkriptonseigenschaften zu modifizieren, welche die Aktivierung oder Repression von Zielgenen ergeben. In der Tat stellte ein Kommentator auf diesem Gebiet nach dem ersten Anmeldedatum der vorliegenden Erfindung fest, dass "eine Charakterisierung des Mechanismus, durch den nukleäre Faktoren den Transkriptionsapparat als Antwort auf hormonelle Stimulation in Anspruch nehmen, schien manchmal eine unüberwindbare Aufgabe zu sein " (Marc Montminy in Nature, 12. Juni, 1997, 387, 654-655. siehe den 1. Absatz davon). Die WO 98/11907 betrifft eine auf einem nukleären Rezeptor gefundene Lokalisationssequenz. Die WO 97/45737 betrifft einen nukleären Hormonrezeptor mit einem unbekannten Liganden. Die WO 98/02455, die unter Art. 54 (3) EPC fällt, betrifft den nukleären Protein-Brückenfaktor TIF-2 und den Nachweis von Agonisten und Antagonisten dafür. Sie offenbart ein TIF-2 Fragment, das die Reste 624-1131 aufweist, welches zufällig 4 Kennmotive aufweist; dieses Fragment ist vom Schutzbereich ausgenommen. Das in der WO 98/02455 erwähnte LXXLL Motiv war in ihrem Prioritätsdokument nicht vorhanden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass ein kurzes Kennmotiv, das in den nukleären Proteinen vorhanden ist, notwendig und ausreichend ist, um deren Bindung an mit einem Liganden versehene NRs zu vermitteln.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitorverbindungen, die zur Verringerung der Wechselwirkung zwischen:

a) einem ersten Bereich, bei dem es sich um ein Kennmotiv auf einem nukleären Protein handelt, und
b) einem zweiten Bereich, bei dem es sich um denjenigen Teil eines nukleären Rezeptors handelt, der zur Wechselwirkung mit dem nukleären Protein über die Bindung an das Kennmotiv fähig ist, in der Lage ist, wobei es sich bei dem nukleären Protein um einen Brückenfaktor handelt, der für die Wechselwirkung zwischen einem mit einem Liganden versehenen, nukleären Rezeptor und einem Transkriptionsinitiations-Komplex, der an der Steuerung der Genexpression beteiligt ist, verantwortlich ist; dem nukleären Rezeptor um einen Transkriptionsfaktor handelt; dem Kennmotiv um B¹XXLL handelt, worin B¹ für eine beliebige natürliche hydrophobe Aminosäure, L für Leucin und X jeweils unabhängig für eine beliebige natürliche Aminosäure, die das entscheidende Strukturelement eines als Teil des Vorgangs der Aktivierung oder Repression von Zielgenen an einen mit einem Liganden versehenen, nukleären Rezeptor bindenden nukleären Proteins darstellt, steht; und wobei man in dem Verfahren:
i) die potentielle Inhibitorverbindung,
ii) den mit einem Liganden versehenen, nukleären Rezeptor oder ein Fragment davon, wobei das Fragment den zweiten Bereich mit der in diesem Anspruch oben unter b) angegebenen Bedeutung umfasst,
iii) ein ein Kennmotiv des nukleären Proteins umfassendes Fragment mit der Maßgabe, dass dabei ein Fragment, das mindestens die Reste 624-1131 von TIF-2 enthält, ausgeschlossen ist, nimmt und
iv) das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Hemmung der Wechselwirkung zwischen ii) und iii) nachweist.

Der Begriff "nukläres Protein" bedeutet die Brückenfaktoren (einschließlich Coaktivatoren), die für die Wechselwirkung zwischen einem mit einem Liganden versehenen, nukleären Rezeptor und einem Transkriptionsinitiations-Komplex, der an der Steuerung der den Expression beteiligt ist, verantwortlich sind (Übersichtsartikel für Steroidhormonrezeptoren in Beato, M., Herrlich, P. & Schutz, G. Cell 83, 851-857 (1995)).
Der Begriff Brückenfaktor kann einen Teil des Transkriptionsinitiations-Komplexes selbst einschließen. Der Begriff "nukleärer Rezeptor" bedeutet die Familie von nukleären Rezeptoren, wie in Mangelsdorf, D.J., et al. Cell 83, 835-839 (1995) beschrieben. Der Begriff "Kennmotiv" bedeutet eine kurze Sequenz von im Allgemeinen mindestens ungefähr 5 Aminosäure-, vorzugsweise 4-10, weiter bevorzugt 5-10 Aminosäureresten, welche das entscheidende Strukturelement eines nukleären Proteins ist, welche an einen mit einem Liganden versehenen, nukleären Rezeptor als Teil des Prozesses der Aktivierung oder Repression von Zielgenen bindet. Der Begriff "mit einem Liganden versehener, nukleärer Rezeptor" bedeutet einen aktivierten, nukleären Rezeptor, beispielsweise mit einem daran gebundenen Liganden. Der Ligand kann verschiedene Formen annehmen, wie beispielsweise ein Hormon, eine kleine Molekülverbindung oder ein Peptid. Im Fall von einigen der nukleären Rezeptoren (z.B. PPAR) gibt es beispielsweise nicht-hormonelle Peptidliganden z.B. Leukotriene. Obwohl nukleäre Rezeptoren im Allgemeinen durch Ligandbindung aktiviert werden, können einige Rezeptoren, wie z.B. Orphan-Rezeptoren aktiv sein, ohne dass ein Ligand benötigt wird und/oder durch nicht Ligand-abhängige Wege aktiviert werden und diese Rezeptoren sind als eine weniger bevorzugte Ausführungsform ebenfalls im Schutzbereich der Erfindung.
Der Begriff "Fragment" bedeutet einen unvollständigen Teil. Vor der vorliegenden Erfindung konnte ein Fachmann nicht wissen, welches Fragment oder Fragmente eines nukleären Proteins genommen werden konnte, um Aktivität zu bewahren. Eine Verwendung von Fragmenten verglichen mit ganzen Proteinen ist besonders vorteilhaft bei Screening-Assays. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt eine bevorzugte Fragmentgröße eines nukleären Proteins 8-10 Aminosäuren, wie beispielsweise hierin in 1A gezeigt. Der mit einem Liganden versehene nukleäre Rezeptor liegt bevorzugterweise in der Form eines Fragments vor. Im Allgemeinen umfassen Fragmente mindestens 8 Aminosäuren.
Vorzugsweise wird das Kennmotiv durch B¹XXLL dargestellt, wobei es sich bei B¹ um eine beliebige natürliche, hydrophobe Aminosäure handelt, bei L um Leucin handelt und X eine natürliche Aminosäure darstellt. Werte für X innerhalb des Kennmotivs sind unabhängig ausgewählt, d.h. X kann gleich oder unterschiedlich sein. Vorzugsweise handelt es sich bei B¹ um Leucin oder Valin, wobei Leucin am meisten bevorzugt wird. In einigen Fällen ist das bevorzugte Kennmotiv ferner als B²B¹XXLL definiert, wobei es sich bei B² um einen hydrophoben Aminosäurerest handelt, wie für B¹ definiert. Eine "natürliche, hydrophobe Aminosäure" ist als eine beliebige aus Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin und Valin definiert. Vorzugsweise liegt das Kennmotiv in der Konfirmation einer Helix vor, vorzugsweise einer amphipathischen Helix, und der Leucinrest bildet eine hydrophobe Fläche davon. Vorzugsweise ist das Kennmotiv innerhalb eines Moleküls so positioniert, dass es an der Oberfläche davon für eine Wechselwirkung mit Proteinen zur Verfügung steht. Vorzugsweise schließen Werte von X Cys oder Pro nicht ein. Vorzugsweise ist mindestens ein Wert von X keine natürliche, hydrophobe Aminosäure oder Prolin. Ein Wert von X ist vorzugsweise unabhängig ausgewählt aus Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, His, Lys, Ser, Thr, Gly oder Ala, weiter bevorzugt ist ein wert von X unabhängig ausgewählt aus Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, His oder Lys.
Ohne an theoretische Überlegungen gebunden sein zu wollen, glaubt man, dass bevorzugte Werte von X begünstigen, dass das Kennmotiv eine amphipathische Helix bildet.
Nach dem ersten Anmeldedatum der vorliegenden Erfindung gab es eine gleichzeitige Veröffentlichung der Identifizierung von LXXLL Motiven durch zwei Gruppen (von denen eine die Erfinder der vorliegenden Erfindung einschließt), nämlich Heery et al, Nature, 12. Juni 1997, 387, 733-736 & Torchia et al, Nature, 12. Juni 1997, 387, 677-684.
Hierin zeigen wir, dass die Fähigkeit eines nukleären Proteins (SRC 1) an einen nukleären Rezeptor (mit einem Liganden versehener ER) zu binden und seine Transkriptionsaktivität zu verstärken, von der Integrität innerhalb des nukleären Proteins des Kennmotivs (LXXLL; SEQ ID NR: 1) abhängig ist, sowie entscheidende hydrophobe Reste in der konservierten Helix (Helix 12) der NRs, die für ihre Ligandinduzierte Aktivierungsfunktion (AF-2)¹⁴ erforderlich sind. Das Kennmotiv wird auch in TIF1, TIF2, p300, RIP 140 und den TRIP Proteinen gefunden und tritt innerhalb von Bereichen dieser Proteine auf, von denen bekannt ist, dass sie ausreichend für eine Wechselwirkung mit NRs sind. Daher handelt es sich bei dem LXXLL Motiv (SEQ ID NO: 1) um eine Kennsequenz, welche die Wechselwirkung von verschiedenen Proteinen mit nukleären Rezeptoren fördert und ist daher ein entscheidender Teil einer neuen Familie von nukleären Proteinen.
Bei einem bevorzugten nukleären Protein handelt es sich um einen Coaktivator, insbesondere schließt das nukleäre Protein beliebige aus RIP 140, SRC-1, TIF2, CBP, p300, TIF1, Trip1, Trip2, Trip3, Trip4, Trip5, Trip8, oder Trip9 ein. Weitere bevorzugte nukleäre Proteine schließen p/CIP, ARA70 & Trip230 ein.
In dieser Beschreibung schließt eine Bezugnahme auf ein nukleäres Protein oder einen nukleären Rezeptor Isoformen davon ein, wenn nicht anders angegeben oder es sich anderweitig aus dem Zusammenhang ergibt. Bei einer Isoform handelt es sich um eine Familie oder Sammlung von verwandten Proteinen, die von einem einzelnen Gen abgeleitet sind. Daher können Isoformen sich leicht in ihren Aminosäuresequenzen unterscheiden, wie beispielsweise durch differenzielles Splicing von Exonen nach der Transkription. SRC1a ist ein Beispiel für eine Isoform von SRC1. Von zwei Isoformen von SRC1, nämlich SRC1a und SRC1e, wurde gezeigt, dass sie Unterschiede in der Zahl von Kennmotiven enthalten und dass sie dahingehend funktionell unterschiedlich sind, dass sie unterschiedliche Rollen in der ER-vermittelten Transkription zu spielen scheinen (Kalkhoven et al, 1998, EMBO Journal, 17, 232-243).
Nukleäre Rezeptoren sind Transkriptionsfaktoren. Ein bevorzugter Transkriptionsfaktor umfasst mindestens einen Teil einer konservierten, amphipathischen α-Helix, und ein Retinsäurerezeptor oder ein Steroidhormonrezeptor ist besonders bevorzugt. Bei bevorzugten Steroidhormonrezeptoren handelt es sich um einen Östrogenrezeptor, Progesteronrezeptor, Androgenrezeptor und Glucocorticoidrezeptor, wobei ein Östrogenrezeptor besonders bevorzugt ist.
Vorzugsweise umfasst der zweite Bereich mindestens einen Teil einer konservierten amphipathischen α-Helix, wie beispielsweise Helix 12 im Östrogenrezeptor, welcher besonders bevorzugt ist.
Eine besonders bevorzugte Kombination von nukleärem Rezeptor und nukleärem Protein ist eine, in welcher es sich bei den nukleären Rezeptor um den Östrogenrezeptor handelt und das nukleäre Protein ausgewählt ist aus SRC1, TIF2, CBP und p300, wobei SRC1 und besonders SRC1a am meisten bevorzugt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren hat die Form eines 2-Hybrid-Assay-Systems. Solche Assay-Systeme sind im Fachgebiet gut bekannt; geeignete Literaturangaben schließen Fields & Sternglanz (1994) TIG, August 1994, 10, 286-292 und US Patent 5,283,173 ein.
Jede geeignete Assay-Ausgestaltung kann angewendet werden, wie beispielsweise ein Radioisotopen-Assay, Scintillations-Proximitäts-Assay (Übersichtsartikel von ND Cook, 1996, Drug Discovery Today, 1, 287-294) oder Fluoreszenz-, insbesondere Zeit-aufgelöster Fluoreszenz-Assay (Übersichtsartikel von MV Rogers, 1997, Drug Discovery Today, 2, 156-160). Eine Übersicht über Hochdurchsatz-Screeening-Technologien wurde durch Houston & Banks in Current Opinion in Biotechnology 1997, 8, 734-740 gegeben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem potentiellen Inhibitor um ein Mitglied einer auf einem Kennmotiv beruhenden Peptidbibliothek.
Codierte Peptidbibliotheken haben im Allgemeinen ein Maximum von 20 möglichen Aminosäuren an jeder beliebigen Position. In der Praxis ist es schwierig, unter Verwendung von aktueller Technologie, Bibliotheken mit mehr als 10⁷-10⁸ Mitgliedern zu durchsuchen, was bedeutet, dass es schwierig ist, mehr als sechs Positionen in einem Peptid zu randomisieren. Daher ist das Einengen des Bindungsbereichs des nukleären Proteins auf ein Signalmotiv von großem Vorteil, wenn ein Peptidbibliotheks-Ansatz angewendet werden soll.
Eine Peptidbibliothek ist eine Sammlung von Peptiden unterschiedlicher Sequenzen. Im Allgemeinen gibt es zwei Wege, um Peptidbibliotheken zu erzeugen (Übersichtsartikel von Scott, 1992; Birnbaum und Mosbach, 1992; Houghten, 1993; siehe auch Abelson, 1996). Der erste Ansatz besteht darin, Bibliotheken zu erzeugen, in denen positive Peptide durch das Sequenzieren der Peptide selbst identifiziert werden. Mischungen von Peptiden können chemisch in solch einer Weise synthetisiert werden, dass die Peptide an Kügelchen gebunden sind, so dass jedes Kügelchen nur ein Peptid enthält. Wenn ein Kügelchen, das ein positives Peptid enthält, identifiziert ist, kann das Kügelchen zurückgewonnen und das Peptid durch chemische Sequenzierung identifiziert werden. Dieser Ansatz wurde zuerst unter Verwendung der Fähigkeit von Antikörpern, Peptide von sechs Aminosäuren spezifisch aus Mischungen zu identifizieren (Lam et al, 1991). Die Wichtigkeit Kügelchen zu verwenden besteht darin, dass das Identifizierungsereignis (in diesem Fall die Antikörper: Peptid-Wechselwirkung) zu der Rückgewinnung eines Kügelchen führt, welches mehr Peptid enthält als das, das an den Antikörper selbst gebunden ist. In einem verwandten Ansatz können Mischungen von freien Peptiden in Poolen synthetisiert und durchsucht werden, unter Verwendung eines Dekonvolutionsverfahrens werden positive Peptide identifiziert (Houghten et al, 1991).
Der zweite Ansatz, besteht darin, Bibliotheken zu erzeugen in denen positive Peptide durch Sequenzieren eines Moleküls, welches in irgendeiner Weise mit dem Peptid verknüpft ist, identifiziert werden. Peptide und einige andere Moleküle, wie eine Nukleinsäure, können auf Kügelchen cosynthetisiert werden, so dass jede Nukleinsäure das auf dem gleichen Kügelchen gefundene Peptid "markiert". Wenn ein Kügelchen, das positiv ist, identifiziert wird, wird das Sequenzieren der Nukleinsäure das Peptid auf diesem Kügelchen identifizieren (Brenner und Lerner, 1992). Als Alternative können Peptidbibliotheken unter Verwendung der Genexpressionsmaschinerie eines lebenden Organismus erzeugt werden. Bei diesem Ansatz ist es nicht notwendig, eine Bibliothek von Peptidmolekülen herzustellen. Stattdessen wird eine Bibliothek von DNA-Molekülen konstruiert, so dass jedes Molekül ein Peptid mit einer unterschiedlichen Sequenz codiert. Diese codierte Bibliothek muss dann in einem geeigneten Wirtsorganismus exprimiert werden, damit die Peptidbibliothek hergestellt wird. Die Bibliothek wird dann durchsucht. Es ist notwendig, dass die Nukleinsäure, welche die Bibliothek codiert, physikalisch in irgendeiner Weise an das Protein gebunden bleibt, so dass eine Rückgewinnung oder Identifizierung der aktiven Peptide zu einer Rückgewinnung der DNA führt, welche diese Peptide codiert. Die Sequenzen der aktiven Peptide können dann durch Sequenzieren der sie codierenden DNA hergeleitet werden. Verschiedene Variationen dieses Ansatzes sind beschrieben worden.
Die am meisten verwendete Version dieses Ansatzes besteht darin, Peptide als Teil der Mantelproteine eines Virus, wie M13, zu exprimieren. Die Viren können durch die Fähigkeit dieses Mantelproteins an Zielproteine (wie Antikörper (Devlin et al, 1990; Scott und Smith, 1990; Cwirla et al, 1990) oder Rezeptoren (der atriale natriuretische Peptidrezeptor: Cunningham et al (1994) und der Thrombopoietinrezeptor (Cwirla et al, 1997) zu binden, durchsucht werden. Dieser Ansatz kann auch dazu verwendet werden, Proteaseinhibitoren durch ihre Fähigkeit an Proteasen zu binden (Roberts et al, 1992; Markland et al, 1996) zu identifizieren, sowie dazu, optimale Substrate für Proteasen, wie Stromelysin und Matrilysin (Smith et al, 1995) und Subtilisin (Matthews and Wells, 1993) zu finden.
Ein intrazellulärer Ansatz für die Erzeugung von Peptiden, die bestimmte Proteine erkennen, besteht darin, das Hefe-Zwei-Hybrid-System zu verwenden. Im Zwei-Hybrid-System sind wechselwirkende Proteine an Domänen von Transkriptionsfaktor fusioniert. Wenn eine Protein: Protein-Wechselwirkung auftritt, dann wird die Transkription eines Reportergens angeregt (Fields und Song, 1989). Dadurch dass ein Bestandteil des Zwei-Hybrid-Systems eine Peptidbibliothek ist, und durch Selektieren auf Zellen, in denen ein Reportergen-Signal auftritt, ist es möglich Peptide zu isolieren, die an ein Zielprotein binden. Dieser Ansatz wurde verwendet um Peptide zu identifizieren, die an das Retinoblastom-Protein banden (Yang et al, 1995). In einem ähnlichen Ansatz exprimierten Colas et al (1996) die Peptidbibliothek als eine Schleife in der Oberfläche des E. coli TrxA Proteins und isolierten Peptide, die an Cyclin-abhängige Kinase 2 (Cdk2) banden.
Gemäß eines anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verringerung der Wechselwirkung zwischen

a) einem ersten Bereich, bei dem es sich um ein Kennmotiv auf einem nukleären Protein handelt, und
b) einem zweiten Bereich, bei dem es sich um denjenigen Teil eines nukleären Rezeptors handelt, der zur Wechselwirkung mit dem nukleären Protein über die Bindung an das Kennmotiv fähig ist, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Zugabe eines Inhibitor in Gegenwart des nukleären Rezeptors und des nukleären Proteins umfasst, wobei der Inhibitor dadurch gekennzeichnet ist, dass er die Wechselwirkung zwischen dem ersten Bereich des nukleären Proteins und dem zweiten Bereich des nukleären Rezeptors verringert.

Gemäß eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid bereitgestellt, ausgewählt aus irgendeinem der folgenden Peptide: PQAQQKSLLQQLLT (SEQ ID NR: 2), KLVQLLTTT (SEQ ID NR: 3), ILHRLLQE (SEQ ID NR: 4), oder LLQQLLTE (SEQ ID NR: 5). Peptide können unter Verwendung herkömmlicher Techniken hergestellt werden, zum Beispiel unter Verwendung von Festphasensynthese und Fmoc-Chemie. Von diesen Peptiden wird erwartet, dass sie in der Behandlung von auf Oestrogen reagierenden Tumoren verwendbar sind. Von Inhibitoren dieser Erfindung wird erwartet, dass sie in der Behandlung einer beliebigen Erkrankung, welche durch eine Wechselwirkung zwischen einem Kennmotiv auf einem nukleären Protein und einem nukleären Rezeptor vermittelt wird, verwendbar sind. Von geeigneten Inhibitoren wird beispielsweise erwartet, dass sie in der Behandlung von Krebs oder Entzündung verwendbar sind.
Während für das Kennmotiv gezeigt wird, dass es auf nukleäre Proteine als eine Klasse zutrifft, wird erwartet das unterschiedliche nukleäre Rezeptoren sowohl Coaktivator- als auch Kennmotiv-Präferenzen zeigen, die zur Spezialität einer hormonellen Antwort beitragen (Ding et al, 1998, Molecular Endocrinology, 12, 302-313) was wiederum auf selektive pharmazeutische Eingriffsmöglichkeiten hindeutet. 1A und 5 unten deuten ebenso an, dass individuelle Motive sich in der Stärke unterscheiden können, mit der sie an nukleäre Rezeptoren binden.
Beachten Sie, dass die NR-Box von Le Douarin et al. (oben diskutiert) kein Kennmotiv offenbart, das innerhalb der Bedeutung der vorliegenden Erfindung liegt, weil beispielsweise die innerhalb der Bedeutung von Le Douarin liegende NR-Box in höchstens vier der 39 Kennmotive, die durch die vorliegende Erfindung in 3A & 4 (siehe unten) identifiziert wurden, vorhanden wäre. Außerdem haben Le Douarin et al. nicht einmal Inhibitoren einer nukleärer Rezeptor-nukleäres Protein-Wechselwirkung vorgeschlagen.
Der Begriff "Antikörper" soll polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und die verschiedenen Arten von Antikörperkonstrukten, wie beispielsweise F(ab')₂, Fab und Einzelstrag Fv, einschließen. Antikörper sind so definiert, dass sie spezifisch binden, wenn sie mit einer K_a von mehr als oder gleich ungefähr 10⁷ M^-1 binden. Die Bindungsaffinität kann unter Verwendung herkömmlicher Techniken, beispielsweise von jenen die durch Scatchard et al., Ann. N. Y Acad. Sci., 51: 660 (1949) beschrieben wurden, bestimmt werden.
Polyklonale Antikörper können aus einer Vielzahl von Quellen, beispielsweise Pferden, Kühen Ziegen, Schafen, Hunden, Hühnchen, Kaninchen, Mäusen oder Ratten unter Verwendung von im Fachgebiet gut bekannten Verfahren, hergestellt werden. Im Allgemeinen wird ein Immunogen dem Wirtstier typischerweise durch parenterale Injektion verabreicht. Die Immunogenität kann durch die Verwendung eines Adjuvans, beispielsweise komplettes oder nicht komplettes Freundsches Adjuvans verstärkt werden. Nach Auffrischungsimmunisierungen werden kleine Proben von Serum gesammelt und auf Reaktionsfähigkeit getestet. Beispiele für verschiedene Assays, die zur Bestimmung verwendet werden können, schließen solche ein, die in: Antibodies. A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; beschrieben sind, sowie Verfahren wie Gegenstromimmunelektrophorese (CIEP), Radioimmunassay, Radioimmunpräzipitation, enzymgekoppelter Immunosorbent-Assays (ELISA), Dot-Blot-Assays, und Sandwich-Assays, siehe U.S. Patente Nr. 4,376,110 und 4,486,530.
Monoklonale Antikörper können leicht unter Verwendung von bekannten Verfahren hergestellt werden, siehe beispielsweise die Verfahren, die in den U.S. Patenten Nr. 4,902,614, 4,543,439 und 4,411,993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, und Bechtol (Hrsg.), (1980) beschrieben sind.
Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von alternativen Techniken hergestellt werden, wie solche, die durch Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990) beschrieben sind, welche durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind. In ähnlicher Weise können Bindungspartner unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken konstruiert werden, um die variablen Bereiche eines Gens, das einen spezifisch bindenden Antikörper codiert, einzubauen. Solch eine Technik ist in Larrick et al., Biotechnology, 7: 394 (1989) beschrieben.
Gemäß einer weiteren Eigenschaft der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, welche ein wie oben definiertes Peptid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Trägermittel umfasst.
Die Zusammensetzung kann in einer Form vorliegen, die für orale Anwendung geeignet ist, beispielsweise eine Tablette, Kapsel, wässrige oder ölige Lösung, Suspension oder Emulsion, für oberflächliche Anwendung beispielsweise eine Creme, Salbe, Gel oder wässrige oder ölige Lösung oder Suspension; für Anwendung in der Nase beispielsweise ein Schnupftabak, Nasenspray oder Nasentropfen; für vaginale oder rektale Anwendung, beispielsweise ein Zäpfchen; für Verabreichung durch Inhalation, beispielsweise als ein fein zerkleinertes Pulver wie ein Trockenpulver, eine mikrokristalline Form oder ein flüssiges Aerosol; für Anwendung unter der Zunge oder in der Mundschleimhaut, beispielsweise eine Tablette oder Kapsel; oder für parenterale Anwendung (einschließlich intravenös, subkutan, intramuskulär, intravaskular oder Infusion), beispielsweise eine sterile wässrige oder ölige Lösung oder Suspension. Im Allgemeinen können die obigen Zusammensetzungen in einer herkömmlichen Weise unter Verwendung herkömmlicher Trägerstoffe hergestellt werden. Für Peptidinhibitoren werden parenterale Zusammensetzungen bevorzugt.
Die Menge an aktivem Inhaltsstoff, der mit einem oder mehreren Trägerstoffen kombiniert wird, um eine Einzeldosisform herzustellen, wird notwendigerweise abhängig vom behandelten Wirt und dem jeweiligen Verabreichungsweg variieren. Beispielsweise wird eine Formulierung, die für eine orale Anwendung an Menschen vorgesehen ist, im Allgemeinen beispielsweise, von 0,5 mg bis 2 g des aktiven Mittels, gemischt mit einer angemessenen und geeigneten Menge an Trägerstoffen, die von ungefähr 5 bis ungefähr 98 Gewichtsprozent der Gesamtzusammensetzung variieren kann, enthalten. Formen von Dosierungseinheiten werden im Allgemeinen ungefähr 1 mg bis ungefähr 500 mg eines aktiven Bestandteils enthalten.
Die Erfindung wird durch die nichteinschränkenden Beispiele, unten, näher erläutert, in denen falls nicht anders angegeben, Temperaturen in Grad Celsius ausgedrückt werden und Peptidsequenzen vom N-Terminus zum C-Terminus aufgelistet werden.
1a/1b zeigen die Wechselwirkung von von Coaktivatoren abgeleiteten LXXLL Motiven mit dem ER.
1a: Hefe-Zwei-Hybrid Wechselwirkungen von LXXLL Motiven, die von den Proteinen RIP140, SRC1a und CBP abgeleitet sind, mit den LBDs von wildtyp oder mutiertem ER. Die Sequenzen der LXXLL Motive in den DNA-Bindungsdomänen(DBD)-Fusionsproteinen sind angedeutet. DBD-LXXLL Proteine wurden mit AAD-ER oder AAD-ER Mut coexprimiert, welche aus eine sauren Aktivierungsdomäne (AAD) fusioniert an die LBD des wildtyp ERs, beziehungsweise an die transkriptionell defekte ER Mutante, bestehen. Reporteraktivitäten wurden in der Gegenwart oder Abwesenheit von 10^-7M 17-β-Östradiol (E2) bestimmt und als Einheiten von β-Galactosidase-Aktivität ausgedrückt.
In 1a von oben nach unten aufgelistete Sequenzen werden in dieser Reihenfolge als SEQ ID NR: 6-23 aufgelistet.
1b: Wirkungen von Mutationen im RIP140 LXXLL Motiv, das bei Aminosäuren 935-943 liegt, auf eine Bindung von AAD-ER. Konservierte Leucinreste sind umrandet und mutierte Reste eingekreist. Die Reporteraktivität wurde in der Gegenwart (schwarze Balken) oder Abwesenheit (weiße Balken) von 10^-7 E2 bestimmt. In 1b von oben nach unten aufgelistete Sequenzen, werden in dieser Reihenfolge als SEQ ID NR: 24-32 aufgelistet.
2a/2b/2c zeigen, dass LXXLL Motive für eine Bindung von SRC1 an die ER LBD in vitro und für die Fähigkeit von SRC1 ER-Aktivität in vivo zu verstärken notwendig sind.
2a: Wildtyp (SRC1a) und mutierte (SRC1a-M1234) SRC1 Proteine werden schematisch dargestellt. Die schwarzen Balken stellen die ungefähre Lagen der LXXLL Bindungsmotive in der linearen SRC1a-Sequenz dar und die schattierten Kreise deuten die Mutation von LXXLL Bindungsmotiven durch Ersetzen von konservierten Leucinresten durch Alaline (siehe Methoden) an.
Bindung von wildtyp SRC1a oder SRC1a-M1234 Mutante an Glutathion-S-Transferase (GST) allein, an die Ligandbindungs-Domäne (aa 313-599) von ER (GST-AF2), oder die SRC1-Bindungsdomäne (aa 2058-2163) von CBP (GST-CBP) in der Gegenwart (+) und Abwesenheit (-) von 10^-6M E2. Die mit 10% der Eingabe an [³⁵S]-markierten wildtyp und mutierten SRC1 Proteinen erhaltenen Signale sind gezeigt.
2b: Die Fähigkeit von ansteigenden Mengen der Peptide P-1 (SEQ ID NO: 2) und P-2 (SEQ ID NO: 72) mit der Bindung von wildtyp SRC1a an GST-AF2 in der Gegenwart von Ligand zu konkurrieren wird gezeigt. Die Sequenzen der P-1 und P-2 Peptide werden im Fuss von 2b angegeben und die konservierten Leucine und Alaninsubstitutionen sind umrandet.
2c: Wildtyp aber nicht mutiertes SRC1e M123 potenziert eine Aktivierung des Reportergens 2ERE-pS2-CAT durch ER in transient transfizierten Hela-Zellen. Reporteraktivitäten, die aus Extrakten von transfizierten Zellen erhalten wurden, welche in der Abwesenheit (weiße Säulen) oder Gegenwart (schwarze Säulen) von Ligand (10^-8M E2) gewachsen waren. Die Mengen an in den Transfektionen verwendeten ER, SRC1-wt und SRC1-mut Expressionsplasmiden werden unter der Graphik angegeben. Die gezeigten Aktivitäten sind Durchschnitte von Doppelbestimmungen.
3a/3b & 4 zeigen, dass die LXXLL Sequenz ein Kennmotiv in Proteinen, welche die LBDs von NRs binden, ist.
3a: Alignment von LXXLL Motivsequenzen, die in menschlichem RIP140¹⁰, menschlichem SRC1a, Maus TIF2⁶ Maus CBP^23.24, p300³³, Maus TIF1¹¹ and menschlichem TRIP Proteinen¹² vorhanden sind. Die konservierten Leucine sind umrandet und die Aminosäurenummern werden für jedes Motiv angegeben. In 3A von oben nach unten aufgelistete Sequenzen werden in dieser Reihenfolge als SEQ ID NR: 33-61 aufgelistet.
3b: Schematische Darstellung des Vorkommens von LXXLL Motiven (schwarze Balken) in den Sequenzen von Proteinen, die NRs binden. Die Aminosäuregrenzen der bekannten NR-Bindungsstellen werden ebenfalls gezeigt.
4: Alignment von LXXLL Motivsequenzen, die in CBP, P300, p/CIP, ARA70 & TRIP230 vorhanden sind. Die konservierten Leucine sind umrandet und die Aminosäurenummern werden für jedes Motiv angegeben. In 4 von oben nach unten aufgelistete Sequenzen werden in dieser Reihenfolge als SEQ ID NR: 62-71 aufgelistet.
5 zeigt, dass die genaue Natur des LXXLL Kennmotivs die Stärke der Wechselwirkung zwischen SRC-1a und den LBDs von ERα, ERβ and GR beeinflusst.
5a: Die ERα LBD bindet and die 4 Kennmotive von SRC-1a mit unterschiedlichen Affinitäten in Hefe-2-Hybrid-Assays (SRC-1a Motiv 1-4 = SEQ ID 73-76). Die Reihenfolge (abnehmende Affinität) ist SRC-1a Motiv 2 > SRC-1a Motiv 4 > SRC-1a Motiv 1 > SRC-1a Motiv 3.
5b: Die ERβ LBD bindet an die Kennmotive von SRC-1a mit den gleichen relativen Affinitäten, die mit ERa gesehen werden. Die Reihenfolge (abnehmende Affinität) ist SRC-1a Motiv 2 > SRC-1a Motiv 4 > SRC-1a Motiv 1 > SRC-1a Motiv 3.
5c: Die GR LBD bindet an die Kennmotive von SRC-1 mit unterschiedlichen Affinitäten und die Rangordnung von Affinitäten unterscheidet sich von jenen, die mit ERα und ERβ gesehen werden. Die Reihenfolge (abnehmende Affinität) ist SRC-α Motiv 4 > SRC-1a Motiv 1 = SRC-1a Motiv 2 = SRC-1a Motiv 3.
In 5 stellen die Einheiten der Y-Achse relative β-Galctosidase-Aktivität dar. In 5 deutet die X-Achsen-Motivnummerierung nur einen Teil der eigentlichen, verwendeten Sequenz an, welche wie folgt lautet: 627-640, 684-696, 743-755 und 1428-1441. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet.
Es wurden Standard-Aminosäureabkürzungen verwendet.
Punktmutationen werden wie folgt bezeichnet werden: natürliche Aminosäure (unter Verwendung der 1-Buchstaben-Nomenklatur), Position, neue Aminosäure. Beispielsweise bedeutet "L636A", dass an Position 636 ein Leucin (L) zu Alanin (A) verändert wurde. Mehrfachmutationen werden zwischen eckigen Klammern gezeigt werden.
Beispiel 1
Kartierung von Wechselwirkungsstellen zwischen nukleärem Rezeptor und nukleärem Protein
Es wurde vorher gezeigt, dass das 140 kDa Rezeptor-Wechselwirkungsprotein (RIP140) durch mindestens zwei getrennte Stellen, die an den N- und C-Termini des Proteins²¹ gelegen sind, direkt an NRs band. Um diese Wechselwirkungsstellen in größerem Detail zu kartieren, haben wir eine Serie von zwanzig unterschiedlichen, durch PCR erzeugte Fragmente der RIP140 codierenden Sequenz, im Leserraster fusioniert mit einer heterologen DBD, auf Wechselwirkung mit NRs in einem Zwei-Hybrid-System untersucht. Bemerkenswerterweise zeigten alle bis auf zwei Ligandabhängige Wechselwirkung mit ER, einschließlich fünf nicht-überlappende RIP140 Sequenzen, obwohl die unterschiedlichen Konstrukte die gesamte 1158 Aminosäuren TRIP140 Sequenz überspannten. Durch Vergleich der Sequenzen der kürzesten wechselwirkenden Fragmente, identifizierten wir ein kurzes Motiv (LXXLL), das allen wechselwirkenden Fragmenten gemeinsam ist. Insgesamt wurden neun Kopien des Motivs in der RIP140 Sequenz identifiziert, aber das Motiv fehlte in Fragmenten, die keine Bindungsaktivität in unseren Experimenten zeigten.
Um zu bestimmen, ob diese kurzen Sequenzen ausreichend waren, um an NRs zu binden, konstruierten wir eine Serie von Proteinen, die aus einer DBD fusioniert mit acht bis 10 Aminosäuren, welche eine Kopie von jedem der neun LXXLL Motive enthielt, bestanden. Wie in 1a gezeigt, zeigte jedes der neun in RIP 140 vorhandenen Motive eine starke Ligandabhängige Wechselwirkung mit der LBD des ERs, während die DBD allein keine Fähigkeit zu binden zeigte (beachten Sie, dass von den 10 Motiven, welche für RIP140 aufgelistet sind, der 10. eine Wiederholung des 9. Locus ist). Vergleichbare Ergebnisse wurden mit der LBD von RAR (Daten nicht gezeigt) erhalten. Eine Mutation von hydrophoben Resten innerhalb von H12 hob die AF2 Aktivität auf und verhinderte die Rekrutierung von RIP140¹⁰, TIF1¹¹, TIF2⁶, SUG1¹³ und SRC1. In ähnlicher Weise hob eine Mutation der H12 Reste M543 und L544 im ER die Ligand-abhängige Wechselwirkung von allen neun LXXLL Motiven mit ER (1a) auf. Nimmt man diese Ergebnisse zusammen, folgern wir daraus, dass ein kurzes konserviertes Motiv, das in so wenig wie acht Aminosäuren enthalten ist, ausreichend ist, um an transkriptionell aktive NRs zu binden. Diese Entdeckung, dass ein relativ kleines Motiv die Wechselwirkung zwischen zwei relativ großen Molekülen beeinflussen kann, ist auf diesem Gebiet beispiellos.
Sekundäre Strukturanalyse unter Verwendung des Phd Programms²² ließ erkennen, dass jede der neun Kopien dieses Motivs in RIP140 innerhalb eines Bereichs auftrat, von dem vorhergesagt wurde, dass er eine αhelikale Natur habe, in welcher die konservierten Leucine eine hydrophobe Oberfläche bilden würden.
Beispiel 2
Mutationsanalyse eines Kennmotivs
Um die Sequenzbedingungen zu bestimmen, die erforderlich sind, um eine funktionelle Wechselwirkung zu beobachten, führten wir eine partielle Mutationsanalyse von einem der RIP140 Motive (Aminosäuren 935-943; 1b) durch. Während Western-Blot-Analyse keine signifikante Variation in der Expression der wildtyp und mutierten Fusionsproteine zeigte (Daten nicht gezeigt), ergab eine Mutation von Valin 935 zu Alanin eine ungefähr zehnfache Verringerung der Reporteraktivität in der Gegenwart von Ligand, welche wenn zusammen genommen mit der Beobachtung, dass die erste Aminosäure in sieben der neun LXXLL Motiven in RIP140 hydrophob ist, eine Präferenz für einen hydrophoben Rest an dieser Position andeuten kann. Bemerkenswerterweise ergab eine Mutation von jedem der drei konservierten Leucinreste L936, L939 oder L940 zu Alanin einen vollständigen Verlust der Bindung an die LBD von ER (1b) und RAR (Daten nicht gezeigt), was ihre Wichtigkeit in der Vermittlung der Wechselwirkung mit NRs betont.
Im Gegensatz dazu hatte eine Mutation von L941 zu Alanin (welches innerhalb der Motive nicht konserviert ist; siehe 3a), keine Wirkung auf die Fähigkeit dieser Sequenz an die ER LBD zu binden. Ersatz eines konservierten Leucinrestes durch ein Valin wurde bei L936, nicht aber bei L939 oder L940 toleriert, was andeutet, dass ein hydrophober Charakter allein nicht ausreichend ist, um eine Wechselwirkung mit ER (1b) aufrecht zu erhalten. Die Aminosäuren K937, Q938, S942 und E943 wurden keiner Mutagenese unterzogen, da sie unter dem Motiven, die wir identifiziert haben, nicht konserviert sind (siehe 3a).
Beispiel 3
Analyse von Kennmotiven in nukleären Proteinen
Der Steroidrezeptor-Coaktivator SRC1, welcher Ligand-abhängige, transkriptionelle Aktivität stimuliert, wurde ursprünglich als eine partielle cDNA identifiziert, welche ein Protein codiert, das in der Lage ist mit dem Progesteronrezeptor mittels eines 196 Aminosäure C-terminalen Bereichs³ zu wechselwirken. Uns fiel auf, dass die acht am meisten C-terminal gelegenen Aminosäuren auf den LXXLL-Consensus passen und tatsächlich zeigt diese Sequenz (DBD-SRC1a 1434-1441) eine starke Ligand-induzierte Bindung an ER, aber nicht an die ERH12 Mutante (1a). Nachfolgende Studien haben SRC1 (SRC1a) von voller Länge aus Maus (1459 Aminosäuren)⁴'⁵ und menschlichen (1441 Aminosäuren) Geweben identifiziert. Sowohl Maus als auch menschliche SRC1a Proteine wechselwirken mit mehreren NRs und enthalten einen zusätzlichen Wechselwirkungsbereich zwischen den Resten 569 bis 789⁵ beziehungsweise 570-780. Drei Kopien des LXXLL Motivs wurden in dieser zentralen Wechselwirkungsdomäne des menschlichen SRC1a (siehe 3a & 3b) identifiziert, von denen jede Ligand-abhängige Bindung an sowohl ER (1a) als auch RAR (Daten nicht gezeigt) aber nicht an die ER H12 Mutante im Zwei-Hybrid-Assay zeigte. Interessanterweise sind die Sequenzen und relativen Positionen der drei Motive in der zentralen Domäne von SRC1a im verwandten Coaktivatorprotein transkriptioneller intermediärer Faktor 2 (TIF2) (3a + b) konserviert, und entsprechen dem Bereich von TIF2 von dem bekannt ist, dass er an NRs⁶ bindet. Anders als SRC1a, scheint TIF2 jedoch ein Motiv an seinem C-Terminus zu fehlen. Zusätzlich bemerkten wir, dass SRC1 drei andere Sequenzen enthält, die mit dem LXXLL Consensus übereinstimmen. Obwohl vom Motiv bei den Resten 45-53 durch das Phd Programm vorhergesagt wird, dass es α-helikal sei und innerhalb der Basis Helix-Loop-Helixdomäne am N-Terminus von SRC1a⁵ liegt, zeigte es nur eine sehr schwache (sechsfache) Wechselwirkung mit mit einem Liganden versehenen ER (1a) oder RAR (nicht gezeigt) im Hefe-Zwei-Hybrid-Assay.
Dieses stimmte mit dem beobachten Fehlen von einer starken NR-Bindungsaktivität, die mit dem N-Terminus von SRC1 verbunden ist, überein. Die anderen beiden Motive innerhalb der Reste 111-118 und 912-920 enthalten beide Prolinreste und gemäß des Phd Programms ist unwahrscheinlich, dass sie α-helikale Struktur annehmen. Tatsächlich zeigten diese Sequenzen keine nachweisbare Wechselwirkung mit NRs in unseren Bindungsassays (1a), was eine Präferenz für eine angemessene sekundäre Struktur zum Binden von LXXLL Sequenzen an NRs stark nahelegt.
Neue Berichte haben angedeutet, dass CBP/p300 Proteine, die ursprünglich als Coaktivatoren für CREB^23,24, identifiziert wurden, Coaktivatoren für viele Transkriptionsfaktoren einschließlich NRs^4,5,8,9 sind und als Integratoren von verschiedenen Signalwegen dienen können⁴. Von CBP wurde gezeigt, dass es über seine N-terminalen 101 Aminosäuren⁴ direkt an NRs bindet, mit einer möglichen RXR-spezifischen Bindungsstelle zwischen Resten 356-495⁸. Unsere Analyse zeigte, dass die CBP Sequenz Kopien des LXXLL Motivs innerhalb der Positionen 68-78 und 356-364 beherbergt, welche in der p300 Sequenz (Aminosäuren 80-90 und 341-351; 3a) konserviert sind. Tatsächlich zeigt der N-Terminus von CBP (Aminosäuren 1-101; Daten gezeigt) und das LXXLL Motiv bei den Resten 68-75 der CBP Sequenz (1a) Ligand-abhängige Bindung an ER, aber nicht an die transkriptionell defekte ER Mutante(1a), wenn sie im Zwei-Hybrid-Assay getestet wurden.
Beispiel 4
Die Bindung von Coaktivatorproteinen an NRs ist abhängig von Kennmotiven
Um zu zeigen, dass die Bindung von Coaktivatorproteinen an NRs von LXXLL Motiven abhängig ist, führten wir Alaninsubstitutionen in SRC1a an den konservierten Leucinpaaren bei den Resten [L636A, L637A, L693A, L694A, L752A, L753A, L1438A, L1439A] ein, wodurch wirksam ein mutiertes Protein erzeugt wurde (SRC1a-M1234), in dem alle vier funktionellen Bindungsmotive untauglich gemacht waren. Dann verglichen wir die Fähigkeit von in vitro translatiertem SRC1a und SRC1a-M1234 an die Ligandenbindungs-Domäne des Maus Östrogenrezeptors fusioniert mit Glutathion-S-Transferase (GST-AF2) zu binden in GST Pulldown-Experimenten (Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York.). Wie in 2a gezeigt, band SRC1a-M1234 entweder in der Gegenwart oder der Abwesenheit von Ligand nicht an GST-AF2, während wildtyp SRC1a Protein Ligand-anbhängige Bindung an GST-AF2 zeigte. Um zu bestätigen, dass die Mutationen keine groben Strukturstörungen in SRC1a-M1234 induzierten, verglichen wir die Fähigkeit der in vitro translatierten Proteine mit den Aminosäuren 2058-2163 von CBP zu wechselwirken, welche vorher als die SRC1 Bindungsdomäne 4 identifiziert worden war. Beide Proteine behielten eine starke Bindung an GST-CBP (2a), was andeutet, dass diese SRC1 Funktion in sowohl den wildtyp als auch den mutierten Proteinen intakt blieb. Zusätzlich zeigten wir, dass die Bindung von wildtyp SRC1a an GST-AF2 durch steigende Konzentrationen eines kurzen Peptids (P1), das dem Motiv am C-Terminus von SRC1a (2b) entsprach, auskonkurriert wird. Im Gegensatz dazu, konkurrierte ein ähnliches Peptid (P2), in dem das LXXLL Motiv mutiert war, oder mit dem LXXLL Motiv nicht verwandte Peptide (Daten nicht gezeigt), nicht mit der Bindung von SRC1a an GST-AF2 (2b).
Um schließlich zu zeigen, dass LXXLL Motive für die Funktion von SRC1 in vivo notwendig sind, verglichen wir die Fähigkeiten von wildtyp SRC1 und eines mutierten Proteins, in welchem alle LXXLL Motive untauglich gemacht waren, die Aktivität von Maus ER in transienten Transfektionsexperimenten zu verstärken. Wie in 2c gezeigt, verstärkte wildtyp SRC1 die Aktivität von ER in einer konzentrationsabhängigen Weise. Im Gegensatz dazu hatte die SRC1 Mutante, die nicht in der Lage war an ER (2a) zu binden, keine stimulatorische Wirkung aber verringerte die ER Aktivität um bis zu 50% bei der höchsten Konzentration (2c). Diese offensichtlich dominant negative Eigenschaft des mutierten SRC1 beruht wahrscheinlich auf ihrer Fähigkeit Wechselwirkungen mit CBP aufrecht zu erhalten, während sie dabei versagt, mit NRs (2a) zu wechselwirken. In Anbetracht des kürzlichen Nachweises, dass SRC1 und CBP/p300 in vivo als Komplex existieren können⁹ und dass CBP ebenfalls NR-Bindungsaktivität aufweist^4,8, ist dieses Ergebnis von Interesse weil unsere Daten nahelegen, dass die Wechselwirkungen zwischen NRs und CBP nicht ausreichend sind, um die Unfähigkeit des mutierten SRC1a Proteins an NRs zu binden zu kompensieren, zumindest unter diesen Bedingungen. Es bleibt noch zu bestimmen, ob NRs gleichzeitig von p160 und p300 Proteinen in Anspruch genommen werden, die unabhängig oder als ein Komplex funktionieren.
Eine Untersuchung der Sequenzen anderer Proteine, von denen bekannt ist, dass sie an NRs binden, deckte auf, dass sie eine oder mehrere Kopien des LXXLL Motivs enthalten, TIF1 enthält ein einzelnes Motiv (Reste 722-732) innerhalb des minimalen Bereichs, von dem bekannt ist, dass er für seine Wechselwirkung mit NRs notwendig ist^11,25, Die verkürzten Proteine TRIPs2-5, TRIP8 und TRIP9, die in einer Zwei-Hybrid-Suche nach mit TR wechselwirkenden Proteinen identifiziert wurden¹², enthalten jeweils mindestens eine Kopie des LXXLL Motivs (3a), während das Motiv in TRIPs, dessen Wechselwirkung Ligand-unabhängig war, fehlte.
Ein Alignment von einer Auswahl dieser Sequenzen wird in 3a gezeigt, während 3b die Häufigkeit von Motiven in den Sequenzen von RIP140, SRC1a, TIF1, TIF2, CBP und p300, und die Grenzen von bekannten Rezeptor-Wechselwirkungsdomänen in diesen Proteinen zeigt. Interessanterweise wurden Motive auch in einigen anderen Proteinen identifiziert, für die Hinweise auf Wechselwirkung mit NRs existieren, einschließlich Ara70²⁶, SW13²⁷, und die Re1A (p65) Untereinheit von NFk-B²⁸, obwohl die Rezeptorwechselwirkungsdomänen in diesen Proteinen nicht kartiert wurden. Die Fähigkeit anderer LXXLL Motive enthaltender Proteine an NRs zu binden, wird von ihrer subzellularen Lokalisation sowie der α-Helizität und der Zugänglichkeit an der Oberfläche der Motive abhängen. Während klar ist, dass die konservierten Leucinreste wesentlich für die Funktion des Motivs sind, können, in Anbetracht des Grades der Sequenzkonservierung von äquivalenten Motiven in SRC1/TIF2 oder CBP/p300, andere Aminosäuren ebenfalls wichtig sein.
Da viele NR-Bindungsproteine mehrfache Kopien des LXXLL Motivs enthalten, muss noch etabliert werden, ob dies den gleichzeitigen Kontakt individueller Partner in Homo- und Heterodimeren von NRs fördert, oder ob es dazu dient, alternative Wechselwirkungsoberflächen bereitzustellen, um sich an durch die Bindung von NRs an verschiedene Antwortelemente aufgedrängte Konformationsänderungen anzupassen. Die systematische Mutation von LXXLL Motiven in Coaktivatoren wie SRC1 und CBP kann es uns ermöglichen, den Crosstalk oder die Synergie zwischen unterschiedlichen Signal-transduktionswegen zu entkoppeln und daher ein besseres Verständnis ihrer vorgeschlagenen Rollen als Coaktivatoren und Integratoren bereitstellen.
Beispiel 5
Zwei-Hybrid-Wechselwirkungs-Assays
Bei dem Hefe-Reporterstamm, der für alle Zwei-Hybrid-Assays verwendet wurde, handelt es sich um W303-1B (HMLα MATα HMRa his3-11, 15 trpl-1 ade2-1 can1-100 leu2-3, 11, ura3) der das Plasmid pRLΔ21-U3ERE trägt, welches ein lacZ-Reportergen enthält, das durch die drei auf Östrogen ansprechende Elemente (EREs)²⁹ getrieben wird. Die Plasmide pBL1 und pASV3, welche die menschliche ER DNA-Bindungsdomäne (DBD) beziehungsweise die VP16 saure Aktivierungsdomäne (AAD) exprimieren³⁰, wurden dazu verwendet, DBD oder AAD Fusionsproteine für Zwei-Hybrid-Wechselwirkungs-Analysen zu erzeugen. DBD-LXXLL Motiv Fusionsproteine wurden durch Ligation von phosphorylierten, angelagerten Oligonukleotidpaaren in den pBL1 Vektor erzeugt. AAD-ER wurde durch Clonieren eines, die Aminosäuren 282-595 des menschlichen ER codierenden, PCR-Fragments in pASV3 konstruiert. AAD-ER Mut wurde in einer ähnlichen Weise konstruiert, mit der Ausnahme dass die Aminosäuren M543 und L544 oder ER durch rekombinante PCR zu Alaninen mutiert wurden. Alle Fusionskonstrukte wurden vollständig sequenziert. Transformanten, die die gewünschten Plasmide enthielten, wurden durch Selektion auf die entsprechenden Plasmidmarker erhalten und wurden bis zur späten logarithmischen Wachstumsphase in 15 ml Selektionsmedium (Hefe-Stickstoffbasis, enthaltend 1% Glucose und geeignete Zusatzstoffe) in der Gegenwart oder Abwesenheit von 10^-7M 17-β-Östradiol (E2) wachsen gelassen.
Die Expression von DBD- und AAD-Fusionsproteinen in zellfreien Hefeextrakten wurde durch Immunnachweis unter Verwendung monoklonaler Antikörper, welche den menschlichen ER erkennen (ein Geschenk von P. Chambon, Strasbourg) verifiziert. Der Antikörper erkennt den "F" Bereich der LBD im menschlichen ER und auch die "F"-Bereichsmarkierung an den N-Termini der DBD Fusionsproteine³⁰. Gleiche Mengen an Protein wurde durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen aufgetrennt und für Western-Blots auf Nitrocellulose übertragen. Die Herstellung von zellfreien Extrakten durch das Glaskügelchen-Verfahren und die Messung von β-Galactosidase-Aktivität in den Extrakten wurde wie vorher beschrieben²⁹ durchgeführt. Zwei-Hybrid-Experimente wurden mehrere Male wiederholt und die in 1a und 1b gezeigten Daten stellen, Reporteraktivitäten dar, wie sie in einem einzelnen repräsentativem Experiment gemessen wurden. Die β-Galactosidase-Aktivitäten werden als nMol/Minute/μg Protein ausgedrückt.
Beispiel 6
In Vitro Bindungs- und Peptidinhibitions-Assays
GST-AF2 besteht aus der Ligandbindungs-Domäne des Maus ER (Aminosäuren 313-599) fusioniert an Glutathion-S-Transferase und wurde vorher beschrieben³¹. GST-CBP besteht aus GST fusioniert an die SRC1 Bindungsdomäne von CBP und wurde durch Clonierung eines die Reste 2058-2163 von Maus CBP codierenden PCR-Fragmentes in den Vektor pGEX2TK (Pharmacia) konstruiert. Menschliche SRC1a und SRC1e cDNAs wurden aus menschlichen B-Zell cDNA-Bibliotheken isoliert und in eine modifizierte Version des Expressionsvektors pSG5 cloniert. SRC1a M1234 und SRC1eM123 wurden durch rekombinante PCR konstuiert, um die Mutationen [L636A, L637A, L693A, L694A, L752A, L753A, L1438A, L1439A] beziehungsweise [L636A, L637A, L693A, L694A, L752A, L753A] einzuführen. Alle SRC1 Konstrukte und wurden vollständig sequenziert. GST-SEPHAROSE^TM Kügelchen wurden mit GST allein oder GST-Fusionsproteinen, hergestellt aus bakteriellen, zellfreien Extrakten, beladen. [³⁵S]-markierte SRC1-Proteine wurden durch in vitro Translation hergestellt und auf eine Wechselwirkung mit GST-Proteinen in der Gegenwart oder der Abwesenheit von 10^-6M Östradiol (E2) wie vorher beschrieben²¹ getestet. Das Binden wurde für drei Stunden bei 4° mit sanftem Mischen in Proteaseinhibitoren enthaltenden NETN Puffer (100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 20 mM TrisHCl, pH 8,0) in einem Endvolumen von 1 ml durchgeführt. Peptide P-1 und P-2 wurden in Wasser bei einer Konzentration von 4 mg/ml gelöst und individuell zu den GST-Bindungsreaktionen unmittelbar vor der Zugabe von Ligand zugefügt. Die ansteigenden Mengen an Peptid, das in den gezeigten Kompetitionsexperimenten zugefügt wurde, entsprachen 2,5, 5, 12,5 und 25 μM.
Unter Verwendung von analogen Verfahren kann gezeigt werden, dass Peptide KLVQLLTTT (SEQ ID NR: 3), ILHRLLQE (SEQ ID NR: 4) und LLQQLLTE (SEQ ID NR: 5) Inhibitoren sind.
Beispiel 7
Transiente Reporterassays
Hela-Zellen wurden mit 1 μg Reporter 2ERE-pS2-CAT³², 150 ng β-Galactosidase-Expressionsplasmid (interne Kontrolle), 10 ng ER-Expressionsplasmid und 50 oder 200 ng SRC1-Expressionsplasmiden oder leerem Vektor pro Vertiefung (zweifach) unter Verwendung von Platten mit 24 Vertiefungen transfiziert. Transfizierte Zellen wurden über Nacht in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, ohne Phenolrot und 10% mit Aktivkohle behandeltes FBS enthaltend, inkubiert und vor Zugabe von Ligand (10^-8M E2) oder Hilfsmittel in frischem Medium gewaschen. Nach 40 Std. wurden die Zellen geerntet und Extrakte auf CAT- und β-Galactosidase-Aktivitäten^14,21 analysiert, β-Galactosidase-Aktivitäten wurden verwendet, um Unterschiede in der Transfektionseffizienz zu korrigieren.
Beispiel 8
Pharmazeutische Zusammensetzung
Das Folgende erläutert eine repräsentative pharmazeutische Dosisform, die einen Peptidinhibitor enthält und die für eine Therapie verwendet werden kann.
Injizierbare Lösung
Eine sterile wässrige Lösung zur Injektion, enthaltend pro ml Lösung:

Peptid P-1 5,0 mg
Natriumacetat-trihydrat 6,8 mg
Natriumchlorid 7,2 mg
Tween 20^TM 0, 05 mg

Eine typische Dosis an Peptid für erwachsene Menschen beträgt 30 mg.
Beispiel 9
Die Stärke der Wechselwirkung von Coaktivator-Kennmotiven mit NRs variiert abhängig von der genauen Motivsequenz
Die Wechselwirkung zwischen der ERα LBD und einer Reihe von unterschiedlichen LXXLL Motiv-Fusionsproteinen schien unterschiedliche Reportergen-Aktivität zu ergeben, was andeutet, dass die ERα LBD mit den LXXLL Motiven mit unterschiedlichen Aktivitäten wechselwirkt (siehe Beispiel 5), daher wurde die Stärke dieser Wechselwirkungen näher untersucht. Die Motive von SRC-1a wurden auf ihre relativen Wechselwirkungsspezifitäten mit dem Glucocorticoidrezeptor und Östrogenrezeptor-Isoformen α und β in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay getestet.
Die SRC-1a Motive 1-4 (SEQ ID 73-76) wurden als Fusionsproteine mit der LexA DNA-Bindungsdomäne exprimiert. Motivfusionsproteine wurden durch Ligation von angelagerten Oligonukleotidpaaren im Leseraster in den vom ADH Promotor getriebenen LexA DBD Vektor YCpl4-ADH-LexA erzeugt. YCpl4-ADH1-LexA ist ein Plasmid aus dem LexA unter der Kontrolle des S. cerevisiae ADH1-Promotors exprimiert wird. Das Rückgrat dieses Vektors ist das Plasmid RS314 (Sikorski und Hieter, 1989). Zwischen den SacI- und KpnI-Restriktionsenzymstellen im Polylinker dieses Vektors haben wir eine Expressionskassette gesetzt, die den Promotor des S. cerevisiae ADH1 Gens, den codierenden Bereich des E. coli LexA Gens und den Transkriptionsterminationsbereich des S. cerevisiae ADH1 Gens umfasst. Der Promotorbereich von ADH1 besteht aus einem 1,4 kb BamHI-HindIII-Fragment aus dem Plasmid pADNS (Colicelli et al, 1989). Nach der HindIII-Stelle liegt der codierende Bereich (Aminosäuren 1-202) von E. coli LexA (Horii et al, 1981; Miki et al, 1981; Markham et al, 1981). Das E. coli LexA Fragment wurde als ein HindIII-PstI-Fragment aus dem Plasmid pBXL1 (Martin et al, 1990) erhalten. Diese Sequenz entspricht den Nukleotiden 95-710 des Genbankeintrags g146607. Nach dieser Sequenz liegt ein Bereich, der einen Polylinker (SEQ ID 77)
GAATTCCTGCAGCCCGGGGTCGACACTAGTTAACTAGCGGCCGC codiert.
Dieser Polylinker fügt die Aminosäuren EFLQPGVDTS (SEQ ID NR: 80) an den Carboxyterminus von LexA an. Die NotI-Stelle am Ende dieses Linkers ist mit einem DNA Fragment verknüpft, das den Transkriptionsterminations-bereich des S. cerevisiae ADH1 Gens einschließt. Dieses Fragment ist das 0,6 kb NotI-BamHI aus dem Plasmid pADNS (Colicelli et al, 1989).
Die NR LBDs wurden als Fusionen mit der Gal4 transkriptionellen AD exprimiert. Die LBD Fusionen wurden durch Clonieren eines die Aminosäuren, die den LBDs entsprechen, codierenden PCR Fragmentes in YCpl5Gal1-r11. YCpl5Gal1-r11 ist ein Plasmid aus dem Fusionen des Aktivierungsbereichs des S. cerevisiae Gal4 Proteins unter der Kontrolle des S. cerevisiae GAL1 Promotors exprimiert werden können. Das Rückgrat dieses Vektors ist das Plasmid RS315 (Sikorski und Hieter, 1989). Zwischen den SacI- und KpnI-Restriktionsenzymstellen im Polylinker dieses Vektors haben wir eine Expressionskassette gesetzt, welche den Promotor des S. cerevisiae GAL1 Gens, den codierenden Bereich des Fusionsproteins und den Transkriptionsterminationsbereich des S. cerevisiae ADH1 Gens umfasst. Der GAL1 Promotor (Johnson und Davis, 1984; Yocum et al, 1984; West et al, 1984) wurde durch Amplifizierung eines genomischen Fragments von S. cerevisiae durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten. Dieses Fragment entspricht Nukleotiden 177 bis 809 des Genbank Datenbankeintrags g171546. Dieser wird von der Sequenz
AAGCTTCCACCATGGTGCCAAAGAAGAAACGTAAAGTT (SEQ ID 78) gefolgt.
Diese Sequenz stellt ein Translationsinitiationscodon und eine Sequenz bereit, welche die Aminosäuren MVPKKKRKV (SEQ ID NR: 81) codiert. Die letzten sieben Reste dieses Peptids entsprechen einem Bereich, der als nukleäres Lokalisationssignal im SV40 T-Antigen (Aminosäuren 126-132 von Genbankeintrag 8310678; Fiers et al, 1978; Reddy et al, 1978) identifiziert wurde. Dieser Bereich ist mit einer Sequenz verknüpft, welche den Bereich II der Transkriptionsaktivierungsdomäne (Aminosäuren 768- 881) von Gal4 codiert, wie durch Ma und Ptashne (1987) definiert. Die Sequenz wurde durch PCR aus dem Plasmid pBXGalII (P. Broad unveröffentlicht) isoliert, welche eine Säugetierversion des Hefe-Expressionsvektors pMA236 (Ma and Ptashne, 1987) ist und den Nukleotiden 2744 bis 3085 des Genbankeintrags g171557 (Laughon und Gesteland (1984) entspricht. Diese Sequenz wird vom Polylinker
TCTAGACTGCAGACTAGTAGATCTCCCGGGGCGGCCGC (SEQ ID 79) gefolgt.
Alle Fusionskonstrukte wurden vollständig sequenziert. Die Vektoren YCpl4-ADH-lexA und YCpl5Gal1-r1 replizieren als Einzelkopieplasmide in Hefe (ARS-CEN) und weisen TRIP1 beziehungsweise LEU2 Marker auf.
Der S. cerevisiae Stamm MEY132 (M. Egerton, Zeneca Pharmaceuticals, unveröffentlicht, Genotyp (Mata leu2-3, 112 ura3-52 trp1 his4 rme1) wurde als Wirtsstamm eingesetzt. Ein Reportergen, bestehend aus dem E. coli lacZ (β-Galactosidase)-Gen unter der Kontrolle eines zwei Bindungsstellen für das lexA Protein enthaltenden Promotors wurde am ura3 Locus dieses Stammes eingebaut. Das Reportergenplasmid, JP159-lexRE wurde unter Verwendung des Plasmids JP159 als Rückgrat (J. Pearlberg, Doktorarbeit (1994) Harvard Universität) konstruiert. Dies ist ein bifunktioneller Vektor, der die S. cerevisiae URA3 als Marker enthält. Das Plasmid enthält das E.coli β-Galactosidase-Gen unter der Kontrolle eines Minimalpromotors, welcher die TATA Box und eine Transkriptionsinitiationsstelle aus dem S. cerevisiae GAL1 Promotor (Dixon et al. 1997) enthält.
Stromaufwärts von diesem Promotor ist ein Terminator des GAL11 Gens. Zwischen den XbaI- und SalI-Stellen im Promotor dieses Plasmids liegt eine Sequenz von 35 Nukleotiden, die einer natürlich vorkommenden Bindungsstelle für das LexA Protein im Promotor des Colicin E1 Gens entspricht (Ebina et al, 1983) (die Sequenz entspricht den Resten 20-54 des Genbankeintrags g144345). Diese Sequenz enthält zwei LexA Operatoren und wird deshalb als "2lex" bezeichnet. Dieses Reporterplasmid wurde innerhalb des URA3 Gens linearisiert und in den ura3 Locus von MEY132 integriert, um den Hefestamm MEY132-lexRE zu ergeben.
Transformanten, die die Zwei-Hybrid-Fusionskonstrukte enthalten, wurden bis zur späten logarithmischen Wachstumsphase in 20 ml Selektionsmedium wachsen gelassen (2% Glucose und angemessene Zusatzstoffe). Sie wurden dann in 2% Galactose enthaltendes Medium, in der Gegenwart oder Abwesenheit von Ligand verdünnt. Als Kontrollen wurde jede LBD Fusion mit der LexA DBD, welcher die Coaktivatormotive fehlen, coexprimiert und in ähnlicher Weise wurde jede Motiv-LexA-DBD-Fusion mit der Gal4 AD, welcher die NR LBD fehlt, coexprimiert.
Die relativen Expressionshöhen von DBD-Fusionsproteinen wurden durch Immunnachweis unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der LexA erkennt, bestimmt.
Die relativen Wechselwirkungsspezifitäten der Östrogenrezeptor-Isoformen α und β für die 4 Motive von SRC-1a wurden wie folgt eingeordnet, 2 > 4 > 1 > 3 (siehe 5). Glucocorticoidrezeptor-Spezifitäten sind wie folgt 4 > 1 = 2 = 3.
Das in diesem Beispiel verwendete Hefe-2-Hybrid-System nutzt ein integriertes Einzelkopie-Reportergenkonstrukt. Dieses ermöglicht einen quantitativen Vergleich zwischen den unterschiedlichen Hefestämmen, die unterschiedliche SRC1a Motive tragen.
Die in 5 präsentierten Daten legen nahe, dass Motiv 3 (SRC1a, 748-753) unter Verwendung dieses Systems sehr schwach mit ER wechselwirkt. Längeres Aussetzen gegenüber Östradiol (nicht gezeigt) deckt jedoch eine wesentliche Wechselwirkung auf. Es wird darauf hingewiesen, dass 1A hierin deutlich eine Wechselwirkung zwischen Motiv 3 und ER zeigt, aber diese Wechselwirkung ist wesentlich schwächer als die, welche man mit den anderen Motiven sah. Alle Unterschiede in dieser Hinsicht zwischen 5 und 1A durch Eigenschaften des experimentellen Aufbaus erklärt werden können. Beispielsweise waren die Vektoren, die verwendet wurden um die 5 Daten zu erzeugen, (Centromer enthaltende) Vektoren mit niedriger Kopienzahl, während die Vektoren, die verwendet wurden, um die 1A Daten zu erzeugen, (2μ) Vektoren mit hoher Kopienzahl waren.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Inhibitorverbindungen, die zur Verringerung der Wechselwirkung zwischen: a) einem ersten Bereich, bei dem es sich um ein Kennmotiv auf einem nukleären Protein handelt, und b) einem zweiten Bereich, bei dem es sich um denjenigen Teil eines nukleären Rezeptors handelt, der zur Wechselwirkung mit dem nukleären Protein über die Bindung an das Kennmotiv fähig ist, in der Lage ist, wobei es sich bei dem nukleären Protein um einen Brückenfaktor handelt, der für die Wechselwirkung zwischen einem mit einem Liganden versehenen nukleären Rezeptor und einem Transkriptionsinitiations-Komplex, der an der Steuerung der Genexpression beteiligt ist, verantwortlich ist; dem nukleären Rezeptor um einen Transkriptionsfaktor handelt; dem Kennmotiv um B¹XXLL handelt, worin B¹ für eine beliebige natürliche hydrophobe Aminosäure, L für Leucin und X jeweils unabhängig für eine beliebige natürliche Aminosäure, die das entscheidende Strukturelement eines als Teil des Vorgangs der Aktivierung oder Repression von Zielgenen an einen mit einem Liganden versehenen nukleären Rezeptor bindenden nukleären Proteins darstellt, steht; und wobei man in dem Verfahren: i) die potentielle Inhibitorverbindung, ii) den mit einem Liganden versehenen nukleären Rezeptor oder ein Fragment davon, wobei das Fragment den zweiten Bereich mit der in diesem Anspruch oben unter b) angegebenen Bedeutung umfaßt, iii) ein ein Kennmotiv des nukleären Proteins umfassendes Fragment mit der Maßgabe, daß dabei ein Fragment, das mindestens die Reste 624-1131 von TIF-2 enthält, ausgeschlossen ist, nimmt und iv) das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Hemmung der Wechselwirkung zwischen ii) und iii) nachweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Fragment des nukleären Proteins nur ein Kennmotiv umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei B¹ um Leucin oder Valin handelt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei es sich bei B¹ um Leucin handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das Kennmotiv ferner als B²B¹XXLL definiert ist, wobei es sich bei B² um eine hydrophobe Aminosäure handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei B² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin und Valin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei es sich bei dem nukleären Protein um einen Coaktivator handelt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Coaktivator ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RIP 140, SRC-1, TIF2, CBP, p300, TIF1, Trip1, Trip2, Trip3, Trip4, Trip5, Trip8, Trip9, p/CIP, ARA70 & Trip230.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei es sich bei dem Transkriptionsfaktor um einen Steroidhormonrezeptor handelt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Steroidhormonrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Östrogenrezeptor, Progesteronrezeptor, Androgenrezeptor und Glucocorticoidrezeptor.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Steroidhormonrezeptor um Östrogenrezeptor handelt.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Verfahren die Form eines 2-Hybrid-Assay-Systems hat.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei es sich bei dem potentiellen Inhibitor um ein Mitglied einer auf einem Kennmotiv mit der in einem der Ansprüche 2-6 angegebenen Bedeutung beruhenden Peptidbibliothek handelt.
Peptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PQAQQKSLLQQLLT (SEQ ID NO: 2), KLVQLLTTT (SEQ ID NO: 3), ILHRLLQE (SEQ ID NO: 4) und LLQQLLTE (SEQ ID NO: 5).
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid mit der in Anspruch 14 angegebenen Bedeutung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungs- oder Trägermittel umfaßt.